石 龍, 胡 璇, 溫貴蘭*

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025;2. 貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心,貴州 貴陽 550016)

豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的高度接觸性傳染病,主要導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、死胎、繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀。該病最早于1987年在美國發(fā)現(xiàn),1991年7月荷蘭中央獸醫(yī)研究所首次分離出PRRSV,并命名為Lelystad virus(LV),現(xiàn)已傳播至世界所有養(yǎng)豬國家,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。因此探明該病毒的感染機(jī)制對于診斷和防控具有重大意義。APOBEC家族蛋白(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide)是胞苷酸脫氨酶家族成員中的一大類,包括AID、APOBEC(1、2、3A～A3H)等,是動物機(jī)體內(nèi)的1種天然抗病毒分子[3],主要作用于病毒DNA或RNA的胞嘧啶(C)堿基,使胞嘧啶(C)堿基發(fā)生脫氨基作用,形成堿基-尿嘧啶(U),導(dǎo)致病毒cDNA發(fā)生G-A改變,使病毒基因組產(chǎn)生功能障礙,從而抑制病毒在機(jī)體內(nèi)的增殖及傳播[4]。APOBEC 家族蛋白可以作用于多種病毒,如人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、泡沫病毒(PFV)、乙型肝炎病毒(HBV)、腺病毒(AAV)、異嗜性小鼠白血病病毒相關(guān)病毒(XMRV)等[5]。其中APOBEC3的抗病毒作用明顯,尤其以APOBEC3G、APOBEC3F最為有效,不僅可有效阻止內(nèi)源性與外源性反轉(zhuǎn)錄病毒的增殖,還可抑制HBV等其他非反轉(zhuǎn)錄病毒的增殖[6]。APOBEC3F具有2個催化結(jié)構(gòu)域,N端結(jié)構(gòu)域參與RNA結(jié)合和病毒粒子摻入,C端結(jié)構(gòu)域主要與胞苷脫氨酶活性和脫氨底物序列特異性相關(guān)[7]。本課題組前期研究證明,APOBEC3F能夠在Marc-145細(xì)胞中顯著抑制PRRSV的增殖,且二者存在相互調(diào)控關(guān)系。本研究以APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域?yàn)檠芯繉ο?構(gòu)建APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域真核表達(dá)載體,為研究APOBEC3F與PRRSV之間的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒

pcDNA3.1(+)5’Flag、pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F(由本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2 主要試劑

2×MultiF Seamless Assembly Mix(無縫克隆試劑盒購自ABclonal公司),2×EsTaqDNA聚合酶、PrimeSTAR Max DNA聚合酶(均購自TaKaRa公司),DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購自天根生物公司),膠回收試劑盒(購自生工生物工程公司)。

1.3 主要儀器

基因擴(kuò)增儀(型號:TC-96/G/H/H(b)B,杭州博日科技公司)、凝膠成像儀(型號:Tanon-1600,天能公司)、電泳儀(型號:DYY-6C,北京六一生物公司)。

1.4 引物

以課題組前期構(gòu)建的pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F真核表達(dá)載體中豬源APOBEC3F為參考序列,利用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)進(jìn)行APOBEC3F蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。根據(jù)預(yù)測結(jié)果設(shè)計(jì)APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域引物,根據(jù)pcDNA3.1(+)5’Flag質(zhì)?；蛐蛄性O(shè)計(jì)pcDNA3.1(+)5’Flag引物。引物信息見表1。

表1 引物信息

1.5 豬源APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域基因克隆

以課題組前期構(gòu)建的pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F質(zhì)粒為模板進(jìn)行APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系50 μL:PrimeSTAR Max DNA聚合酶25 μL,上游引物APOBEC3F-N-F 1 μL,下游引物APOBEC3F-N-R 1 μL,模板2 μL,ddH2O 21 μL。反應(yīng)程序:98 ℃變性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸5 s,共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,按膠回收試劑盒說明書方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化、回收,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 豬源APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域真核載體構(gòu)建

(1)以pcDNA3.1(+)5’Flag質(zhì)粒為模板,pcDNA3.1(+)5’Flag-F/R為引物,進(jìn)行質(zhì)粒線性化PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系50 μL:PrimeSTAR Max DNA聚合酶 25 μL,上游引物pcDNA3.1(+)5’Flag-F 1 μL,下游引物pcDNA3.1(+)5’Flag-R 1 μL,模板 2 μL、ddH2O 21 μL。反應(yīng)程序:98 ℃變性10 s,63.8 ℃退火10 s,72 ℃延伸5 s,共35個循環(huán)。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,按膠回收試劑盒說明書方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化、回收,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?2)將純化的APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域基因片段和線性pcDNA3.1(+)5’Flag載體按無縫克隆試劑盒說明書方法進(jìn)行連接。連接體系20 μL:2×MultiF Seamless Assembly Mix 10 μL,豬源APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域基因片段1.07 μL(52.1 ng/μL),pcDNA3.1(+)5’Flag 2.78 μL(110 ng/μL),ddH2O 6.15 μL。反應(yīng)程序:50 ℃ 連接20 min。連接產(chǎn)物按DH5α感受態(tài)細(xì)胞說明書方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂抹于加入0.1%氨芐LB固體篩選培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12 h,釣取重組菌單菌落接種于0.1%氨芐LB液體培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。

1.7 豬源APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域真核載體鑒定

將重組菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共20 μL:2×EsTaqDNA聚合酶10 μL,上游引物APOBEC3F-N-F 0.5 μL,下游引物APOBEC3F-N-R 0.5 μL,模板2 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸80 s,共35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陽性重組菌液送生工生物有限公司進(jìn)行質(zhì)粒測序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬源APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域基因擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可見:APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域PCR產(chǎn)物在534 bp處出現(xiàn)特異條帶,與預(yù)期相符合。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:APOBEC3F-N;2:陰性對照

2.2 豬源APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域真核表達(dá)載體構(gòu)建

由圖2可見:質(zhì)粒線性化載體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在5 757 bp 處出現(xiàn)特異條帶,與預(yù)期相符。

M:DL 10 000 DNA Marker;1:pcDNA3.1(+)5’Flag;-:陰性對照圖2 pcDNA3.1(+)5’Flag質(zhì)粒PCR擴(kuò)增

2.3 豬源APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域真核載體的鑒定

由圖3可見:陽性重組菌液PCR產(chǎn)物于534 bp處出現(xiàn)特異條帶,與預(yù)期相符。由圖4可見:陽性重組菌液測序鑒定結(jié)果pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F-N與擴(kuò)增豬源APOB EC3F-N端結(jié)構(gòu)域序列完全一致,無移碼、基因突變等現(xiàn)象,序列包括Flag標(biāo)簽,表明pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F-N真核載體構(gòu)建成功。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:陰性對照;2～4:陽性重組菌液

圖4 pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F-N陽性重組質(zhì)粒測序結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了豬源APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F-N,為下一步研究APOBEC3F與PRRSV的相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 討論

APOBEC3F具有廣譜抗病毒活性,可有效抑制HIV、HBV、PREV等病毒的復(fù)制,在抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用,受到廣泛關(guān)注[8]。APOBEC3F有7個外顯子,其中第6、7外顯子具有保守的、依賴鋅離子的(cytidine deaminase,CDA)活性位點(diǎn)模塊,對于脫氨酶活性發(fā)揮至關(guān)重要[6,9]。Albin J S等[10]證實(shí)APOBEC3F發(fā)揮抗逆轉(zhuǎn)錄病毒作用主要依賴于脫氨酶活性,APOBEC3蛋白家族中,APOBEC3F是唯一能長期抑制Vif缺失型HIV的蛋白。Kobayashi T等[11]在Albin的基礎(chǔ)上,首次定量測試了APOBEC3F和APOBEC3G抗病毒活性與自身脫氨基化活性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)APOBEC3G的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒能力99.3%是依靠其脫氨基活性,而APOBEC3F發(fā)揮活性依賴自身脫氨基化能力為69.8%。APOBEC3F的C端胞嘧啶脫氨酶結(jié)構(gòu)域控制逆轉(zhuǎn)錄病毒超突變[12]。作為主要的宿主限制因子,APOBEC3G的抗病毒相關(guān)研究報(bào)道較多,有關(guān)APOBEC3F的研究報(bào)道較少,需要更多探索和補(bǔ)充。本研究構(gòu)建了APOBEC3F-N端結(jié)構(gòu)域真核表達(dá)載體,對后續(xù)研究APOBEC3F對PRRSV的作用機(jī)制具有重要意義。