劉 珊,賈 君,高艷霞,吳園園,劉榮娜,程立立,吳小華*

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第980醫(yī)院 a.生殖醫(yī)學(xué)科;b.婦科,石家莊 050000;2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,石家莊 050051;3.石家莊市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,石家莊 050000)

近年來(lái),據(jù)調(diào)查顯示我國(guó)不孕不育發(fā)生率從12%升到18%,人口出生率越來(lái)越低,因此越來(lái)越多的生育問(wèn)題亟需解決[1]。目前體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)及其衍生技術(shù)已成為治療不孕癥患者最常用的一種助孕方式[2]。隨著輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)水平的不斷提高,IVF-ET的妊娠率越來(lái)越高,累積妊娠率可高達(dá)70%,但仍有一部分患者經(jīng)歷著反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure,RIF)。對(duì)于RIF,目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。2021年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會(huì)(European Society of Human Reproductionand Embryology,ESHRE)一項(xiàng)關(guān)于RIF的國(guó)際調(diào)查表示,大多數(shù)臨床醫(yī)生和胚胎學(xué)家將經(jīng)歷3個(gè)新鮮或凍融移植周期,移植至少4枚優(yōu)質(zhì)胚胎后未實(shí)現(xiàn)臨床妊娠定義為RIF[3]。胚胎種植的兩大關(guān)鍵因素是胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性[4]。RIF患者通常具有高質(zhì)量的胚胎,可能因其子宮內(nèi)膜容受性差導(dǎo)致胚胎種植失敗。因此尋找改善子宮內(nèi)膜容受性的方法成為提高RIF妊娠率的關(guān)鍵所在。外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)是由B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞組成的復(fù)合細(xì)胞[5]。子宮內(nèi)膜中的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及參與適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,為胚胎著床提供獨(dú)特的內(nèi)分泌-免疫微環(huán)境,對(duì)胚胎種植起到促進(jìn)作用[6]。Yoshioka等[7]采用宮腔灌注自體PBMCs的方法顯著提高了RIF 患者 IVF-ET 助孕的臨床妊娠率和胚胎種植率。但其具體機(jī)制尚不清楚,最佳灌注時(shí)間不明確。文獻(xiàn)報(bào)道行宮腔灌注自體PBMCs時(shí)間不一致,移植前72h行宮腔灌注[8-9],移植前48h時(shí)行宮腔灌注[10],移植前24h行宮腔灌注[11-13]。本研究通過(guò)確定胚胎移植前宮腔灌注PBMCs的有效性及最佳宮腔灌注時(shí)間,以最少的宮腔操作、最佳的時(shí)間行宮腔灌注PBMCs達(dá)到最高的妊娠率,進(jìn)一步解決臨床中發(fā)生RIF的難題,解決不孕患者的生育問(wèn)題。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2021年6月至2022年12月在中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第980醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科就診的RIF患者195例。納入標(biāo)準(zhǔn):符合RIF診斷標(biāo)準(zhǔn);年齡≤40歲;血清卵泡刺激素(FSH)<15U/L;至少凍存1個(gè)凍胚(囊胚或者卵裂胚),并且其中至少有一個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎;移植日內(nèi)膜厚度≧8mm;夫婦雙方染色體核型無(wú)異常;患者自愿參與研究并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):單側(cè)或雙側(cè)輸卵管積水,宮腔積液者;合并子宮畸形、子宮器質(zhì)性病變者;合并子宮內(nèi)膜炎者;合并子宮內(nèi)膜結(jié)核或子宮內(nèi)膜異位癥者?；颊吒鶕?jù)是否行宮腔灌注治療分為觀察組(105例)和對(duì)照組(90例),觀察組根據(jù)胚胎移植前宮腔灌注時(shí)間不同分為3組,胚胎移植前72h宮腔灌注PBMCs為Ⅰ組(35例),胚胎移植前48h宮腔灌注PBMCs為Ⅱ組(37例),胚胎移植前24h宮腔灌注PBMCs為Ⅲ組(33例)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者知情同意。

1.2 治療方案

1.2.1 內(nèi)膜準(zhǔn)備 月經(jīng)周期規(guī)律的患者選擇自然排卵后行FET術(shù),從月經(jīng)第8～10日開(kāi)始監(jiān)測(cè)卵泡和內(nèi)膜,當(dāng)卵泡直徑≥18mm或促黃體生成素(LH)>20mU/mL時(shí),應(yīng)用人β絨毛膜促性腺激素(β-HCG,2000U/支,珠海麗珠制藥) 6000U誘導(dǎo)排卵,并行內(nèi)膜轉(zhuǎn)換,排卵后第3日或第5日行FET術(shù),常規(guī)行黃體支持。月經(jīng)周期不規(guī)律患者均行激素替代周期FET術(shù),患者從月經(jīng)來(lái)潮第2日或3日起給予戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂(lè),1mg/粒,廣州拜耳) 每次1mg,每日2次口服,每4日增加戊酸雌二醇片2mg直至最大劑量12mg /d,待子宮內(nèi)膜厚度≥8mm 時(shí)給予內(nèi)膜轉(zhuǎn)化,同時(shí)檢測(cè)血雌激素(E2)和孕酮(P)水平,內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第3日或第5日予以 FET術(shù),常規(guī)行黃體支持。

1.2.2 自體PBMCs分離制備 抽取患者自體外周血30mL,按1∶2比例加外周血淋巴細(xì)胞分離液(200mL/瓶,TBD)60mL,3000r/min,離心30min,離心管中由上至下細(xì)胞分四層,第二層乳白色液體為淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞層(PBMCs)。收集第二層細(xì)胞沉淀,用生理鹽水洗滌2次,用500～800μL生理鹽水重懸,將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/mL,置于5mL離心管里備用。

1.2.3 自體PBMCs宮腔灌注 觀察組胚胎移植前不同時(shí)間點(diǎn)行自體PBMCs宮腔灌注。宮腔灌注前囑患者排空膀胱并取截石位,用生理鹽水常規(guī)消毒外陰及陰道,用陰道窺器暴露宮頸。用一次性人工授精管連接1mL注射器,抽取已制備好的PBMCs懸液,將人工授精管順著宮頸口進(jìn)入宮腔內(nèi),緩慢向?qū)m腔內(nèi)注射。停留數(shù)秒后取出人工授精管,囑患者平臥休息20～30min。

1.3 宮腔鏡檢查 本中心規(guī)定經(jīng)歷兩次胚胎移植失敗的患者均常規(guī)行宮腔鏡檢查。患者行宮腔鏡檢查提示無(wú)子宮內(nèi)膜炎、黏膜下肌瘤及子宮內(nèi)膜息肉等宮腔病變。

1.4 觀察指標(biāo) 患者的一般情況、胚胎移植情況、臨床妊娠率、胚胎種植率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率。觀察組各亞組間取卵年齡、不孕時(shí)間、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)、移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎類別、移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、臨床妊娠率、胚胎種植率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率。臨床妊娠率=臨床妊娠總數(shù)/移植周期總數(shù)×100% ,胚胎種植率=著床胚胎總數(shù)/胚胎移植總數(shù)×100% ,早期流產(chǎn)率=流產(chǎn)的周期總數(shù)/臨床妊娠周期總數(shù)×100%,活產(chǎn)率=活產(chǎn)總數(shù)/移植周期總數(shù)×100%。移植后第12日或第14日血β-HCG>25mU/mL為生化妊娠,移植后4周超聲下看到孕囊為臨床妊娠,孕12周之前流產(chǎn)記為早期流產(chǎn),異位妊娠計(jì)入流產(chǎn)總數(shù)內(nèi),胎兒平安生產(chǎn)計(jì)入活產(chǎn)總數(shù)內(nèi)。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況 觀察組和對(duì)照組患者的取卵年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH、原發(fā)不孕率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。觀察組分為3個(gè)亞組,各亞組的取卵年齡、不孕年限、BMI及基礎(chǔ)FSH比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。對(duì)照組和觀察組中原發(fā)不孕者分別有52例(57.8%)和56例(53.3%),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組患者中均無(wú)任何不良反應(yīng)發(fā)生。

表1 兩組患者一般情況比較

2.2 患者移植情況 觀察組和對(duì)照組的移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎類別、移植胚胎數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組分為3個(gè)亞組,各亞組移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎類別、移植胚胎數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)相比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者移植情況比較

2.3 患者臨床結(jié)局 對(duì)照組中90例患者行胚胎移植術(shù),26例患者達(dá)到臨床妊娠,其中單胎妊娠20例,雙胎妊娠6例。4例發(fā)生孕早期流產(chǎn),其中1例異位妊娠行腹腔鏡下開(kāi)窗取胚,1例孕5周自然流產(chǎn),2例孕6周因胚胎停育行清宮術(shù)。1例患者孕26周雙胎妊娠流產(chǎn)。觀察組中105例患者行胚胎移植術(shù),47例患者達(dá)臨床妊娠,其中單胎妊娠36例,雙胎妊娠11例。5例患者發(fā)生早期流產(chǎn),其中2例孕6周發(fā)生自然流產(chǎn),2例孕7周因胚胎停育行清宮術(shù),1例因外力發(fā)生流產(chǎn)。2例患者孕中期雙胎妊娠流產(chǎn)。觀察組的臨床妊娠率、胚胎種植率及活產(chǎn)率均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩組的早期流產(chǎn)率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組分為3個(gè)亞組,各亞組的臨床妊娠率、胚胎種植率、早期流產(chǎn)率及活產(chǎn)率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者臨床結(jié)局比較

3 討 論

RIF國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn),目前沿用最多的定義是40歲以下不孕患者至少經(jīng)歷3個(gè)新鮮或解凍移植周期累計(jì)至少4枚優(yōu)質(zhì)胚胎而未能實(shí)現(xiàn)臨床妊娠[14]。RIF的發(fā)生率約高達(dá)10%,不僅給患者帶來(lái)了很大的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),還會(huì)引起一系列社會(huì)問(wèn)題。因此,RIF是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。RIF的病因復(fù)雜,涉及遺傳、內(nèi)分泌、免疫、子宮微環(huán)境及血栓前狀態(tài)等多方面,如何篩查病因、針對(duì)性處理及改善反復(fù)IVF-ET 失敗患者妊娠結(jié)局具有重要的臨床意義[15]。胚胎成功著床是個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,良好的滋養(yǎng)細(xì)胞層細(xì)胞侵襲力、子宮內(nèi)膜容受性及母-胎免疫界面穩(wěn)態(tài)是種植成功的關(guān)鍵[6]。研究顯示,2/3以上的RIF患者胚胎種植失敗與子宮內(nèi)膜容受性異常有關(guān),因此改善子宮內(nèi)膜容受性成為治療RIF的重點(diǎn)[16]。PBMC是圓形單個(gè)核的外周血細(xì)胞的總稱,主要由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞組成,單個(gè)核細(xì)胞在體積、形態(tài)、比重等方面與其他外周血細(xì)胞有明顯差異[17]。研究表明,PBMC可使白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、整合素αvβ3等胚胎種植相關(guān)因子表達(dá)量增加,促進(jìn)胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜,有利于胚胎的種植[18]。宮腔灌注 PBMCs 使得宮腔內(nèi)發(fā)生有利于胚胎侵入的炎癥反應(yīng),其分泌的細(xì)胞因子在胚胎著床、維持妊娠中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19]。有研究認(rèn)為,PBMCs 有助于調(diào)節(jié) Th1/Th2失衡,以Th2型免疫反應(yīng)為主,調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部免疫狀態(tài),改善了子宮內(nèi)膜的容受性,促進(jìn)了胚胎的種植,這在一定程度上提高了RIF患者的胚胎移植成功率[20]。

宮腔灌注是一種臨床中經(jīng)常用的直接作用于子宮內(nèi)膜局部的給藥治療方法,子宮腔屬于半開(kāi)放性質(zhì)的黏膜組織,宮腔灌注不直接進(jìn)入血液循環(huán),而在黏膜系統(tǒng)中進(jìn)行吸收,相對(duì)于靜脈回輸安全性更高。因其更直接、安全、有效且無(wú)創(chuàng)易被患者接受,是目前女性生殖領(lǐng)域臨床研究使用較多的輔助治療手段[21]。本中心既往沿用皮下注射丈夫外周血單個(gè)核細(xì)胞提高RIF患者的妊娠率,此法需多次注射,耗時(shí)長(zhǎng),且存在注射部位疼痛、血源性病毒交叉感染等副作用。本研究改進(jìn)以往方法,在胚胎再次移植前24～72h行宮腔灌注RIF患者自體PBMCs用于改善RIF患者的妊娠結(jié)局,此法操作簡(jiǎn)單,一次完成,安全無(wú)創(chuàng),患者依從性好。結(jié)果發(fā)現(xiàn),宮腔灌注PBMCs后能明顯提高患者的臨床妊娠率和胚胎種植率,早期流產(chǎn)率及活產(chǎn)率無(wú)明顯差異。觀察組各亞組中胚胎移植前48h行宮腔灌注組的臨床妊娠率、胚胎種植率及活產(chǎn)率達(dá)到最高,早期流產(chǎn)率最低,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PBMCs 作為重要的免疫細(xì)胞,其分離后的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等可能改變了宮腔局部免疫環(huán)境,使胚胎種植相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)生改變,這一變化可能在宮腔灌注后48h時(shí)達(dá)到新的平衡并促進(jìn)胚胎黏附、植入并且種植,這需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。 自體PBMCs在分離的技術(shù)操作中可能出現(xiàn)微生物感染,宮腔操作導(dǎo)致患者臨床感染等風(fēng)險(xiǎn)。本研究在分離外周血PBMCs和臨床操作過(guò)程中均嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作,對(duì)使用過(guò)的器皿和注射器均行微生物培養(yǎng),未發(fā)現(xiàn)病菌生長(zhǎng),且本實(shí)驗(yàn)所有患者行自體PBMC灌注治療后無(wú)一例出現(xiàn)感染癥狀。本研究中所有出生活嬰中未發(fā)現(xiàn)該項(xiàng)治療方式對(duì)子代發(fā)育有不良影響。

綜上所述,宮腔灌注藥物已成為治療RIF的一個(gè)新的思路,本研究中自體PBMCs宮腔灌注可改善RIF患者的臨床結(jié)局。但本研究樣本量偏少,還需大樣本、多中心的臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳的灌注時(shí)機(jī)、劑量,治療指征及治療效果還需更多、更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯考右源_定及規(guī)范,PBMC具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入的探討和研究。