林享玉 祝佳銘 朱 亮 王哲寧 何 晶

（同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)和病理生理學(xué)系，上海 200092）

脫發(fā)是臨床常見疾病，影響患者身心健康及生活質(zhì)量，給患者及社會造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而毛乳頭細(xì)胞 （dermal papilla cells，DPCs） 是毛囊形態(tài)學(xué)發(fā)生的關(guān)鍵，被認(rèn)為是促進(jìn)毛發(fā)再生的重要種子細(xì)胞來源之一[1]。小鼠是毛發(fā)疾病及再生研究的重要模型和工具[2]，但傳統(tǒng)的小鼠DPCs分離培養(yǎng)方法效率低、來源有限且極易老化，嚴(yán)重限制了毛囊再生及毛發(fā)相關(guān)疾病研究的發(fā)展[3]。因此，迫切需要建立更快速、高效的新方法。本研究在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合精細(xì)解剖、酶消化及細(xì)胞培養(yǎng)體系優(yōu)化，建立了分離培養(yǎng)小鼠DPCs的改良新方法，可獲取更多數(shù)量、更好功能的DPCs，為將來毛囊發(fā)育、再生及毛發(fā)相關(guān)疾病研究提供可靠的保障。

1 材料和方法

1.1 動物與試劑

6周大雌性C57BL/6小鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。主要試劑有：磷酸鹽緩沖液（PBS）（Corning公司）；Ⅰ型膠原酶（Sigma公司）；膠原酶NB4（Nordmark公司）；高糖DMEM培養(yǎng)液、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，Corning公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素溶液和0.05% 胰酶-EDTA（Gibco公司）；全培養(yǎng)基用10 mL血清、1 mL青-鏈霉素溶液、89 mL DMEM高糖培養(yǎng)基配制；堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒（南京建成科技有限公司）；TRIzol（Invitrogen公司）；Prime Script RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa公司）。

1.2 DPCs體外分離培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法

DPCs分離和體外培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法參照文獻(xiàn)報道進(jìn)行[2，4]。頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，75%乙醇浸泡消毒5 min。眼科剪剪下兩側(cè)觸須墊，置于無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中。將觸須墊真皮面朝上，在體視顯微鏡下用顯微外科鑷、剪獲取完整的單根毛囊毛球部。簡單剝離去除毛球周圍的脂肪及結(jié)締組織后，將收集的毛囊置于0.2%Ⅰ型膠原酶中進(jìn)行消化，37℃消化2 h后，加入等體積的全培養(yǎng)基終止消化，800 r/min，離心3 min。棄上清液后，在體視顯微鏡下輕輕挑出已松散暴露的毛乳頭，分散接種于培養(yǎng)板表面，加入少量培養(yǎng)液，液面稍高于皿底，于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后首次觀察DPCs貼壁及遷出情況，此后每12 h觀察1次，待所有的毛乳頭開始遷出后，每2～3 d以完全培養(yǎng)基換液。

1.3 DPCs體外分離培養(yǎng)的改良方法

C57BL/6小鼠觸須墊獲取同1.2。將觸須墊真皮面朝上，在體視鏡下用顯微剪去除毛囊毛球部位的脂肪組織，將毛球部分完全暴露，盡量沿根部剪下毛球部分，隨后以顯微外科鑷盡最大可能剝離毛乳頭周圍的結(jié)締組織及真皮鞘，采用顯微彎剪將收集在培養(yǎng)皿中含毛乳頭的毛球組織充分剪碎，置于含0.1% 膠原酶NB4的DMEM液中37℃水浴振蕩消化30 min，加入等體積全培養(yǎng)基終止消化，2 000 r/min離心10 min，棄上清液。收集離心管底部的組織塊，用含10 ng/mL bFGF的完全培養(yǎng)基吹打混勻后，種植于培養(yǎng)板，于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞及組織塊貼壁遷出后，每2～3 d以完全培養(yǎng)基換液，注意動作輕緩，避免脫落。

1.4 DPCs的傳代擴(kuò)增及細(xì)胞獲得數(shù)量

待2種方法獲取的原代DPCs逐漸遷出，增殖并融合至90%時及時傳代，加入0.05% 胰酶-EDTA 2 mL，37℃消化2 min，鏡下觀察細(xì)胞變圓后，去除胰酶，加入1 mL全培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞至完全脫落形成單細(xì)胞懸液，補(bǔ)齊液體后，按1∶3的比例進(jìn)行傳代，繼續(xù)于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，鏡下觀察2種方法培養(yǎng)的第1至5代DPCs的生長狀態(tài)。分別在原代和第1、2及5代增殖融合至90%時，用0.05%胰酶-EDTA對2種培養(yǎng)方法所獲得細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，并用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.5 DPCs的ALP活性鑒定

ALP是DPCs特異性標(biāo)志物，可反映其毛囊誘導(dǎo)功能[5]。將2種方法傳代獲得的第2、5代DPCs分別接種于24孔板，待細(xì)胞生長至80%匯合時，棄去原培養(yǎng)液，PBS漂洗，按照ALP染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。將24孔板中的細(xì)胞用試劑1固定3 min；將試劑2和試劑3以20∶1的比例混合，滴加基質(zhì)液數(shù)滴，覆蓋已處理好的樣本上，37℃避光孵育15 min左右，甩掉多余的染液；立即滴加試劑4染液染色5 min，水洗30 s，再滴加試劑5染色30 s，最后滴加試劑六復(fù)染30 s，水洗30 s，甩干，以奧林巴斯倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測DPCs中ALP mRNA表達(dá)

采用TRIzol法提取2種方法獲取的第2、5代DPCs中總RNA，測定濃度與純度后，按照Prime Script RT reagent Kit說明書方法，將各組細(xì)胞中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書建議的反應(yīng)時間與溫度進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。ALP上游引物序列為5'-CAGGTCCCACAAGCCCGCAA-3'，下游引物序列為5'-CCCGGTGGTGGGCCACAAAA-3'；GAPDH上游引物序列為5'-TGCCCAGAACAT CATCCCT-3'，下游引物序列為5'-GGTCCTCAGTG TAGCCCAAG-3'。反應(yīng)條件為：變性95℃，15 s；退火60℃，30 s；延伸70℃，10 s；共執(zhí)行40個循環(huán)。應(yīng)用公式2-ΔΔCt計算ALP基因的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計結(jié)果圖的繪制，計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種方法分離培養(yǎng)的原代DPCs的形態(tài)學(xué)比較

次日在鏡下觀察，傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)的毛乳頭周圍殘留毛球中的其他結(jié)構(gòu)，包括周圍的部分真皮鞘結(jié)構(gòu)（圖1A），并且只有約40%的毛乳頭組織貼附于培養(yǎng)板底部，其余的大部分均懸浮于液體中，即使后續(xù)重新調(diào)整組織塊位置也很難再次貼附于培養(yǎng)板底部；待種植4～5 d后可見短梭形DPCs遷出，圍繞在毛乳頭組織周圍，至7 d左右，有大量細(xì)胞明顯遷出，細(xì)胞質(zhì)豐富，呈長梭形，但是殘存真皮鞘也有大量細(xì)胞遷出（圖1B）；而細(xì)胞遷出到完全融合需要13～14 d，并且早期遷出的細(xì)胞出現(xiàn)明顯堆積，而組織塊之間則較為稀疏。

圖1 2種方法分離的原代DPCs的形態(tài)學(xué)比較，標(biāo)尺=500 μm

改良方法獲得的原代DPCs，次日可見經(jīng)剪碎消化的毛乳頭組織更松散、細(xì)碎，幾乎所有的毛乳頭都可以牢固并均勻的鋪散于培養(yǎng)板底部，經(jīng)換液也不會出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，而組織塊之間則貼附大量分散為單細(xì)胞的DPCs（圖1C）；2～3 d時細(xì)胞可從組織塊中遷出，細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形，折光強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)豐富，6～7 d時細(xì)胞大量遷出、增殖，原代細(xì)胞達(dá)到融合，靠近毛乳頭中心位置遷出的細(xì)胞可呈現(xiàn)多層聚集性生長現(xiàn)象（圖1D）。

2.2 2種方法DPCs的傳代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)比較

待原代DPCs生長融合至90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，2種方法的第1代DPCs均在12 h左右貼壁生長，24 h后呈現(xiàn)聚集性生長趨勢，而48 h后聚集性生長更加明顯；并且2種方法獲得的DPCs形態(tài)未見明顯差異，均呈現(xiàn)梭形或者多角形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)（圖2A，D）；在1∶3比例傳代的條件下，傳統(tǒng)方法的第1代細(xì)胞約在4 d融合至90%，改良方法則為3 d左右。

圖2 2種方法傳代培養(yǎng)的DPCs的形態(tài)學(xué)比較，標(biāo)尺=100 μm

隨著傳代次數(shù)的增加，傳統(tǒng)方法的第2代細(xì)胞的胞體較第1代有所增大，并以多角形為主，而聚集性生長的趨勢也不明顯，3 d左右可達(dá)到90%融合（圖2B）；繼續(xù)傳代至第5代時，傳統(tǒng)方法的DPCs細(xì)胞面積明顯增大，細(xì)胞質(zhì)不均勻，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯老化、肥大的特征，細(xì)胞活力顯著下降，生長緩慢，6～7 d才可達(dá)到90%融合，且完全喪失聚集性生長的特征（圖2C）。而改良方法的第2代細(xì)胞的大小、形態(tài)與第1代細(xì)胞比較變化不大，還保持著聚集性生長的趨勢，細(xì)胞增殖迅速，2～3 d即可融合（圖2E）；并且隨著傳代次數(shù)增加，到第5代細(xì)胞還能保持較好的形態(tài)，聚集性生長趨勢尚未完全消失，3 d左右細(xì)胞融合（圖2F）。

2.3 2種方法的DPCs細(xì)胞獲得量比較

2種方法分別自4個觸須墊分離并培養(yǎng)DPCs，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)顯示，雖然傳統(tǒng)方法的原代細(xì)胞生長時間更長，但是獲得的細(xì)胞數(shù)量僅為（0.14±0.01）×106，改良方法卻可獲得（0.82±0.01） ×106，約是傳統(tǒng)方法的5.85倍；另外傳代后，傳統(tǒng)方法的第1、2和5代細(xì)胞分別可獲得（0.27±0.01）×106、（1.21±0.18） ×106和（14.67±0.47） ×106數(shù)量的細(xì)胞，而改良方法則為（1.74±0.02） ×106、（9.94±0.31） ×106、（203.33±20.54） ×106，分別是傳統(tǒng)方法的6.44、8.21和13.86倍，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果說明改良方法可獲得更多的DPCs，尤其是高代次更具優(yōu)勢（表1）。

表1 不同方法分離培養(yǎng)的DPCs細(xì)胞獲得量比較（n=3，±s，×106）

表1 不同方法分離培養(yǎng)的DPCs細(xì)胞獲得量比較（n=3，±s，×106）

**P＜0.01 vs傳統(tǒng)方法

方法0代第1代第2代第5代傳統(tǒng)方法0.14±0.010.27±0.011.21±0.1814.67±0.47改良方法0.82±0.01**1.74±0.02**9.94±0.31**203.33±20.54**

2.4 2種方法培養(yǎng)的DPCs的ALP活性的比較

ALP是DPCs特有的功能標(biāo)志蛋白，其活性強(qiáng)度也間接反應(yīng)了DPCs誘導(dǎo)毛發(fā)形成的能力[5]。ALP試劑盒染色，陽性反應(yīng)為胞質(zhì)中呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀、條狀沉淀。傳統(tǒng)方法和改良方法的2代細(xì)胞經(jīng)染色后顯示，改良方法的細(xì)胞ALP活性稍高于傳統(tǒng)方法（圖3A、B；E、F）；5代細(xì)胞中傳統(tǒng)方法的DPCs基本沒有ALP顯色，而改良方法則仍顯示明顯ALP活性（圖3C、D；G、H）。提示改良方法培養(yǎng)的DPCs的 ALP活性明顯高于傳統(tǒng)方法，尤其是在高代次細(xì)胞中。

圖3 不同方法分離培養(yǎng)的DPCs的ALP活性鑒定，標(biāo)尺=50 μm

qRT-PCR測定結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)方法比較，改良方法培養(yǎng)的第2代 DPCs的ALP mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；隨著細(xì)胞培養(yǎng)代次的提高，雖然2種方法的第5代DPCs中ALP mRNA表達(dá)水平均明顯降低，但與傳統(tǒng)方法相比，改良方法具有更高的ALP mRNA表達(dá)水平，與傳統(tǒng)方法的第2代細(xì)胞持平（P＜0.01）（圖4）。

圖4 不同方法培養(yǎng)第2、5代DPCs中ALP mRNA的表達(dá)水平

3 討論

毛囊是由表皮和真皮相互作用形成的最小器官，具有高度的自我更新能力，是唯一呈終身周期性生長的皮膚器官[6]。而DPCs是位于毛囊基底的特化的真皮成纖維樣細(xì)胞，具有誘導(dǎo)毛囊再生的能力，是毛囊重建、傳導(dǎo)毛發(fā)生長信號的重要結(jié)構(gòu)[1～3]。因此，成功體外分離培養(yǎng)DPCs是開展毛囊研究的首要前提。

小鼠是研究毛發(fā)疾病最佳的模型及工具，但小鼠DPCs的分離培養(yǎng)其實更為困難。這是由于毛乳頭解剖位置的特殊性，獲取高純度DPCs異常困難，以往多采用顯微切割法從毛囊中獲取完整的毛乳頭，分離出 DPCs進(jìn)行培養(yǎng)[7]。體外培養(yǎng)的小鼠DPCs具有特有的聚集性生長特征，可表達(dá)特異性標(biāo)志ALP，移植體內(nèi)可誘導(dǎo)毛囊形成[8]；雖然細(xì)胞具有較高純度，但是生長周期長，獲得量少，易污染，不能滿足科研的需求[7]。并且隨著體外培養(yǎng)傳代次數(shù)的增加，逐漸喪失聚集性生長特征，ALP的表達(dá)也逐漸降低，同時逐漸喪失體內(nèi)誘導(dǎo)毛發(fā)形成的能力。因此，如何獲得大量并且具有良好功能的DPCs是制約毛囊研究領(lǐng)域發(fā)展的難題[5]。也有學(xué)者以5周齡 C57BL/6小鼠背部皮膚，在0.2%Ⅰ型膠原酶中37℃消化2 h，經(jīng)過 2 次 Ficoll 密度梯度離心以獲得大量DPCs，但是細(xì)胞純度及功能仍差強(qiáng)人意[9]。近年來發(fā)展的解剖聯(lián)合酶消化法可提高貼壁遷出率，這也是目前比較通用的傳統(tǒng)方法，但是所獲得細(xì)胞的數(shù)量及功能仍具有較大的提升空間[2，4]。

筆者前期也參照傳統(tǒng)方法，通過顯微解剖和酶消化法獲得完整的單根毛囊，但這種方法獲得的DPCs貼壁率差、損失率高、細(xì)胞生長速度慢，并且混雜有大量的真皮鞘細(xì)胞遷出，嚴(yán)重影響了DPCs純度。因此，改良和優(yōu)化分離培養(yǎng)DPCs方法非常必要。

在此基礎(chǔ)上，本研究聯(lián)合精細(xì)顯微解剖和酶消化法進(jìn)行改良。另外研究顯示bFGF可促進(jìn)多種細(xì)胞增殖，例如對脂肪干細(xì)胞等多種干細(xì)胞，因此被添加入多種重要細(xì)胞的培養(yǎng)體系中；而bFGF對DPCs的生長及功能也同樣具有明顯促進(jìn)作用[10-11]?；谖墨I(xiàn)報道，本實驗添加bFGF（10 ng/mL）以優(yōu)化培養(yǎng)體系，從而建立了更具優(yōu)勢的分離培養(yǎng)小鼠DPCs的新方法。其優(yōu)點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：①以顯微彎剪充分剪碎毛乳頭組織后用膠原酶消化，組織分解更充分，不但提高了貼壁率，而且接種密度實際上遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法，從而可顯著提高DPCs獲得量，縮短擴(kuò)增時間；②傳統(tǒng)方法也可以實現(xiàn)精準(zhǔn)的顯微解剖，但是該方法毛乳頭貼壁率欠佳，反而犧牲了組織利用率和DPCs的獲取數(shù)量，而加大毛乳頭組織獲取量勢必以犧牲其純度作為代價；與此相較，改良法具有較高的細(xì)胞及組織貼壁率，可充分體現(xiàn)精細(xì)解剖的優(yōu)勢，同時滿足提高DPCs的獲取數(shù)量及細(xì)胞純度的要求；③基于文獻(xiàn)支持，培養(yǎng)基中添加bFGF（10 ng/mL）顯著縮短了DPCs的遷移和生長融合時間，也有利于維持DPCs的生物學(xué)功能。實驗結(jié)果顯示，改良方法的毛乳頭幾乎全部貼壁，具有更高的分離效率及細(xì)胞數(shù)量，尤其是高代次（第5代）更為顯著，可維持良好的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞獲得量接近傳統(tǒng)方法的14倍。另外代表DPCs毛囊誘導(dǎo)能力的特異性標(biāo)志物ALP的表達(dá)也明顯提高，尤其是高代次（第5代）的ALP的表達(dá)水平也與傳統(tǒng)方法的低代次（第2代）的水平相當(dāng)，說明改良方法有助于維持DPCs的功能。

綜上所述，該改良方法提高了DPCs的獲取效率和保證其特定的生物學(xué)功能，是一種更快速、高效的DPCs分離培養(yǎng)方法，為后續(xù)進(jìn)行毛囊相關(guān)的研究提供可靠保障。