蒙澤飛, 陳 偉*, 陳 龍, 楊 帥, 劉英渠, 朱紅橙, 羅文怡

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025;2. 貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

劍白香豬是主產(chǎn)于貴州省黔東南苗族侗族自治州劍河縣的小型豬種,皮薄、肉嫩、味香,為國(guó)家二級(jí)稀有保護(hù)動(dòng)物,頭、尾部毛色為黑色,軀干部為白色(間雜不規(guī)則黑斑),具有“兩頭烏”特征[1,2]。豬毛色和皮膚顏色是重要的品種特征之一,可作為遺傳標(biāo)記判斷品種純度、親緣關(guān)系、遺傳穩(wěn)定性[3]。microRNA(miRNA)是1種廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的非編碼單鏈小分子RNA,長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸。miRNA通過(guò)與靶mRNA的3’-UTR端非編碼區(qū)(3’-untranslated regions,3’-UTR)結(jié)合抑制靶基因的翻譯或降解靶基因[4]。miR-196a是miR-196家族的重要成員之一,主要參與胚胎發(fā)育過(guò)程中肢體再生、細(xì)胞增殖和分化等過(guò)程[5～7]。有研究表明,miR-196a與錦鯉皮膚的色素形成相關(guān)[8]。本研究以劍白香豬為研究對(duì)象,探究miR-196a在劍白香豬白色和黑色皮膚中的表達(dá)差異,并對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,為miR-196a調(diào)控豬皮膚色素沉積的相關(guān)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 皮膚組織樣品

采集貴州大學(xué)香豬育種場(chǎng)內(nèi)飼養(yǎng)的6月齡健康劍白香豬(公豬3頭)耳部黑色皮膚組織和背部白色皮膚組織,大小為2 cm×2 cm,錫箔紙包裹,置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室 -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器

PCR擴(kuò)增儀(型號(hào):GeneAmp9600,美國(guó)ABI公司)、熒光定量PCR儀(型號(hào):CFX96,美國(guó)ABI公司)、超低溫冰箱(型號(hào):Forma 991,美國(guó)Thermo Fisher Forma公司)、臺(tái)式超速離心機(jī)(型號(hào):Optima MAX &TLX,美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)。

1.3 主要試劑

Trizol試劑(生工生物工程上海有限公司)、miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)、DNA Marker(50 bp DNA Ladder)(北京鼎國(guó)生物技術(shù)科技有限公司)、SYBR Green supermix(美國(guó)Life technologies公司)。

1.4 引物

以GenBank中的豬miR-196a(ssc-miR-196a)(GeneID:100316567;miRBase:MI0002457)為參考序列,應(yīng)用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1條特異引物,以snU6(GeneID:100522884)基因?yàn)閮?nèi)參,引物送至北京擎科生物科技有限公司(重慶)合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

1.5 皮膚總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法分別提取白色和黑色皮膚組織的RNA,按照miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行mRNA逆轉(zhuǎn)錄,分別合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系20 μL:Total RNA 4 μL,2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL,miRNA RT Enzyme Mix 2 μL, RNase-Free ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序:miRNA加A尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄42 ℃ 60 min,酶失活95 ℃ 3 min。

1.6 qRT-PCR反應(yīng)

按照SYBR Green supermix熒光定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行miRNA第一鏈cDNA的qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL:50×ROXReference Dye 2 μL,2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μL,Reverse Primer(snU6-R)0.4 μL、Forward Primer(snU6-F)0.4 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 6.2 μL。每個(gè)皮膚組織cDNA設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性15 min;94 ℃變性20 s,60 ℃退火34 s,共40個(gè)循環(huán)。

1.7 ssc-miR-196a的保守性分析

以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中9個(gè)物種的miR-196a成熟序列為參照序列(見表2),使用MEGA11軟件進(jìn)行多序列比對(duì),分析miR-196a在不同物種間的保守性。

表2 參照序列信息

1.8 ssc-miR-196a的靶基因預(yù)測(cè)及分析

因靶基因預(yù)測(cè)軟件無(wú)豬物種,多序列比對(duì)結(jié)果證實(shí)人has-miR-196a與豬ssc-miR-196a具有高度保守性,因此以人has-miR-196a-5p(5’序列可產(chǎn)生成熟的miRNA)(GeneID:1008263949)作為靶基因預(yù)測(cè)對(duì)象。使用在線軟件PicTar、TargetScan進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行ssc-miR-196a的GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將qRT-PCR的Ct值導(dǎo)入Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理,應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算各樣品中miR-196a的相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算公式:ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)。ΔΔCt=ΔCt(黑色/白色皮膚組織)-ΔCt(白色皮膚組織)。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-196a在劍白香豬皮膚組織中的表達(dá)情況

由圖1可見:miR-196a在劍白香豬白色皮膚組織中的表達(dá)量極顯著高于黑色皮膚組織(P<0.01)。

圖1 miR-196a在劍白香豬皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)

2.2 ssc-miR-196a的保守性分析

由圖2可見:ssc-miR-196a成熟序列與9個(gè)物種(10條參照序列)的相似度為100%,說(shuō)明miR-196a在不同物種中具有高度保守性。

圖2 ssc-miR-196a的多序列比對(duì)

2.3 hsa-miR-196a-5p靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

(1)由圖3可見:利用在線軟件PicTar、TargetScan分別預(yù)測(cè)了152、374個(gè)hsa-miR-196a-5p的靶基因。利用在線軟件venny 2.1.0對(duì)2個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果取交集,共產(chǎn)生81個(gè)交集靶基因。(2)利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)81個(gè)交集基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析。GO功能分析結(jié)果見圖4:生物過(guò)程分析結(jié)果顯示,hsa-miR-196a-5p靶基因主要富集于轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、胚胎骨骼系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)元投射形態(tài)發(fā)生、皮膚形態(tài)發(fā)生、傷口愈合等過(guò)程;細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示,靶基因主要富集于染色質(zhì)、核質(zhì)、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細(xì)胞外基質(zhì)和大分子復(fù)合物等位置;分子功能分析結(jié)果顯示,靶基因主要富集于生長(zhǎng)因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、雙鏈DNA結(jié)合、甲基化組蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合等條目。(3)KEGG通路分析結(jié)果見圖5:hsa-miR-196a-5p靶基因主要富集于蛋白質(zhì)消化吸收、癌癥miRNAs、黑色素生成等通路。其中黑色素生成通路富集到神經(jīng)母細(xì)胞瘤RAS病毒(v-ras)、癌基因同系物(NRAS)、腺苷酸環(huán)化酶9(ADCY9)、鈣調(diào)素 3(CALM3)。

圖3 hsa-miR-196a-5p靶基因預(yù)測(cè)

圖4 hsa-miR-196a-5p靶基因GO功能富集分析

圖5 hsa-miR-196a-5p靶基因KEGG通路分析

3 結(jié)論

miR-196a在劍白香豬白色皮膚組織中的表達(dá)量極顯著高于黑色皮膚組織,推測(cè)miR-196a與劍白香豬的皮膚顏色遺傳相關(guān)。miR-196a-5p靶基因預(yù)測(cè)及功能分析結(jié)果表明,GO功能的生物過(guò)程、細(xì)胞定位、分子功能分別富集于38、13、27個(gè)條目,KEGG通路與黑色素生成有關(guān)的基因?yàn)镹RAS、ADCY9、ALM3。

4 討論

4.1miRNAs可通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因活性控制皮膚色素沉著。前阿皮黑色素皮質(zhì)素(POMC)是參與色素形成的基因之一,miR-488可以通過(guò)靶向結(jié)合POMC的mRNA 3’-UTR種子序列實(shí)現(xiàn)對(duì)POMC mRNA的降解,從而控制小鼠皮毛的顏色[9]。本研究中miR-196a在劍白香豬白色皮膚組織中的表達(dá)量極顯著高于黑色皮膚組織,這與錦鯉紅色、白色皮膚miR-196a的相對(duì)表達(dá)量顯著高于黑色皮膚的結(jié)果一致[10]。推測(cè)miR-196a對(duì)劍白香豬的色素沉著有調(diào)控作用。

4.2在靶基因預(yù)測(cè)及分析中,KEGG通路富集與黑色素生成有關(guān)的基因有CALM3、NRAS、ADCY9。李春青[11]研究發(fā)現(xiàn),ADCY9、NRAS基因?qū)谏睾铣赏酚兄匾饔?與地表型金線鲃相比,ADCY9和NRAS基因在洞穴型金線鲃皮膚中下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)更加明顯,可能是限制洞穴型金線鲃黑色素合成的關(guān)鍵基因。ADCY9、NRAS基因是否對(duì)劍白香豬皮膚組織的黑色素合成過(guò)程有調(diào)控作用還需要進(jìn)一步探究。