謝濤，彭秀娥，孫青，張朝，陳文燁，張寬

石藥集團(tuán)巨石生物制藥有限公司石藥集團(tuán)新型藥物制劑與輔料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050000

近年，重組蛋白類藥物成為多種疾病的有效治療手段［1-2］。工程細(xì)胞株開發(fā)是重組蛋白類藥物開發(fā)的基礎(chǔ)，對蛋白類藥物的安全性和有效性具有較大影響。工程細(xì)胞株的單克隆源性指用于制備產(chǎn)品的細(xì)胞要求來源于同一祖細(xì)胞，是影響產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵因素，獲取工程細(xì)胞株單克隆源性的證明是藥物研發(fā)整體控制策略的關(guān)鍵步驟［3-4］。傳統(tǒng)單克隆篩選采用有限稀釋法，克隆形成率較低，為確保獲得足夠的候選克隆，每次實(shí)驗(yàn)均需接種30～50塊96孔板，且進(jìn)行連續(xù)2輪篩選，工作量極大［5-8］。采用單克隆篩選儀器ClonePix 并基于半固體培養(yǎng)基進(jìn)行單克隆挑選可提高克隆形成率，但也需進(jìn)行連續(xù)2 輪篩選或另加1 輪有限稀釋法篩選亞克隆，才可提供充分的單克隆源性證明，耗時(shí)較長（6～8 個(gè)月）［9-11］，無法滿足目前新藥研發(fā)進(jìn)度。流式細(xì)胞分選、單細(xì)胞打印機(jī)等聯(lián)用單克隆成像系統(tǒng)的單克隆篩選方法可有效縮短細(xì)胞株開發(fā)時(shí)間，提高單克隆篩選的合規(guī)性［12-16］。近期推出的單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)Beacon 和英國Solentim 公司生產(chǎn)的單克隆接種／成像設(shè)備VIPS（Verified In-situ Plate Seeding）實(shí)現(xiàn)了單克隆接種、拍照一體化，可在短期內(nèi)獲得單克隆細(xì)胞株，并能提供有效的單克隆源性證明［17-20］。

VIPS 可在小于1 psi 的壓力下進(jìn)行單細(xì)胞接種，但由于不同細(xì)胞株對接種壓力的耐受及生長培養(yǎng)基的適應(yīng)性不同，導(dǎo)致克隆形成率存在較大差異，為獲得足夠的候選克隆，需針對細(xì)胞株進(jìn)行單克隆生長培養(yǎng)基組合優(yōu)化。在克隆篩選過程中，單克隆源性照片是項(xiàng)目合規(guī)性的關(guān)鍵證據(jù)，不同品牌96 孔板結(jié)構(gòu)上的輕微差異可導(dǎo)致拍照時(shí)光學(xué)折射率不同，出現(xiàn)重影、模糊、拼接偏差等現(xiàn)象，尤其在板孔邊緣尤為明顯，需在確定96 孔板型號的前提下摸索最適培養(yǎng)基添加體積，達(dá)到最佳拍照效果。本研究以CHO來源的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞池為研究對象，對不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑組合進(jìn)行優(yōu)化，并通過調(diào)整單細(xì)胞培養(yǎng)基體積，提高克隆形成率，確保單克隆成像清晰。以期建立應(yīng)用VIPS 進(jìn)行CHO 工程細(xì)胞株單克隆篩選的方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同目的基因的CHO 工程細(xì)胞池Cell pool 1、Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4均由石藥集團(tuán)巨石生物制藥有限公司制備，均于液氮中保存。

1.2 主要試劑及儀器 CD CHO Medium購自美國Gibco公司；L-蛋氨酸亞砜酰亞胺（L-methionine sulfoximine，MSX）購自美國Sigma公司；MediumⅠ、MediumⅡ、Supplement a、Supplement b及Supplement c均為市售產(chǎn)品；單克隆接種／成像設(shè)備VIPS購自英國Solentim公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將Cell pool 1 于37 ℃水浴中快速解凍復(fù)蘇，用含50 μmol／L MSX 的CD CHO Medium 重懸，200 ×g離心5 min；棄上清，再次重懸，按0.3 ×106個(gè)／mL 的密度接種至30 mL 含50 μmol／L MSX的CD CHO Medium中，移至125 mL搖瓶，于37 ℃，5%CO2環(huán)境下，120 r／min 搖床培養(yǎng)，每3～4 d 進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代接種密度為（0.2～0.3）×106個(gè)／mL。細(xì)胞傳代培養(yǎng)至少2～3 次，細(xì)胞活率≥95%時(shí)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 CHO 工程細(xì)胞株單克隆篩選方法的建立 將Cell pool 1 密度調(diào)節(jié)至（1.0～1.4）× 104個(gè)／mL，取2.5 mL 加至VIPS 的細(xì)胞池中，啟動設(shè)備的單細(xì)胞接種程序，將單細(xì)胞接種至載有不同組合及體積（見表1）培養(yǎng)基的96 孔板中，隨后VIPS 進(jìn)行拍照，并按下式計(jì)算單克隆接種率；于接種后2h及7、10 和14 d 再次拍照，記錄96 孔板中細(xì)胞圖像，作為單克隆源性證明，并按下式計(jì)算克隆形成率及變異系數(shù)（CV），根據(jù)圖像信息，生成細(xì)胞增殖曲線，由細(xì)胞增殖曲線斜率和峰值的差異獲得單克隆增殖速率。

表1 單克隆生長培養(yǎng)基的組合及體積Tab.1 Combinations and volume of monoclonal growth medium

1.5 CHO工程細(xì)胞株單克隆篩選方法適用性的驗(yàn)證將Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4 按1.4 項(xiàng)方法傳代，細(xì)胞密度均調(diào)節(jié)為（1.0～1.4）× 104個(gè)／mL，取2.5 mL，加至VIPS 細(xì)胞池，采用最佳單克隆生長培養(yǎng)基組合及體積進(jìn)行單克隆接種和培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)單克隆接種率、克隆形成率、單克隆增殖速率，并評價(jià)單克隆圖像效果。

2 結(jié)果

2.1 CHO工程細(xì)胞株單克隆篩選方法的建立

2.1.1 單克隆接種率 1～18 號Cell pool 1 的單克隆接種率均值為78%，標(biāo)準(zhǔn)差為5%，CV為6%，見表2。表明不同培養(yǎng)基的接種率穩(wěn)定。

表2 Cell pool 1單克隆接種率統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Statistics of monoclonal inoculation rate of Cell pool 1

2.1.2 克隆形成率 1～8、17和18號培養(yǎng)條件下Cell pool 1 未觀察到克隆形成，9～16 號可觀察到克隆形成，表明MediumⅠ、CD CHO Medium 及含添加劑的CD CHO Medium 組合培養(yǎng)基不適合該細(xì)胞株的單克隆生長，確定MediumⅡ?yàn)樽顑?yōu)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。與基礎(chǔ)培養(yǎng)基MediumⅡ（78%）比較，添加Supplement a的組合培養(yǎng)基培養(yǎng)Cell pool 1的克隆形成率均值（43%）下降45%，添加Supplement b 和Supplement c 的克隆形成率均值（85%和79%）分別上升9%和2%。見表3。

表3 Cell pool 1克隆形成率統(tǒng)計(jì)表Tab.3 Statistics of clone formation rate of Cell pool 1

2.1.3 單克隆增殖速率 與基礎(chǔ)培養(yǎng)基組MediumⅡ比較，添加Supplement a和Supplement b的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的增殖速率提高，且細(xì)胞數(shù)量增加2 倍以上；添加Supplement c的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞增殖數(shù)量變化較小，部分孔板圖像見圖1。表明Supplement a 和Supplement b 添加劑與基礎(chǔ)培養(yǎng)基組合均可大幅提高細(xì)胞的增殖速率，但添加Supplement a使克隆形成率下降45%（2.1.2 項(xiàng)結(jié)果）；添加Supplement b 的孔底雜質(zhì)較多，無法獲得清晰的單克隆源性圖像證明。因此，兩者均不能作為添加劑用于單克隆細(xì)胞篩選。根據(jù)上述結(jié)果確定單獨(dú)使用MediumⅡ?yàn)樽钸m單克隆生長培養(yǎng)基。

圖1 Cell pool 1部分單克隆培養(yǎng)板的圖像展示Fig. 1 Image display of part monoclonal culture plates of Cell pool 1

2.1.4 單克隆圖像效果 接種后2h及7、10 和14 d的細(xì)胞單克隆源性圖像顯示，培養(yǎng)基體積為200 μL／孔的細(xì)胞單克隆源性圖像有重影現(xiàn)象，100 μL／孔的圖像效果明顯好轉(zhuǎn)，見圖2。100 及200 μL／孔接種克隆形成率均值分別為72%（9、11、13、15號）和70%（10、12、14、16號），表明兩種接種體積對細(xì)胞增殖的影響較小。確定最佳培養(yǎng)體積為100 μL／孔。

圖2 不同培養(yǎng)基體積培養(yǎng)細(xì)胞的成像效果比較Fig. 2 Comparison of imaging effects of cells in different medium volumes

2.2 CHO工程細(xì)胞株單克隆篩選方法適用性的驗(yàn)證

2.2.1 單克隆接種率 Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4 單克隆接種率均值為78%，標(biāo)準(zhǔn)差為2%，CV為2%，表明不同細(xì)胞池單克隆接種率穩(wěn)定，見表4。

表4 不同細(xì)胞池的單克隆接種率Tab.4 Clone inoculation rate of different cell pools

2.2.2 克隆形成率 Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4 克隆形成率均值為67%，標(biāo)準(zhǔn)差為3%，CV為5%，表明不同細(xì)胞池克隆形成率穩(wěn)定，見表5。

表5 不同細(xì)胞池的克隆形成率Tab.5 Clone formation rate of different cell pools

2.2.3 單克隆增殖速率 Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4細(xì)胞均能正常增殖，增殖速率略有差異。部分孔板圖像見圖3。

圖3 接種不同細(xì)胞池孔板的細(xì)胞增殖情況Fig. 3 Proliferation of cells in well plates inoculated with different cell pools

2.2.4 單克隆圖像效果 Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4均可觀察到完整的細(xì)胞由1個(gè)分裂成2個(gè)，2個(gè)分裂成4 個(gè)，直至呈現(xiàn)細(xì)胞群的清晰圖像。單克隆細(xì)胞分裂增殖過程見圖4。

圖4 單克隆細(xì)胞分裂增殖過程Fig.4 Process of monoclonal cell division and proliferation

3 討論

人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）Q5D指出，生產(chǎn)重組產(chǎn)品的細(xì)胞克隆應(yīng)為源自一個(gè)祖細(xì)胞且含有所需序列的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。工程細(xì)胞株的單克隆源性關(guān)系到產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的穩(wěn)定性，因此，生產(chǎn)用工程細(xì)胞株的單克隆源性受到監(jiān)管機(jī)構(gòu)的高度重視［21-23］。本研究通過調(diào)整孔板培養(yǎng)體積，可獲得清晰的單克隆源性影像證據(jù)，滿足監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求。前期試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，每孔添加150、180、200 μL 的單克隆生長培養(yǎng)基，在孔邊緣細(xì)胞均出現(xiàn)重影，而添加100 μL 時(shí)重影現(xiàn)象明顯減少或消失。本研究也發(fā)現(xiàn)，每孔培養(yǎng)體積由200 μL 改為100 μL 后，孔底重影區(qū)域變小，即使細(xì)胞處于重影區(qū)域，重影現(xiàn)象也并不明顯，能夠達(dá)到分辨單細(xì)胞的要求。但100 μL 的體系較小，在孔板培養(yǎng)過程中需密切關(guān)注環(huán)境濕度，避免出現(xiàn)因培養(yǎng)基過量蒸發(fā)導(dǎo)致體系滲透壓升高，從而出現(xiàn)細(xì)胞死亡的情況。

培養(yǎng)基成分決定了細(xì)胞的生長環(huán)境，直接影響細(xì)胞的生長、蛋白的產(chǎn)量及質(zhì)量，培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化廣泛應(yīng)用于工程細(xì)胞株生產(chǎn)的各階段［24-25］。本研究針對單個(gè)細(xì)胞體外培養(yǎng)不易生長的特點(diǎn)，優(yōu)化了多種單克隆生長培養(yǎng)基組合，結(jié)果表明，單克隆生長培養(yǎng)基對單個(gè)細(xì)胞生長狀態(tài)影響顯著，Medium Ⅱ與Supplement b組合既能提高克隆形成率又能提高單克隆增殖速率，但孔底雜質(zhì)較多，無法獲得清晰的單克隆源性圖像證明，嘗試增加37 ℃混勻時(shí)間及采用0.22 μm濾膜過濾等方式均未能解決板底雜質(zhì)多的問題（未發(fā)表）。推測原因可能為兩種試劑中部分成分產(chǎn)生反應(yīng)形成沉淀，該問題有待進(jìn)一步研究解決。在采用MediumⅡ進(jìn)行單克隆接種時(shí)發(fā)現(xiàn)，少量細(xì)胞在接種后出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后，該現(xiàn)象逐漸消失。這種現(xiàn)象可能與MediumⅡ成分有關(guān)，今后將通過改變MediumⅡ濃度、更換96孔板材質(zhì)等方法進(jìn)一步優(yōu)化。

綜上所述，本研究建立了使用VIPS進(jìn)行工程細(xì)胞株單克隆篩選的方法，并在不同細(xì)胞池中進(jìn)行了驗(yàn)證，單克隆接種率和克隆形成率均穩(wěn)定，且單克隆源性圖像效果清晰，可滿足監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求。本研究為單克隆篩選過程中出現(xiàn)的問題提供了新的解決思路。