龔美玲,劉洋銓,葉亞瓊,趙海全,張 暉,2

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 528225 ; 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江西 南昌 330045)

動(dòng)物機(jī)體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)、肽類激素和細(xì)胞因子相互作用,共同調(diào)節(jié)和維持機(jī)體的正常生理功能。胸腺器官在神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)中具有重要的地位[1]。胸腺中含有大量的淋巴細(xì)胞,但同時(shí)也有少量的上皮網(wǎng)狀細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞。因此,胸腺既是重要的中樞免疫器官,又是神經(jīng)內(nèi)分泌器官[2]。胸腺作為培育和選擇T細(xì)胞的場(chǎng)所,未成熟的T細(xì)胞在多種趨化因子的作用下進(jìn)入胸腺后,胸腺通過(guò)其內(nèi)分泌細(xì)胞分泌多種激素和神經(jīng)肽,包括胸腺素、胸腺生成素和血管活性腸肽等,誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成熟,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[3]。先前的研究認(rèn)為,哺乳動(dòng)物胸腺的內(nèi)分泌功能主要由上皮網(wǎng)狀細(xì)胞完成[4]。然而,有研究在人類胎兒胸腺中檢測(cè)到嗜鉻粒蛋白A(Chromogranin A,CGA)陽(yáng)性細(xì)胞,并證實(shí)其具有內(nèi)分泌功能,該研究表明,胎兒胸腺存在胺前體攝取脫羧化(Amine precursor uptake and decarboxylation,APUD)細(xì)胞,且該細(xì)胞可分泌多種垂體激素和神經(jīng)肽[5]。APUD細(xì)胞能夠攝取胺前體,進(jìn)行脫羧而產(chǎn)生肽類或活性胺。因此,APUD細(xì)胞也屬于內(nèi)分泌細(xì)胞。目前,已有研究先后在蛙、蛇、鵝和雞等非哺乳動(dòng)物胸腺中觀察到APUD細(xì)胞,并證實(shí)APUD細(xì)胞能分泌多種激素和神經(jīng)肽[6,7]。有關(guān)動(dòng)物胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞形態(tài)和分類的研究通常使用普通光學(xué)顯微鏡和免疫組織化學(xué)方法,有關(guān)胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的研究較少,雞胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞的類型、數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步闡明。

余干烏骨雞是江西省特色藥用型品種,其體內(nèi)富含大量黑色素,其羽毛是扁平黑色,不同于泰和烏骨雞的白色絲羽。余干烏骨雞具有極高的藥用價(jià)值和保健價(jià)值。一般認(rèn)為,烏骨雞黑色素含量越高,其藥用價(jià)值和保健價(jià)值越高[8]。烏骨雞黑色素富集多種微量元素,這些元素可以直接參與機(jī)體的細(xì)胞免疫,并且可作為三大物質(zhì)代謝途徑中關(guān)鍵酶的激活劑、輔酶和參與一些維生素的合成[9]。烏骨雞還常用于需要補(bǔ)充鐵元素的病人和特殊人群的功能和營(yíng)養(yǎng)食品[10]。目前,有關(guān)余干烏骨雞的研究多見(jiàn)于經(jīng)濟(jì)性狀、養(yǎng)殖技術(shù)和疾病防控,其器官組織結(jié)構(gòu)方面的研究甚少。胸腺是動(dòng)物重要的免疫器官。胸腺結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型的闡明,對(duì)于研究禽類免疫機(jī)理具有重要的意義。本試驗(yàn)應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù),根據(jù)內(nèi)分泌細(xì)胞的顆粒參數(shù)和結(jié)構(gòu)特征,試圖闡明余干烏骨雞胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞類型。本試驗(yàn)結(jié)果將豐實(shí)我國(guó)特色家禽的組織學(xué)內(nèi)容,同時(shí)也為實(shí)際生產(chǎn)中余干烏骨雞疫苗創(chuàng)制和臨床疾病防控等提供基礎(chǔ)理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和組織處理 余干烏骨雞取自江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院余干烏骨雞選育課題組,公、母各2只。適應(yīng)飼養(yǎng)24 h后,頸動(dòng)脈放血處死,剖開(kāi)脖頸,迅速摘取胸腺,剝除胸腺外結(jié)締組織,用刀片將胸腺切成小塊,一部分置于新配置預(yù)冷的Bouin氏固定液中固定24 h,用于石蠟包埋和普通光學(xué)顯微鏡觀察;另一部分胸腺組織塊放于2.5%戊二醛/PBS中4 ℃固定24 h,用于透射電子顯微鏡觀察。

1.2 主要試劑 蘇木精染色液和伊紅染色液,均購(gòu)自湖南比克曼生物科技有限公司;多聚甲醛,購(gòu)自上海多沃生物客機(jī)有限公司;酒精,購(gòu)自深圳可孚生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 生物組織包埋機(jī)(YD-6D),金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠;UC7超薄切片機(jī)(RM2245),德國(guó) Leica;電熱恒溫干燥箱(GZX-DH.500BS),上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;生物顯微鏡(BM 2000),南京江南永新光學(xué)有限公司;透射電子顯微鏡(H-600),日本HITACHI。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 石蠟切片制作和光學(xué)顯微鏡觀察 取出經(jīng)Bouin氏固定液固定的胸腺組織塊,沖洗固定液,梯度濃度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟透蠟,組織包埋。取石蠟包埋后的胸腺樣品,在切片機(jī)上切成5 μm切片,載玻片撈片后晾干。胸腺切片二甲苯脫蠟后,下行梯度濃度乙醇復(fù)水,蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色,蓋玻片封片,生物顯微鏡觀察,Scope Image 9.0(H3D)軟件獲取顯微照片。

1.4.2 透射電子顯微鏡觀察 取經(jīng)戊二醛/PBS固定的胸腺組織,用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)洗滌3次。將樣品在1%OsO4中再固定2 h,在0.1 mol/L PBS中洗滌3次,上行梯度乙醇中脫水,丙酮置換,包埋劑包埋,切片機(jī)切片(60～80 nm),2%醋酸鈾飽和酒精溶液和枸櫞酸鉛雙染色,室溫干燥過(guò)夜。最后,用透射電子顯微鏡觀察并采集圖像。

1.4.3 形態(tài)計(jì)量學(xué)分析 使用開(kāi)放源ImageJ(FiJi)軟件(美國(guó)NIH)測(cè)量?jī)?nèi)分泌細(xì)胞分泌顆粒數(shù)量和直徑。使用Office Excel軟件(美國(guó)微軟)導(dǎo)出數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 胸腺顯微組織結(jié)構(gòu)特征 余干烏骨雞胸腺表面被覆薄層結(jié)締組織(圖1)。胸腺實(shí)質(zhì)主要由外圍淋巴細(xì)胞密集且染色較深的皮質(zhì)和中間染色較淺且內(nèi)部含有胸腺小體的髓質(zhì)構(gòu)成(圖1A)。胸腺小體呈橢圓形,細(xì)胞密度低,不含淋巴細(xì)胞,主要有少量上皮細(xì)胞構(gòu)成,有些細(xì)胞胞質(zhì)嗜酸性強(qiáng),呈深紅色(圖1B)。在胸腺中可觀察到散在分布的黑色素,主要分布于皮質(zhì),髓質(zhì)分布較少(圖1)。

圖1 余干烏骨雞胸腺顯微組織結(jié)構(gòu)觀察(H.E.染色,A:100×;B:400×)Fig.1 Microscopic observation of thymus tissue structure in Yugan black-bone fowl (H.E. staining,A:100×;B:400×)A:胸腺; B:胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)[C:皮質(zhì); M:髓質(zhì);黃色虛線:皮質(zhì)和髓質(zhì)的界線; HC:胸腺小體(紅色虛線框);箭頭:黑色素]A:Thymus; B:Thymic cortex and medulla [C:Cortex; M:Medulla; Yellow dotted line:Boundary between cortex and medulla; HC:Hassall corpuscle (Red dotted box); Arrow:Melanin]

2.2 胸腺超微組織結(jié)構(gòu)特征 余干烏骨雞胸腺中細(xì)胞密集,存在多種細(xì)胞型,包括淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞(圖2)。淋巴細(xì)胞密集,數(shù)量最多,呈圓形,體積較小,細(xì)胞核不規(guī)則,占據(jù)胞體大部分,胞質(zhì)較少(圖2A)。上皮網(wǎng)狀細(xì)胞位于淋巴細(xì)胞之間的間隙中,形態(tài)不規(guī)則,多突起,細(xì)胞核多邊型,體積較大(圖2A)。黑色素細(xì)胞位于淋巴細(xì)胞或上皮網(wǎng)狀細(xì)胞之間,細(xì)胞呈長(zhǎng)條形,胞質(zhì)內(nèi)還有數(shù)量較多的電子致密的卵圓形黑素體,直徑介于319～1 702 nm,每個(gè)黑色素細(xì)胞內(nèi)平均擁有39個(gè)黑素體(圖2B)。

圖2 余干烏骨雞胸腺超微組織結(jié)構(gòu)觀察Fig.2 Ultrastructural observation of thymus tissue structure in Yugan black-bone fowlA:胸腺實(shí)質(zhì); B:胸腺皮質(zhì)(RC:網(wǎng)狀細(xì)胞; EC:內(nèi)分泌細(xì)胞; LC:淋巴細(xì)胞; MC:黑色素細(xì)胞; M:黑素體)A:Thymic parenchyma; B:Thymic cortex (RC:Reticular cell; EC:Endocrine cell; LC:Lymphocyte; MC:Melanocyte; M:Melanosome)

2.3 胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞的類型和結(jié)構(gòu)特征 余干烏骨雞胸腺中內(nèi)分泌細(xì)胞較多,呈圓形、橢圓或不規(guī)則形狀,胞質(zhì)內(nèi)含有形態(tài)、大小和電子密度均不相同的內(nèi)分泌顆粒(圖3)。根據(jù)分泌顆粒的形態(tài)、大小和電子密度以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn),可以區(qū)分出4種不同類型的內(nèi)分泌細(xì)胞(表1)。4種內(nèi)分泌細(xì)胞密切接觸且集中分布。Ⅰ型內(nèi)分泌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)分泌顆粒多呈規(guī)整的圓形,電子密度高,大小不等,直徑介于400～770 nm(圖3A)。Ⅱ型內(nèi)分泌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)分泌顆粒形態(tài)差異較大,多呈卵圓形,少數(shù)呈兩端粗大、中間細(xì)長(zhǎng)的啞鈴型,電子密度高,直徑介于265～1 320 nm(圖3B)。Ⅲ型內(nèi)分泌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)分泌顆粒呈圓形或卵圓形,中等電子密度,也有顆粒呈電子疏松的囊泡狀,直徑介于180～340 nm(圖3C)。這3種細(xì)胞形態(tài)均為圓形或卵圓形。Ⅳ型內(nèi)分泌細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,有胞質(zhì)突起,胞質(zhì)內(nèi)分泌顆粒呈圓形或卵圓形,顆粒類脂型或黏液型,電子密度低,直徑介于510～1 280 nm(圖3D)。

表1 4種胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞及其分泌顆粒的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of four types of thymic endocrine cells and their secretory granules

圖3 余干烏骨雞胸腺4種內(nèi)分泌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征Fig.3 Ultrastructural characteristics of four types of endocrine cells in the thymus of Yugan black-bone fowlA:Ⅰ型內(nèi)分泌細(xì)胞; B:Ⅱ型內(nèi)分泌細(xì)胞; C:Ⅲ型內(nèi)分泌細(xì)胞; D:Ⅳ型內(nèi)分泌細(xì)胞(N:細(xì)胞核; G1:Ⅰ型內(nèi)分泌顆粒; G2:Ⅱ型內(nèi)分泌顆粒; G3:Ⅲ型內(nèi)分泌顆粒; G4:Ⅳ型內(nèi)分泌顆粒)A:Type Ⅰ endocrine cells; B:Type Ⅱ endocrine cells; C:Type Ⅲ endocrine cells; D:Type Ⅳ endocrine cells (N:Cell nucleus; G1:Type Ⅰ endocrine granule; G2:Type Ⅱ endocrine granule; G3:Type Ⅲ endocrine granule; G4:Type Ⅳ endocrine granule)

3 討論

動(dòng)物胸腺的主要功能是培養(yǎng)和選擇T細(xì)胞,但其也能分泌多種激素或因子,包括胸腺素、胸腺生成素、胸腺體液因子和血清胸腺因子等,且胸腺的功能受到這些激素或因子的調(diào)控[11]。研究表明,在哺乳動(dòng)物中胸腺的內(nèi)分泌功能主要由上皮網(wǎng)狀細(xì)胞完成,但在非哺乳動(dòng)物中似乎并非如此。Cao等的研究顯示,胸腺內(nèi)含有多種細(xì)胞類型,包含淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肥大細(xì)胞[12]。李丕鵬等通過(guò)免疫組化染色和透射電子顯微鏡觀察到蛇的胸腺中存在內(nèi)分泌細(xì)胞,并能夠分泌激素[7]。此外,李丕鵬對(duì)魚、大鯢、蟾蜍、蛙、鳥(niǎo)類和鼠類等11種動(dòng)物的胸腺和其他免疫器官進(jìn)行了特殊組織化學(xué)染色和免疫組化染色研究,結(jié)果顯示,胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞從兩棲類動(dòng)物開(kāi)始出現(xiàn),到爬行類動(dòng)物數(shù)量達(dá)到高峰,隨后在鳥(niǎo)類又有所下降,到哺乳類動(dòng)物則消失[13]。Mishra等的研究表明,雞胸腺中常駐內(nèi)分泌細(xì)胞群在細(xì)胞化學(xué)上至少有3種不同的細(xì)胞群,即親銀細(xì)胞、嗜銀細(xì)胞和APUD細(xì)胞[14]。由此推斷,非哺乳動(dòng)物中胸腺的內(nèi)分泌任務(wù)不單由上皮網(wǎng)狀細(xì)胞完成,還有內(nèi)分泌細(xì)胞的參與。

構(gòu)成機(jī)體內(nèi)分泌細(xì)胞的最重要群體是APUD細(xì)胞。APUD細(xì)胞是一種能分泌胺和多肽類激素的內(nèi)分泌細(xì)胞,與具有內(nèi)分泌功能的神經(jīng)細(xì)胞一起組成彌漫性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)(Diffuse neuroendocrine system,DNES)[15]。APUD細(xì)胞作為內(nèi)分泌細(xì)胞的一員,遍布全身各處,目前已發(fā)現(xiàn)50余種,以腦和胃腸道最多,此外肺臟、呼吸道、泌尿道和生殖道等部位均有很多的APUD細(xì)胞存在[16,17],并且APUD細(xì)胞可分泌多種激素,其中腸道APUD細(xì)胞可分泌胃泌素、腦啡肽、生長(zhǎng)抑素、血管活性腸肽、腸促胰酶素、腸高血糖素和神經(jīng)降壓素等激素以維持腸道的功能[18-20]。APUD細(xì)胞種類眾多,主要通過(guò)分泌顆粒的數(shù)量、大小、形狀、粒芯的致密度和寬度來(lái)判斷和鑒別APUD細(xì)胞類型,分泌顆粒也是APUD細(xì)胞最具特征性的超微結(jié)構(gòu)[7]。胸腺APUD細(xì)胞的特征是擁有致密的分泌顆粒,顆粒形態(tài)和腎上腺素能神經(jīng)末梢內(nèi)顆粒相似,多呈圓形或長(zhǎng)橢圓形,也有少部分呈不規(guī)則形。根據(jù)本試驗(yàn)在透射電子顯微鏡觀察到的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn),推測(cè)余干烏骨雞胸腺中的內(nèi)分泌細(xì)胞應(yīng)為APUD細(xì)胞。

本試驗(yàn)通過(guò)透射電子顯微鏡在余干烏骨雞胸腺內(nèi)觀察到4種類型的內(nèi)分泌細(xì)胞,其中Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型細(xì)胞數(shù)量較多,細(xì)胞形態(tài)為圓形和橢圓形,而Ⅳ型細(xì)胞數(shù)量較少,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。Oubre等運(yùn)用免疫組化方法鑒定雞胸腺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞形態(tài)以圓形和卵圓形居多,還有小部分有明顯延展性的細(xì)胞[21]。該結(jié)果與本試驗(yàn)通過(guò)透射電子顯微鏡觀察到的結(jié)果相符。方會(huì)娟等通過(guò)透射電子顯微鏡觀察到分布于胸腺髓質(zhì)的內(nèi)分泌細(xì)胞與周圍胸腺細(xì)胞緊密接觸,并推測(cè)內(nèi)分泌細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞表面黏附分子直接與胸腺細(xì)胞產(chǎn)生相互作用,或分泌某些肽類物質(zhì)以旁分泌的形式參與調(diào)控胸腺細(xì)胞的分化和成熟[5]。本試驗(yàn)觀察到的4種內(nèi)分泌細(xì)胞同樣與周圍胸腺細(xì)胞緊密接觸。李玉谷等[6]通過(guò)透射電子顯微鏡在粵黃雞胸腺中發(fā)現(xiàn)3種形態(tài)不同的內(nèi)分泌細(xì)胞,而本試驗(yàn)在余干烏骨雞中發(fā)現(xiàn)了4種,且2個(gè)品種雞的內(nèi)分泌細(xì)胞形態(tài)有明顯的不同。余干烏骨雞胸腺中的內(nèi)分泌細(xì)胞分泌顆粒直徑較粵黃雞的更長(zhǎng)。余干烏骨雞Ⅰ型內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的顆粒在超微結(jié)構(gòu)和電子密度上與分泌激素的顆粒類似,因此,推測(cè)Ⅰ型內(nèi)分泌細(xì)胞可能通過(guò)其分泌顆粒釋放激素。Ⅱ型內(nèi)分泌細(xì)胞可觀察到兩端粗大、中間細(xì)長(zhǎng)的啞鈴型顆粒,在之前的胸腺內(nèi)分泌研究中未觀察到這種特殊形態(tài)的分泌顆粒。Ⅱ型內(nèi)分泌細(xì)胞雖然在形態(tài)上與一般細(xì)胞有差異,但其電子密度與Ⅰ型內(nèi)分泌細(xì)胞類似,因此,推測(cè)Ⅱ型內(nèi)分泌細(xì)胞可能分泌與Ⅰ型內(nèi)分泌細(xì)胞不同的激素。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),Ⅲ型內(nèi)分泌細(xì)胞與Ⅰ型和Ⅱ型內(nèi)分泌細(xì)胞的形態(tài)相似,但分泌顆粒較小且電子密度較低,推測(cè)Ⅲ型細(xì)胞可能為已完成分泌任務(wù)的內(nèi)分泌細(xì)胞。余干烏骨雞Ⅳ型內(nèi)分泌細(xì)胞分泌顆粒呈圓形或卵圓形,淺灰色,顆粒類脂型或黏液型,胞質(zhì)不規(guī)則,有明顯的延伸性,而嶺南黃雞胸腺中未觀察到這種類型的細(xì)胞[6]?；冖粜蛢?nèi)分泌細(xì)胞分泌顆粒的電子密度比其他3種類型細(xì)胞小,呈類脂狀或黏液型,推測(cè)其功能為分泌脂溶性激素或分泌黏液。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明,內(nèi)分泌細(xì)胞分泌顆粒的形態(tài)特征不僅與動(dòng)物的物種有關(guān),同一物種不同品種的內(nèi)分泌細(xì)胞分泌顆粒形態(tài)也可能不同。本試驗(yàn)根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和分泌顆粒的異質(zhì)性,發(fā)現(xiàn)余干烏骨雞胸腺含有4種類型的內(nèi)分泌細(xì)胞。