張鳳妹,陳丹丹,徐兵勇,梁鍵謀,劉珊,袁利佳

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院,國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥評價關鍵技術重點實驗室&浙江省藥品接觸材料質(zhì)量控制研究重點實驗室,杭州 310052;2.浙江工業(yè)大學,杭州 310014;3.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心,北京 100022)

丁基膠塞是瓶裝藥品密封材料的重要組成部分,但在膠塞加工時會加入一些化學助劑,且需要經(jīng)過硫化過程,會在膠塞本體內(nèi)殘留不參與反應的物質(zhì)等。膠塞在貯存過程中,這些物質(zhì)遷移至膠塞表面,從而影響或者污染藥物[1-2]。有些品種的抗菌藥物注射用粉針制劑貯存過程中,尤其是β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,存在溶液澄清度超標現(xiàn)象,有可能和所用膠塞質(zhì)量有關。因此有必要研究和控制丁基膠塞的質(zhì)量。

注射用頭孢美唑鈉屬于β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,通過無菌分裝制得。膠塞會影響β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物粉針劑的質(zhì)量[3-5],但對頭孢美唑鈉粉針劑質(zhì)量的影響目前未見報道。本文參考相關文獻[6-9],采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜法(GC-MS)全掃描(SCAN)模式對注射用頭孢美唑鈉丁基膠塞中及遷移入藥品粉末中的有機揮發(fā)性成分進行結構鑒定,為進行藥用丁基膠塞與藥物之間的相容性考察奠定一定基礎[10];在有機成分定性分析的基礎上,建立高效液相色譜(high-pressure liquid chromatograph,HPLC)法,對從丁基膠塞遷移入藥品中的揮發(fā)性成分進行定量分析。闡述注射用頭孢美唑鈉包材與藥物之間相容性的物質(zhì)基礎,并初步建立膠塞浸出物的風險控制和評價方法,為注射用頭孢美唑鈉丁基膠塞的選擇、質(zhì)量控制、膠塞配方和工藝改進提供技術支持。

1 GC-MS(SCAN模式)法定性分析丁基膠塞中及遷移入藥品粉末中的有機成分

1.1儀器與試藥 安捷倫8890-5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀,安捷倫7697A 頂空進樣器,軟件版本(Version 10.0.368);深圳華潤九新藥業(yè)有限公司(A)、福建省?？顾帢I(yè)股份有限公司(B)、四川合信藥業(yè)有限責任公司(C)、廣州白云山天心制藥股份有限公司(D)、哈藥集團制藥總廠(E)注射用頭孢美唑鈉樣品及膠塞;4種膠塞華峰(a)、博生(b)、樂清(c)、華仁(d)(其中華峰是覆膜丁基膠塞,其他是丁基膠塞。自行填裝四川合信頭孢美唑鈉),由國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)提供。

1.2方法與結果

1.2.1氣質(zhì)聯(lián)用條件 HP-INNOWax毛細管色譜柱(30.0 mm×0.32 mm,0.5 μm);載氣為He,流速2.0 mL·min-1;進樣口200 ℃;分流比10：1;程序升溫:起始柱溫50 ℃保持5 min,以10 ℃·min-1升至200 ℃,維持5 min。頂空溫度120 ℃;平衡30 min;進樣量1 mL;電子轟擊源(EI),轟擊電壓70 eV,離子源溫度240 ℃,接口溫度260 ℃,質(zhì)量分辨率1 amu,采用全掃描方式,掃描范圍m/z50～600。

1.2.2實驗條件加速試驗樣品:在40 ℃、相對濕度為75%中倒置(膠塞向下放置)3個月。

1.2.3樣品制備 取注射用頭孢美唑鈉的丁基膠塞,剪碎后,取約1.0 g置頂空瓶中;取頭孢美唑鈉粉末約1.0 g置頂空瓶中,頂空進樣測定。

1.2.4測定結果 采用GC-MS法SCAN模式對丁基膠塞中及遷移入藥品粉末中的揮發(fā)性成分進行成分分析,結果見圖1。通過質(zhì)譜庫檢索,鑒定了丁基膠塞和遷移入藥品粉末中的有機成分的結構,丁基膠塞中存在抗氧劑(264及異構體)、硅氧烷類化合物(八甲基環(huán)四硅氧烷、十甲基環(huán)五硅氧烷),發(fā)現(xiàn)存在微量飽和長鏈烷烴類化合物(正十二烷、正十四烷、正十五烷等)。由圖2 GC-MS總離子流中質(zhì)譜峰強度可知,注射用頭孢美唑鈉膠塞中存在遷移物質(zhì)。

A.抗氧劑BHT;B.抗氧劑BHT異構體;C.八甲基環(huán)四硅氧烷。圖1 丁基膠塞和對應藥品粉末中有機成分的MS圖和可能結構 A.antioxygen BHT;B.antioxidant BHT isomer;C.octamethylcyclotetrasiloxane.Fig.1 MS digrams and possible structures of organic components in butyl rubber plugs and correponding drug powders

在GC-MS法對膠塞中及遷移入樣品中有機物成分定性分析的基礎上,確定需要進行定量的成分,考慮到BHT、硫化劑等沸點較高,故參照USP現(xiàn)行版及相關文獻[11-17],采用HPLC法對丁基膠塞及遷移入藥品中的抗氧劑、硫化劑做進一步定量分析。通過對隨機抽取的頭孢美唑鈉膠塞中有機物成分及遷移定量測定,為進而開展藥品包材和藥物之間相容性研究奠定了一定的基礎。

2 HPLC法定量分析從丁基膠塞遷移入藥品粉末中的抗氧劑和硫化劑

文獻[7-9]報道丁基膠塞中抗氧劑會遷移至樣品中,引起溶液渾濁的現(xiàn)象,導致溶液的澄清度不合格。丁基膠塞中硫的溶解性較低,會產(chǎn)生噴霜現(xiàn)象,不僅會破壞硫的分散均勻性,降低粘著性,使加工困難,而且會影響被包裝藥物的質(zhì)量[10]。本研究作者建立了有機溶劑回流萃取的方法對其進行提取,并以HPLC法進行測定,快速準確地同時測定藥用丁基膠塞中抗氧劑和硫化劑的含量。

2.1儀器與試藥 安捷倫1 260高效液相色譜儀,DAD檢測器,色譜柱:Inertsil ODS-3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)?？寡鮿┖土蚧瘎φ掌芳八玫脑噭┬畔R總表見表1。

表1 抗氧劑、硫化劑對照品和試劑信息匯總Tab.1 Summary of antioxidant,vulcanizing agent reference and reagent information

2.2方法與結果

2.2.1色譜條件 色譜柱:Inertsil ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:35 ℃;紫外檢測波長220 nm;進樣量:20 μL。

2.2.2溶液的配制

(1)供試品溶液的制備。稱取頭孢美唑鈉樣品約1.0 g,置于10 mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,轉移至分液漏斗中,加甲苯萃取10 mL,共萃取3次。合并萃取液,45 ℃真空旋干,用二氯甲烷0.5 mL使溶解,完全轉移至5 mL量瓶中,用甲醇洗滌合并至量瓶,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,用孔徑0.45 μm濾膜濾過,取續(xù)濾液。

(2)丁基膠塞提取液的制備。取膠塞,剪碎,精密稱取約8 g,置于底燒瓶中,加入甲苯80 mL后回流2 h,冷卻至60 ℃,邊攪拌邊加入甲醇120 mL,過濾,用甲苯-甲醇(40：60)混合液25 mL沖洗燒瓶和漏斗,合并洗液和濾液至250 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻。量取25.0 mL,45 ℃真空蒸干,加二氯甲烷0.5 mL使溶解,完全轉移至5 mL量瓶中,用甲醇洗滌合并至容量瓶并稀釋至刻度,搖勻,用孔徑0.45 μm濾膜,取續(xù)濾液。

2.2.3標準曲線溶液的制備 分別精密稱取抗氧劑264、1 010、330、1 076、168和硫?qū)φ掌犯骷s20 mg,分別置于20 mL量瓶中,加二氯甲烷2 mL使溶解,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為各自對照品儲備液。分別量取上述各對照品儲備液各5.0 mL,置于50 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品儲備液(約100 μg·mL-1)。取混合對照品儲備液,逐級稀釋制成標準曲線系列溶液。

2.2.4精密度實驗 取“2.2.3節(jié)”下2.5 μg·mL-1混合對照品溶液,連續(xù)進樣6針,測定,抗氧劑264、1 010、330、1 076、168和硫峰面積RSD依次為1.9%、1.0%、0.6%、1.5%、1.2%和0.8%。

2.2.5線性關系考察 精密量取“2.2.3節(jié)”下系列混合對照品溶液20 μL,照“2.2.1節(jié)”下色譜條件,進樣測定。試驗結果表明上述抗氧劑和硫化劑在0.5～100 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好,結果見表2。

表2 抗氧劑和硫化劑線性關系結果Tab.2 Result of the linear of antioxidant,vulcanizing agent

2.2.6準確度實驗 精密量取2.2.2項下膠塞提取液25 mL各三份,分別加入混合對照品儲備液62.5、125、187.5 μL,45 ℃真空蒸干,用二氯甲烷0.5 mL溶解,完全轉移至5 mL量瓶中,用甲醇洗滌合并至量瓶,用甲醇稀釋至刻度,搖勻即得低、中、高濃度約為1.25、2.5、3.75 μg·mL-1的溶液,用孔徑0.45 μm濾膜濾過后測定。各濃度供試品加樣溶液中抗氧劑264、1 010、330、1 076、168和硫平均回收率(低、中、高)均在90.0%～110.0%之間,均RSD<10%,結果見表3。

表3 膠塞中抗氧劑和硫化劑的回收率測定結果Tab.3 Determination results of recovery of antioxidant and vulcanizing agent in rubber plug n=9

2.2.7穩(wěn)定性實驗 取“2.2.3節(jié)”下2.5 μg·mL-1混合對照品溶液,于室溫0、3、9、21、24 h依次進樣,測定抗氧劑和硫化劑的峰面積,結果抗氧劑264、1 010、330、1 076、168和硫峰面積基本無變化,RSD均<2.0%,表明在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8檢測限和定量限 取“2.2.3節(jié)”下混合對照品溶液,適當稀釋,配制抗氧劑和硫化劑的檢測限(S/N≈3)和定量限溶液(S/N≈10),結果見表4。

表4 抗氧劑和硫化劑檢測限和定量限測定結果Tab.4 Results of antioxidant and vulcanizing agent detection limit and quantitation limit determination

2.2.9樣品測定 取深圳華潤九新藥業(yè)有限公司、福建省?？顾帢I(yè)股份有限公司、四川合信藥業(yè)有限責任公司、廣州白云山天心制藥股份有限公司、哈藥集團制藥總廠樣品中的膠塞(編號對應為A、B、C、D、E)和四種藥用丁基膠塞(編號對應為a、b、c、d),按“2.2.2節(jié)”下方法制備膠塞提取溶液,依法測定,用標準曲線法計算膠塞中中抗氧劑和硫化劑含量。膠塞中抗氧劑、硫化劑的提取測定結果測定結果見表5,典型色譜圖見圖3。同時為了驗證膠塞中抗氧劑和硫化劑的遷移,對編號為四種藥用丁基膠塞(編號對應為a、b、c、d)的4種膠塞直接接觸對應的藥品粉末進行檢測,同時對四種膠塞填裝頭孢美唑鈉加速試驗3個月樣品的頭孢美唑鈉藥品粉末中抗氧劑和硫化劑也進行測定,分析測試條件和方法同“2.2.1節(jié)”下,結果表明5家企業(yè)的頭孢美唑鈉藥品粉末中和4種膠塞填裝頭孢美唑鈉加速樣品中均檢測到抗氧劑264,除A、C、d樣品外,均檢測到硫,說明膠塞中抗氧劑和硫化劑浸出并遷移至藥品中。藥品粉末中抗氧劑、硫化劑的測定結果見表6,表7。

表5 膠塞中抗氧劑、硫化劑的提取測定結果匯總表Tab.5 Summary of extraction and determination results of antioxidant and vulcanizing agent in rubber plug μg·mL-1

表6 5家企業(yè)樣品的藥品粉末中抗氧劑、硫化劑測定結果Tab.6 Determination results of antioxidant and vulcanizer in samples from five enterprises μg·mL-1

表7 加速實驗3個月后藥品粉末中抗氧劑、硫化劑測定結果Tab.7 Determination results of antioxidants and vulcanizing agents in each drug powder after three-month accelerated test μg·mL-1

A.混合對照品溶液(100 μg·mL-1);B.華潤九新膠塞提取液中抗氧劑和硫化劑;C.華潤九新樣品中抗氧劑和硫化劑;D.3個月加速試驗樣品(四川合信)中抗氧劑和硫化劑遷移;E.空白;1.抗氧劑264;2.抗氧劑1010;3.硫;4.抗氧劑330;5.抗氧劑1076;6.抗氧劑168。圖3 抗氧劑和硫化劑測定HPLC色譜圖A.mixed reference solution(100 μg·mL-1);B.antioxidants and vulcanizing agent in the extract of rubber plug of Hua run jiu xin;C.antioxidants and vulcanizing agent of samples of Huarunjiuxin;D. Antioxidants and vulcanizing agent in samples (Sichuan he xin) after three month accelerated test;E.blank;1.antioxidant 264;2.antioxidant1010;3.vulcanizer;4.antioxidant 330;5.antioxidant1076;6.antioxidant168.Fig.3 HPLC chromatograms for determination of antioxidants and vulcanizing agents

由于良好的還原性能,抗氧劑264、抗氧劑1010是主要的受阻酚類抗氧劑,應控制它們遷移至藥物中的量,以防止對藥物產(chǎn)生影響。注射用頭孢美唑鈉3個月加速樣品中抗氧劑、硫化劑的遷移量測定結果顯示,抗氧劑264(BHT)在樣品中的均有少量的遷移,覆膜比非覆膜膠塞中抗氧劑和硫化劑的遷移量低。另檢出少量硫化劑(可提取硫)的遷移。

3 討論

本文采用GC-MS法和HPLC法,分別對注射用頭孢美唑鈉膠塞中部分揮發(fā)性有機成分及遷移進行了定性分析和定量分析,發(fā)現(xiàn)丁基膠塞中BHT等成分會遷移進入藥品中,進而影響溶液的澄清度。提示生產(chǎn)企業(yè)選用優(yōu)質(zhì)丁基膠塞,并嚴格控制丁基膠塞的質(zhì)量,從而保證本品的質(zhì)量和用藥安全。

研究結果表明在抗氧劑和硫化劑的遷移方面,覆膜膠塞優(yōu)于普通的丁基膠塞。建議廠家盡可能采用覆膜膠塞,提升藥物的穩(wěn)定性,降低膠塞浸出物對藥物質(zhì)量的影響。

各廠家膠塞在配方、原材料等方面差異較大,因而不同廠家膠塞中抗氧劑和硫化劑含量差異也較大。沒有規(guī)定統(tǒng)一配方標準,因而在注射劑仿制藥一致性評價中,需要對膠塞中的抗氧劑和硫化劑進行檢測研究,對其遷移進行測定,評估是否存在安全風險。

本文初步建立了以丁基膠塞中常見抗氧劑和硫化劑為指針性成分的考核評價體系,為進行丁基膠塞與注射劑相容性試驗以及進一步評價藥用丁基膠塞的安全性和穩(wěn)定性提供了可借鑒的方法。