佘明豪 楊文輝 劉寒松 余 洋 張 磊

（鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，1 普通外科，2 消化內(nèi)科，鄭州 450007）

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）特征為肝脂肪變性和炎癥[1]。西方國(guó)家NASH的發(fā)病率為20%～45%[2-3]。據(jù)報(bào)道，慢性肝臟炎癥被認(rèn)為是導(dǎo)致NASH發(fā)生發(fā)展的主要因素[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是具有18～25個(gè)核苷酸的RNA，為非編碼RNA的一種。有研究顯示，肝病患者與正常人群中miRNA表達(dá)譜存在顯著差異[5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA在多種生物學(xué)過(guò)程和許多疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，如miR-33a、miR-34a和miR-24已顯示出作為NASH發(fā)展的因素，有可能成為NASH進(jìn)展中肝炎的標(biāo)志物[6]。目前，有研究證實(shí)miR-378在引發(fā)肝炎和促進(jìn)肝纖維化中起到重要作用，其可通過(guò)核因子κB（nuclear factor κB，NFκB）-腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）信號(hào)通路促進(jìn)肝組織發(fā)生炎癥甚至纖維化[7]。然而其在NASH中的作用及其機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過(guò)建立NASH小鼠模型組及miR-378干預(yù)組，探討miR-378在NASH發(fā)生及發(fā)展中的作用及其機(jī)制，為NASH的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)健康C57BL/6雄鼠20只，雌鼠20只，8周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK （京） 2012-0001、SYXK （遼）-2010-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)在符合GB14925—2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》有關(guān)要求的屏障環(huán)境中，12 h/12 h晝夜光照循環(huán)，動(dòng)物室溫度 25℃±2 ℃，相對(duì)濕度50%±2%，自由進(jìn)食、飲水。

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將40只C57BL/6小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組（正常飲食組）、NASH模型組（高脂飲食組）、miR-378抑制劑組（高脂飲食+antagomir-378）、陰性抑制劑組（高脂飲食+antagomir陰性對(duì)照）。NASH模型組通過(guò)高脂飲食處理8周，其中高脂飲食包含15%的可可脂、1.25%的膽固醇但不含膽酸鹽；miR-378抑制劑組及陰性抑制劑組均每周以2 mg/kg的劑量進(jìn)行尾靜脈注射miR-378抑制劑antagomir和antagomir陰性對(duì)照溶液，共6周。麻醉處死各組小鼠，取血清和肝組織，-80℃保存。

1.2 主要試劑

cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa，中國(guó)）；TRIzol（BBI，中國(guó)）；抑制劑miR-378 antagomir、陰性對(duì)照抑制劑（吉瑪吉因，中國(guó)）；高脂飼料（維通利華，中國(guó)）。

1.3 小鼠肝系數(shù)測(cè)定

乙醚麻醉小鼠，腹主動(dòng)脈采血后處死，摘取肝，剝?nèi)ブ車(chē)Y(jié)締組織及脂肪組織，對(duì)肝進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算肝系數(shù)。肝系數(shù) （%） =肝濕重 （g） /體質(zhì)量 （g）×100%

1.4 小鼠肝代謝分析

根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用Olympus AU5400自動(dòng)化學(xué)分析儀檢測(cè)各組小鼠血清肝炎癥損傷指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

1.5 小鼠肝組織的病理學(xué)檢測(cè)

每組隨機(jī)選取3只小鼠的肝，置于4%多聚甲醛固定液中固定，1周后石蠟包埋切片（3 μm），分別采用H-E、油紅O、Masson染色試劑盒對(duì)各組肝組織進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.6 免疫熒光檢測(cè)肝纖維化蛋白的表達(dá)

挑選所需組織切片，常規(guī)脫蠟，置于封閉液（0.01 mol/L PBS，0.3% Triton X-100，3%山羊血清）1 h，一抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β，1∶500 稀釋?zhuān)珹bcam 公司，美國(guó)）和膠原蛋白1α2（collagen type l α2，Col1α2，1∶1 000 稀釋?zhuān)珹bcam 公司，美國(guó)），4℃孵育過(guò)夜。加入二抗（1∶1 000，Abcam公司，美國(guó)），室溫、避光、搖床孵育2 h。防淬滅封片劑封片，避光風(fēng)干，共聚焦顯微鏡觀察、拍片記錄。

1.7 肝組織TNF-α、白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、TGF-β和Col1α2基因表達(dá)的檢測(cè)

采用總RNA 提取分離試劑盒（TIANGEN，中國(guó)）對(duì)肝樣本進(jìn)行總RNA的提取，然后將提取的miRNA通過(guò) miRcute miRNA第一鏈合成試劑盒（TIANGEN，中國(guó)）進(jìn)行cDNA的合成，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)說(shuō)明書(shū)操作。通過(guò)miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒（TIANGEN，中國(guó)）對(duì)miR-378表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)參基因?yàn)閁6；用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒對(duì)肝組織TNF-α、IL-4、IL-6、MCP-1、TGF-β和Col1α2 mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，依據(jù) 2-△△ct計(jì)算各miRNA及mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布且方差齊性檢驗(yàn)合格后，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），與對(duì)照組比較采用Dunnett 法分析；不符合則用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝系數(shù)及肝病理學(xué)變化

與對(duì)照組（0.0518±0.0033）g/100 g比較，NASH模型組（0.0642±0.0012）g/100 g和陰性抑制劑組（0.0594±0.0049）g/100 g的肝系數(shù)顯著升高；與NASH模型組比較，miR-378抑制劑組（0.0532±0.0024）g/100 g肝系數(shù)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

對(duì)照組小鼠肝呈鮮紅色，表面光滑且無(wú)纖維化及脂肪浸潤(rùn)；NASH模型組肝小葉結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞壞死、脂肪及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且陰性抑制劑組與之相似；然而miR-378抑制劑組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，脂肪樣變已經(jīng)明顯得到緩解（圖1）。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)組織形態(tài)，標(biāo)尺=50 μm。A1～D1：H-E染色；A2～D2：Masson染色；A3～D3：油紅O染色。A：對(duì)照組；B：NASH模型組；C：miR-378抑制劑組；D：陰性抑制劑組.

2.2 各組肝組織miR-378表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，NASH模型組和陰性抑制劑組miR-378表達(dá)量明顯升高（1.17±0.32比2.13±0.44，1.17±0.32比1.89±0.21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與NASH模型組比較，miR-378抑制劑組miR-378表達(dá)量明顯下降（2.13±0.44比0.55±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 各組血清ALT、AST水平比較

與對(duì)照組比較，NASH模型組和陰性抑制劑組ALT和AST含量明顯升高；而miR-378抑制劑組與NASH模型組比較，ALT和AST含量出現(xiàn)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組小鼠血清中AST和ALT含量比較。*P＜0.05 vs 對(duì)照組 ；△P＜0.05 vs NASH模型組.

2.4 各組肝組織炎癥因子表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，NASH模型組和陰性抑制劑組肝組織TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量明顯升高，而IL-4明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而miR-378抑制劑組與NASH模型組比較，TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量明顯下降，而IL-4明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.5 各組肝組織纖維化基因及蛋白表達(dá)水平比較

NASH模型組和陰性抑制劑組與對(duì)照組比較，TGF-β和Col1α2 mRNA表達(dá)量出現(xiàn)明顯升高，而miR-378抑制劑組較NASH模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。進(jìn)一步免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，NASH模型組和陰性模擬物組與對(duì)照組比較，TGF-β和Col1α2 蛋白表達(dá)量明顯升高，而miR-378抑制劑組較NASH模型組明顯下降（圖5）。

圖4 各組小鼠肝組織纖維化基因表達(dá)比較。*P＜0.05 vs 對(duì)照組；△P＜0.05 vs NASH模型組.

圖5 各組小鼠肝組織Col1α2（A1～D1）和TGF-β（A2～D2）免疫熒光表達(dá)，標(biāo)尺=50 μm。A：對(duì)照組；B：NASH模型組；C：miR-378抑制劑組；D：陰性抑制劑組.

3 討論

NASH是一種嚴(yán)重的肝臟疾病，可通過(guò)炎癥壞死、不同程度的纖維化進(jìn)而發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌[6]。越來(lái)越多的研究表明，NASH中大量的miRNA表達(dá)異常，提示miRNA可能是NASH潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[8]。Kim等[9]報(bào)道m(xù)iR-122在非酒精性脂肪性肝炎小鼠血清中顯著增加，提示miR-122可能是早期檢測(cè)肝毒性的潛在敏感生物標(biāo)志物。Loyer等[10]研究顯示miR-21在NASH中上調(diào)并抑制過(guò)氧化物酶體增長(zhǎng)因子活化受體α的表達(dá)。盡管越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明miRNA在NASH中扮演重要角色，但NASH中miRNA具體的調(diào)控機(jī)制及作用靶點(diǎn)尚不明確。

miRNA通過(guò)與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合的方式影響靶基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能[11]。miRNA具有高度保守性及表達(dá)特異性等特點(diǎn)，因此其在不同物種間的差異較小，故可能有潛力成為疾病診斷及靶向治療的分子標(biāo)志物[12]。目前，有研究證實(shí)miR-378在引發(fā)肝炎癥和促進(jìn)肝纖維化中起重要作用[7]。本研究通過(guò)建立NASH模型，結(jié)果顯示NASH模型組miR-378的表達(dá)量出現(xiàn)明顯升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-378在NASH中扮演重要角色。

ALT和AST是反映肝功能的重要指標(biāo)之一，其含量升高往往是肝功能出現(xiàn)損傷的重要標(biāo)志[13]。TNF-α、IL-6、MCP-1和IL-4是重要的炎癥因子或抗炎因子，是反映肝組織損傷的指標(biāo)[14-16]。本研究通過(guò)組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合生物化學(xué)指標(biāo)及相關(guān)因子表達(dá)檢測(cè)miR-378對(duì)NASH的作用及是否產(chǎn)生治療作用進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示TNF-α、IL-6和IL-4在miR-378抑制劑組與NASH模型組比較發(fā)生顯著改變，然而MCP-1雖有下降趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其可能由于治療時(shí)間較短未導(dǎo)致明顯改變有關(guān)，也可能是MCP-1和其受體C-C趨化因子受體-2相互作用是促進(jìn)早期肝炎癥反應(yīng)的因子，并且MCP-1在肝中的作用是雙重的有關(guān)。在損傷反應(yīng)中，肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞分泌MCP-1導(dǎo)致單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)肝。巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和干擾素-γ，促進(jìn)炎癥和肝細(xì)胞死亡，同時(shí)清除壞死細(xì)胞，可協(xié)助肝重塑和恢復(fù)正常肝功能。但相關(guān)炎癥因子mRNA水平的改變說(shuō)明miR-378具有治療NASH炎癥的作用。而ALT和AST的含量在miR-378抑制劑組也出現(xiàn)明顯下降，且結(jié)合病理形態(tài)指標(biāo)，說(shuō)明低表達(dá)miR-378的NASH模型肝損傷出現(xiàn)了明顯好轉(zhuǎn)。肝組織纖維化是NASH加重的一項(xiàng)重要指標(biāo)[8]。因此，本研究進(jìn)一步探討miR-378對(duì)肝組織纖維化的影響。結(jié)果顯示，miR-378抑制劑組與NASH模型組比較，TGF-β和Col1α2 mRNA表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降。TGF-β 和Col1α2 是肝組織纖維化中2個(gè)重要的相關(guān)因子，提示抑制miR-378能夠延緩甚至逆轉(zhuǎn)纖維化的進(jìn)程，與Zhang等[7]的研究相似。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-378是NASH的危險(xiǎn)因素，抑制miR-378的表達(dá)能夠有效減緩NASH小鼠肝組織纖維化的進(jìn)程，進(jìn)而減緩或阻斷其進(jìn)展為肝硬化的可能。