張 遠(yuǎn) 董 晶 國 濱△ 徐振華 時(shí) 楨 李金芳

（1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院，廣州 510080；2 壽光市人民醫(yī)院腫瘤放療科，壽光 262700；3 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽 550004）

肝癌病因相對較多，目前除與最常見的肝硬化、病毒性肝炎等原因所導(dǎo)致的肝纖維化和硬化有關(guān)，還有研究證實(shí)其與炎癥及免疫系統(tǒng)紊亂密切相關(guān)，而巨噬細(xì)胞在其中扮演重要的角色[1-2]。巨噬細(xì)胞是一類天然的免疫細(xì)胞，具有強(qiáng)大的起源及功能異質(zhì)性，一般可通過極化轉(zhuǎn)變自身功能及角色從而發(fā)揮作用，其通?？蓸O化為M1型經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞及M2型替代性活化巨噬細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞可參與炎癥反應(yīng)，抑制腫瘤免疫逃逸及自身生長，M2型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及新生血管的生成[3]。近年來有研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路可參與生長發(fā)育、增殖分化、凋亡等多種細(xì)胞生理過程的調(diào)節(jié)，同時(shí)有研究表明，該信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)異?？赡茉诟伟┑陌l(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-5]。中醫(yī)治療肝癌具有廣闊的前景[6]。而散結(jié)片是我院根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)改進(jìn)而成的中藥抗癌新藥，共湊白鮮皮、海藻、白附子、牛黃等多種中藥材，具有活血化瘀、清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)之功效，且療效已經(jīng)得到證實(shí)，尤其是對中、晚期肝癌療效顯著[7]。但其具體的作用機(jī)制目前尚未明確，因此，本研究就MAPK/JNK信號通路在散結(jié)片對大鼠肝癌抑制及巨噬細(xì)胞極化的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床治療肝癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)選取廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的40只SPF級SD雄性大鼠，大鼠為裸鼠（合格證書為：SCXK（粵）2019-0017），平均體質(zhì)量15～25 g，大鼠單籠喂養(yǎng)，室溫生長，模仿12 h晝夜交替，在常溫下進(jìn)行無菌自由進(jìn)食、飲水2周，按照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

肝癌細(xì)胞（深圳豪地華拓有限公司）；索拉非尼（規(guī)格：200 mg/片，秘魯利馬秘魯巔峰藥業(yè)有限公司）；散結(jié)片（本院中醫(yī)部熬制）；SP600125（美國MedChemExpress LLC公司）；CD11c抗體（上海科敏有限公司）；CD163抗體（北京義翹神州股份有限公司）；全蛋白抽提試劑盒（江蘇凱基有限公司）；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒（江蘇凱基有限公司）；ECL檢測試劑盒（江蘇凱基有限公司）；p38MAPK抗體（上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司）；JNK抗體（武漢菲恩有限公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國Proteintech公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與模型制備

40只SPF級SD雄性大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、索拉非尼組、散結(jié)片組，每組10只。對模型組、索拉非尼組、散結(jié)片組進(jìn)行肝癌建模，向各組大鼠的肝葉注射0.5 mL的1×107個/ mL的肝癌細(xì)胞懸液，10 d后若超聲觀察到出現(xiàn)腫瘤組織塊，則視為建模成功；正常組不建立該模型，同期給予同體積生理鹽水。建模成功后，對索拉非尼組灌胃68 mg/kg的索拉非尼，對散結(jié)片組灌胃12.5 g/kg的散結(jié)片，2組均1次/天，持續(xù)28 d，每隔4 d記錄大鼠死亡數(shù)量，正常組、模型組同期以同體積生理鹽水灌胃。

另取20只大鼠，建模后隨機(jī)分為2組，一組給予灌胃50 mg/kg的JNK抑制劑SP600125，記為抑制劑組，另一組給予羅格列酮聯(lián)合益氣活血沖劑，記為聯(lián)合組。

1.4 標(biāo)本采集

各組大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使其安樂死，分離腫瘤組織，生理鹽水洗凈后稱重，并對其長徑及短徑進(jìn)行測量（腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2），同時(shí)取大鼠肝組織，用4%多聚甲醛固定96 h，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片處理，處理完成后放入冰箱中密封保存。

1.5 大鼠肝組織的H-E染色

取部分肝組織，二甲苯浸泡15 min，梯度乙醇各浸泡3 min以進(jìn)行脫水，用蘇木精-伊紅染液進(jìn)行H-E染色，染色完成后除去多余染液，用梯度乙醇進(jìn)行脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片，然后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.6 巨噬細(xì)胞CD11c、CD163免疫組織化學(xué)顯色

取各組肝組織切片，進(jìn)行脫蠟、水化處理，用蒸餾水浸泡2 min后，將切片放入預(yù)熱的檸檬酸鹽緩沖液中，用微波爐進(jìn)行組織抗原修復(fù)，修復(fù)完成后加入3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，溫室孵育10 min，10%山羊血清封閉2 h，加入CD11c、CD163的一抗（1∶100），4℃過夜，PBS洗滌，加入生物素標(biāo)記的二抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育30 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 免疫印跡法檢測p38MAPK、JNK蛋白的表達(dá)

取各組肝組織，剪碎后加入1 mL RIPA裂解液于冰上充分裂解10 min，在4℃、12 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度，常規(guī)轉(zhuǎn)膜、封閉，加入p38MAPK、JNK一抗（1∶1 000），4 ℃搖床振蕩孵育過夜，PBS洗滌后加入二抗（1∶5 000），37 ℃輕搖室溫孵育2 h；PBS洗滌后用ECL熒光試劑盒測定結(jié)果，計(jì)算與GAPDH比值求得p38MAPK、JNK蛋白的相對表達(dá)含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0對各組大鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白及MAPK/JNK蛋白表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，KaPlan-Meier法繪制各組生存曲線，組間比較采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，用F表示，計(jì)量資料描述采用±s表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生存和腫瘤生長

與正常組比較，模型組大鼠死亡數(shù)量明顯增多（P＜0.05），生存曲線明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，索拉非尼組、散結(jié)片組死亡數(shù)量顯著減少（P＜0.05），生存曲線顯著升高（P＜0.05），且散結(jié)片組比索拉非尼組變化顯著（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組大鼠生存曲線

與模型組比較，索拉非尼組大鼠腫瘤質(zhì)量及體積均顯著降低（P＜0.05）；與索拉非尼組比較，散結(jié)片組大鼠腫瘤質(zhì)量及體積顯著降低（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠腫瘤生長情況

2.2 各組大鼠肝組織H-E染色結(jié)果

正常組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常、形態(tài)良好，肝小葉、肝小梁、肝血竇結(jié)構(gòu)清晰完整且排列有序，未見明顯纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤；而模型組可見明顯腫瘤病灶，大部分肝小葉被腫瘤組織代替，且癌變細(xì)胞已深染，成空泡樣變，可見纖維組織增生及大量炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組相比，索拉非尼組、散結(jié)片組癥狀明顯改善，癌變細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且散結(jié)片組比索拉非尼組改善明顯（圖3）。

圖3 各組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)H-E染色，標(biāo)尺=25 μm。A：正常組；B：模型組；C：索拉非尼組；D：散結(jié)片組.

2.3 各組大鼠肝組織中巨噬細(xì)胞的極化

與正常組比較，模型組肝組織中CD11c顯著降低（P＜0.05），CD163蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，索拉非尼組、散結(jié)片組肝組織中CD11c顯著升高（P＜0.05），CD163蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），且散結(jié)片組比索拉非尼組變化顯著（P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組大鼠肝組織中CD11c（A1～D1）、CD163（A2～D2）的陽性表達(dá)，標(biāo)尺=25 μm。A：正常組；B：模型組；C：索拉非尼組；D：散結(jié)片組；E：各組大鼠肝組織中CD11c、CD163的蛋白表達(dá)比較。*P＜0.05 vs正常組；#P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs索拉非尼組.

2.4 各組大鼠肝組織中MAPK/JNK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

與正常組比較，模型組肝組織中p38MAPK、JNK蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，索拉非尼組、散結(jié)片組、抑制劑組、聯(lián)合組肝組織中p38MAPK、JNK蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），且散結(jié)片組比索拉非尼組降低顯著（P＜0.05），而抑制劑組與散結(jié)片組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），聯(lián)合組比抑制劑組明顯降低（P＜0.05）（圖5）。

圖5 各組大鼠肝組織中的p38MAPK、JNK蛋白表達(dá)

3 討論

肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其早期由于病情隱匿，待患者確診時(shí)多數(shù)都已到中晚期，使得其治療效果及預(yù)后極差，從而導(dǎo)致該病已經(jīng)成為我國惡性腫瘤的第2號殺手[8]。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療肝癌方面占據(jù)主導(dǎo)地位，但中醫(yī)藥在腫瘤治療中同樣不可小覷，中藥具有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、提高機(jī)體免疫功能等多個優(yōu)勢，因此對于中醫(yī)藥靶向治療肝癌的機(jī)制也是我們未來發(fā)展的方向[9]。

本研究結(jié)果顯示，散結(jié)片可顯著改善肝癌大鼠病理形態(tài)，提高大鼠生存率，并有效降低大鼠腫瘤質(zhì)量與體積，這說明其具有很好的療效，可顯著抑制大鼠腫瘤生長。索拉菲尼是一種新型多靶向性治療腫瘤的藥物，屬于小分子蛋白激酶抑制劑，其在血管新生中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)是目前唯一被FDA批準(zhǔn)用于治療晚期肝癌的靶向藥物，因此本研究用其作為對照組[10]。散結(jié)片是我院根據(jù)中醫(yī)理論及多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)研制而成，經(jīng)過多年實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)其對肝癌細(xì)胞有顯著的殺傷力及抑制作用[11]。肝癌在中醫(yī)中屬于“鼓脹”“肝積”“心積”等范疇，其主要由正氣不足、氣滯血疲、痰濕互結(jié)、癌毒稽留、濕熱蘊(yùn)結(jié)所致，故中醫(yī)治療肝癌多側(cè)重于扶正培本、活血化瘀、清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)[12]。而對于肝癌大鼠，散結(jié)片可能是通過活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)等功效，來化痰解毒、扶助正氣、補(bǔ)氣養(yǎng)血、祛邪逐癖，從而調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善局部微循環(huán)，進(jìn)而抑制原癌基因、促進(jìn)抑癌基因、抑制癌細(xì)胞的核酸與蛋白質(zhì)合成，抑制過氧化脂質(zhì)的形成、促進(jìn)受損黏膜修復(fù)等，最終達(dá)到抑制腫瘤組織生長、改善患者癥狀、提高生存率的目的。肖正明等[13]研究顯示，散結(jié)片具有顯著抑瘤作用，可顯著提高淋巴細(xì)胞及吞噬細(xì)胞活性，這與本研究結(jié)果類似。

本研究結(jié)果還顯示，散結(jié)片可顯著升高大鼠肝組織中CD11c蛋白表達(dá)，降低CD163表達(dá)，說明其可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1極化，抑制M2極化。已有證據(jù)表明，炎癥是絕大多數(shù)癌癥的發(fā)病根源及后果，其不充分或不完全消退是導(dǎo)致疾病出現(xiàn)的主要原因，肝癌同樣如此，而其中與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)的巨噬細(xì)胞在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中占有不可忽視的地位[14]。有研究表明，腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞為M2樣表型，M2型巨噬細(xì)胞可介導(dǎo)免疫抑制的形成，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移，因此如何抑制巨噬細(xì)胞向M2型極化一直是腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[15]。而CD11c和CD163分別是M1型及M2型特異型標(biāo)志物，通過對其表達(dá)的檢測，可明確巨噬細(xì)胞極化情況[16]。對于肝癌大鼠，散結(jié)片可能是通過影響腫瘤細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，破壞腫瘤微環(huán)境的平衡，從而抑制巨噬細(xì)胞聚集、浸潤、抑制多種炎性相關(guān)通路的激活，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)、抑制免疫炎癥反應(yīng)的目的，最終有效改善疾病癥狀，提高機(jī)體免疫力。吳婧婧等[17]研究表明，隨著肝癌進(jìn)展，M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)顯著升高，說明其可能促進(jìn)肝癌進(jìn)展，這與本研究結(jié)果類似。

本研究結(jié)果顯示，散結(jié)片可有效抑制MAPK/JNK信號通路激活。中醫(yī)認(rèn)為包括肝癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生均可歸納為兩大類因素，即內(nèi)源性及外源性因素，這些致腫瘤的內(nèi)、外因素都可能引發(fā)機(jī)體細(xì)胞分化異常、細(xì)胞凋亡障礙、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常等，最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[18]。而MAPK所在通路是信號從細(xì)胞表面到細(xì)胞核內(nèi)部一條重要的傳遞途徑，p38MAPK、JNK均是該家族的重要成員，其中p38MAPK被認(rèn)為是介導(dǎo)炎癥所致多種細(xì)胞反應(yīng)中最重要的激酶，JNK則在細(xì)胞因子及應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[19]。而對于肝癌大鼠，散結(jié)片可能是通過抑制病毒與宿主肝細(xì)胞內(nèi)的某些基因序列發(fā)生整合，來抑制MAPK信號通路異?；罨?，從而影響表觀遺傳、有效調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞生長、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝癌細(xì)胞分化、抑制腫瘤血管生成等，最終使腫瘤組織停止生長，改善疾病癥狀。Gao等[20]研究表明，多耐藥肝癌細(xì)胞中，p38MAPK、JNK的蛋白升高，經(jīng)過治療后的表達(dá)顯著降低，這與本研究結(jié)果類似。

綜上所述，散結(jié)片可能是通過抑制MAPK/JNK信號通路，抑制巨噬細(xì)胞向M2型極化，促進(jìn)其向M1型極化，進(jìn)而抑制肝癌大鼠腫瘤生長。但本研究還存在一定局限性，如樣本量小，未單獨(dú)進(jìn)行藥物對大鼠生存情況的影響等，在今后的實(shí)驗(yàn)中將繼續(xù)深入研究，以期為臨床提供更多的診療依據(jù)。