覃寶雄 潘 冬

(柳州高級中學(xué) 廣西柳州 545006)

PCR 技術(shù)應(yīng)用廣泛,近年各省市的高考題與模擬題出現(xiàn)了大量以“PCR引物”為背景的試題,不僅考查PCR 實驗本身,還深入到通過PCR 技術(shù)解決基因工程操作中遇到的實際問題,如給目的基因加上限制酶識別序列或制備融合基因等。但高中生物學(xué)教材對引物的概念、利用引物的必要性、如何設(shè)計或選擇引物、如何利用引物初步判斷擴增的DNA 是目的片段、引物與退火溫度的關(guān)系等問題描述較少。下面通過對歷年高考試題、模擬試題進行歸類與分析,鞏固基礎(chǔ)知識,培養(yǎng)學(xué)生關(guān)鍵能力,為教師教學(xué)提供參考。

1 引物的設(shè)計

【例1】(2017·江蘇)設(shè)計引物時需要避免引物之間形成________,而造成引物自連。

參考答案:堿基互補配對

分析:DNA 聚合酶只能延長已存在的DNA 片段。體內(nèi)DNA 的復(fù)制先由引發(fā)酶在DNA 模板上合成一段RNA 鏈,接著由DNA 聚合酶從RNA 引物3'端合成DNA 子鏈。體外擴增DNA 需要在PCR 體系中加入DNA 引物。單條引物內(nèi)或兩條引物間不應(yīng)含有4 bp 以上的互補序列。

教學(xué)建議:教師可以通過試題提醒學(xué)生,引物的設(shè)計除了滿足堿基互補配對這一基本要求外,還要考慮其他方面的限制因素,如引物之間的互補、引物序列與退火溫度等。

2 引物的選擇

【例2】(原創(chuàng))圖1 為X 蛋白的部分基因序列,所示序列為引物結(jié)合的部分,據(jù)圖分析:

圖1 X 蛋白的部分基因序列

擴增X 蛋白基因所需的引物序列是________________________;________________________。

參考答案:5'-ATGCCGTAAGTCCTAC-3'; 5'-TGATCTACGGCTTACA-3'

分析:DNA 子鏈的合成不能從無到有進行,DNA聚合酶只能催化脫氧核糖核苷酸加到DNA 子鏈的3'端上。分析模板鏈的5'端及3'端,結(jié)合DNA 雙鏈反向平行的特點,推測引物的延伸方向。書寫引物序列,一般從引物的5'端向3'端書寫,避免誤判。圖中位于上方的模板鏈5'端磷酸基團在左,3'端羥基在右側(cè),可知與上方模板鏈配對的引物5'端在右側(cè),3'端在左側(cè),引物序列為“5'-TGATCTACGGCTTACA-3'”。同理推測另外一條引物的序列。

教學(xué)建議:教師可以通過試題提醒學(xué)生熟練掌握DNA5'端與3'端的表現(xiàn)形式,引導(dǎo)學(xué)生結(jié)合DNA 反向平行的特點解題。

3 引物的數(shù)量計算

一個DNA 分子n 次擴增得到DNA 分子2n個,DNA 單鏈2n+1條,需消耗引物的數(shù)量為2n+1-2,每種引物需要的條數(shù)是(2n+1-2)/2,即2n-1。如圖2所示,教師可引導(dǎo)學(xué)生分析引物與DNA 分子中間片段結(jié)合的情況,當(dāng)?shù)谌哖CR 循環(huán)結(jié)束時出現(xiàn)兩條單鏈等長的目的片段。該情境可延伸出另外兩種情況:(1)若一條引物從DNA 分子端部結(jié)合,另一條引物從DNA 分子中間部位結(jié)合,則第二輪PCR 循環(huán)結(jié)束時出現(xiàn)兩條單鏈等長的目的片段;(2)若兩條引物均從DNA 分子端部結(jié)合,則第一輪PCR 循環(huán)結(jié)束時出現(xiàn)兩條單鏈等長的目的片段。

圖2 引物與DNA 分子中間片段結(jié)合時的情況

【例3】(原創(chuàng))已知引物1 及引物2 之間的序列為目的序列,若引物與DNA 的結(jié)合位點如圖3所示,在第________輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條單鏈等長的目的片段。

圖3 引物與DNA 的結(jié)合位點圖

參考答案:2

分析:題中的引物1 不在DNA 片段的端點,第1輪循環(huán)后,得到的兩個DNA 分子中有一個DNA 分子兩條單鏈等長并長于目的片段,另一個DNA 分子兩條脫氧核苷酸鏈不等長。通過繪圖可推知,在第二輪循環(huán)產(chǎn)物中出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的目的片段。

教學(xué)建議:教師可以通過試題提醒學(xué)生做題不能死記硬背,應(yīng)該結(jié)合圖形具體問題具體分析。

4 引物擴增片段長度計算

【例4】(2022·北京楊鎮(zhèn)第一中學(xué)模擬)若單菌落擴增后的DNA 樣品電泳結(jié)果如圖4,則圖5 中對應(yīng)泳道1 和泳道2 的引物組合分別為_________。(填序號)

圖4 單菌落擴增后的DNA 樣品電泳結(jié)果圖

圖5 引物圖

參考答案:引物3 和引物4;引物1 和引物2

分析:為判斷PCR 擴增所得DNA 是否為目的片段,可用標(biāo)準(zhǔn)品(Marker)與PCR 產(chǎn)物同時電泳,用染料對DNA 進行染色后再用儀器檢測PCR 產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)品位置。通過對比PCR 產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品相對位置,推斷實驗擴增目的片段是否成功。泳道1 和泳道2的條帶分別為541 bp 和1 076 bp,因此,應(yīng)選擇兩對方向相反的引物,其中引物3 和引物4 擴增的堿基對長度是473+68=541 bp,引物1 和引物2 擴增的堿基對長度是(2 073-473-590)+66=1 076 bp,故對應(yīng)泳道1和泳道2 的引物組合分別為引物3 和4、引物1 和2。

教學(xué)建議:部分學(xué)校因?qū)嶒灄l件限制不能進行PCR 擴增及DNA 瓊脂糖凝膠電泳實驗,教師可通過視頻展示PCR 與DNA 電泳實驗過程,解說兩個實驗之間的聯(lián)系。

5 引物與退火溫度

【例5】(2021·湖北)某實驗利用PCR 技術(shù)獲取目的基因,實驗結(jié)果顯示,除了目的基因條帶(引物與模板完全配對)外,還有2 條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生,以下措施中有效的是

A.增加模板DNA 的量 B.延長熱變性的時間

C.延長延伸的時間 D.提高復(fù)性的溫度

參考答案:D

分析:DNA 的濃度越大,復(fù)性越快。降低退火溫度可提高擴增產(chǎn)量,但引物與模板間錯配現(xiàn)象會增多,導(dǎo)致非特異性擴增上升;提高退火溫度可以減少引物與模板鏈間的非特異性結(jié)合,提高PCR 反應(yīng)的特異性,但擴增效率下降。在教學(xué)過程中,會有學(xué)生對PCR 的退火過程產(chǎn)生疑問,如“退火過程中已經(jīng)解旋的兩種模板鏈?zhǔn)欠駮l(fā)生模板鏈之間的互補配對?”教師應(yīng)引導(dǎo)學(xué)生從模板鏈濃度和引物濃度兩方面思考。實驗中引物濃度遠(yuǎn)高于實驗初始模板DNA的濃度,因此兩種DNA 模板鏈之間堿基互補配對的概率很低。

教學(xué)建議:教師應(yīng)該在教學(xué)中適當(dāng)拓展PCR 實驗每個步驟的注意事項,幫助學(xué)生理解不同PCR 退火溫度及其他參數(shù)設(shè)置的差異。

6 PCR 在基因工程中的應(yīng)用

6.1 添加酶切位點,構(gòu)建基因表達(dá)載體

【例6】(2020·江蘇揚州中學(xué)月考)用PCR 技術(shù)將DNA 分子中的A1片段進行擴增,設(shè)計了引物Ⅰ、Ⅱ,其連接部位如圖6所示,X 為某限制酶識別序列且X 是引物Ⅱ上的一部分。擴增后得到的絕大部分DNA 片段是

圖6 引物與DNA 片段結(jié)合圖

參考答案:D

分析:將真核生物基因?qū)朐松镔|(zhì)粒中構(gòu)建基因表達(dá)載體,常需要在真核生物目的片段兩端加上限制酶識別序列。引物延伸從3'端開始,一般不對引物3'端進行修飾,限制酶切割位點應(yīng)加在5'端。先用限制酶處理原核生物的質(zhì)粒與改造后的目的基因,用DNA 連接酶將兩者連接構(gòu)建基因表達(dá)載體,導(dǎo)入原核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。如圖6所示,在第一次PCR 循環(huán)結(jié)束后,得到以引物Ⅱ延長得到的單鏈。在往后的PCR 循環(huán)中,以引物Ⅱ所形成的單鏈為模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA 時,引物Ⅱ上的X 片段也被作為模板合成子鏈。因為兩條引物間的片段以指數(shù)倍數(shù)擴增,實驗結(jié)束得到的絕大部分DNA 片段是選項中的D。

教學(xué)建議:教師利用繪圖,將前兩輪PCR 結(jié)束后的產(chǎn)物用圖形直觀地呈現(xiàn)出來,并讓學(xué)生思考基因工程中可能遇到的實際問題——天然基因可能不包含與質(zhì)粒相同的限制酶識別序列。通過學(xué)習(xí)學(xué)生認(rèn)識到在基因工程中需要研究人員為目的基因添加與質(zhì)粒相同的限制酶識別序列,為構(gòu)建基因表達(dá)載體提供基礎(chǔ)。

6.2 定點突變,改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能

【例7】(2022·山東泰安市模擬)研究人員發(fā)現(xiàn)若將蛛絲蛋白31 號位的色氨酸替換為酪氨酸,蛛絲韌性提高50%,因而設(shè)計了與蛛絲蛋白基因結(jié)合的兩對引物(引物B 和C 中都替換了一個堿基),并按圖7的方式依次進行4 次PCR 擴增,以得到新的蛛絲蛋白基因。

圖7 PCR 擴增圖

(1)如圖7所示的4 次PCR 都涉及到引物的選擇,其中PCR 1 選擇的引物是________,PCR 4 選擇的引物是________。(填A(yù)、B、C、D)

參考答案:引物A、B;引物A、D

分析:基因工程在原則上只能生產(chǎn)天然蛋白質(zhì),天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能可滿足特定物種生存需要,卻不一定符合人們生產(chǎn)和生活的需要。定點突變目的基因可在細(xì)胞中表達(dá)更優(yōu)的蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)工程中,由于基因決定蛋白質(zhì),因此對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)進行設(shè)計改造需要通過改造基因來達(dá)成。如圖7所示,用引物A 和突變引物B 進行PCR 1,在另外的PCR 體系中用突變引物C 和引物D 進行PCR 2,將兩次PCR 產(chǎn)物混合作為模板,用引物A 和引物D 進行PCR 3 和PCR 4,最終產(chǎn)物即為引入突變位點的DNA序列。

教學(xué)建議:在人教版《選擇性必修3·生物技術(shù)與工程》的“基因工程”這一章節(jié)中,教材先分析了基因工程原理和操作,再分析蛋白質(zhì)工程的目的和流程。通過PCR 技術(shù),我們可以把基因工程和蛋白質(zhì)工程有機結(jié)合,通過對目的基因的定點突變,實現(xiàn)改造天然蛋白質(zhì)。

【例8】(2021·天津)乳酸菌是乳酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌,但耐酸能力較差,影響產(chǎn)量。釀酒酵母耐酸能力較強,但不產(chǎn)生乳酸。研究者將乳酸菌的乳酸脫氫酶基因(LDH)導(dǎo)入釀酒酵母,獲得能產(chǎn)生乳酸的工程菌株。圖8 為構(gòu)建表達(dá)載體時所需的關(guān)鍵條件。

圖8 構(gòu)建表達(dá)載體關(guān)鍵條件圖示

(1)獲得轉(zhuǎn)基因釀酒酵母菌株的過程如下:

①設(shè)計引物擴增乳酸脫氫酶編碼序列。

為使擴增出的序列中編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG 轉(zhuǎn)變?yōu)檎婧松锲玫腁TG,且能通過雙酶切以正確方向插入質(zhì)粒,需設(shè)計引物1 和2。其中引物1 的5'端序列應(yīng)考慮________和________。

參考答案:包含BamHI 的識別序列;將GTG 改為ATG

分析:定點突變PCR 不僅能突變目的基因的外顯子序列,還能突變起始密碼子對應(yīng)的DNA 序列,使原核生物基因突變后轉(zhuǎn)錄的起始密碼子具有真核生物的偏好性,使基因在真核生物中高效表達(dá)。酵母菌為真菌,編碼起始密碼子的序列為真核生物偏好的ATG,原有引物1 序列為GTG,因此將引物1 的5'端序列中GTG 改為ATG。題干中還要求目的基因“能通過雙酶切以正確的方向插入質(zhì)?！?由圖中釀酒酵母基因啟動子的方向及兩種限制酶BamH I 和XbaI 的順序可知,在引物1 的5'端要包含BamH I 的識別序列。

教學(xué)建議:基因工程的實際操作會涉及到對目的基因和質(zhì)粒的改造,試題以科技論文為背景并附有圖形,信息量較大。教師可以讓學(xué)生嘗試提取題目中的信息,并提出解決問題的方案。

6.3 設(shè)計鏈接引物,構(gòu)造融合基因

【例9】(2018·天津靜海一中)融合PCR 技術(shù)是采用具有互補末端的引物,將不同來源的擴增片段連接起來構(gòu)建融合基因的方法,其過程如下圖9所示。

圖9 融合PCR 技術(shù)過程示意圖

(1)若通過融合PCR 技術(shù)將啟動子、目的基因、終止子拼接起來,需要設(shè)計________種引物,其中能夠起著“搭橋”作用的引物有________種。

參考答案:6;4

分析:單種蛋白質(zhì)功能有限,通過融合基因編碼“目的蛋白—特定蛋白”融合蛋白可實現(xiàn)多種應(yīng)用,如借助熒光蛋白對目的蛋白進行示蹤。利用PCR 技術(shù)將兩個基因連接為一個融合基因需要設(shè)計兩對引物。如圖9所示,第1 階段中PCR 至少分別進行2 次循環(huán),才能獲得雙鏈等長的含引物2、含引物3 的DNA,第二階段中因引物2 與引物3“具有互補末端”,使得兩種DNA 能成功“搭橋”連接起來,再經(jīng)PCR 1、PCR 2 形成融合基因。通常,連接幾種目的片段,則需要設(shè)計幾對相應(yīng)的引物。若通過融合PCR 技術(shù)將啟動子、目的基因、終止子拼接起來,需要設(shè)計3 對引物,其中能夠起著“搭橋”作用的引物有2 對。

教學(xué)建議:通過PCR 構(gòu)建融合基因的試題具有一定的難度,可以用于在二輪的專題復(fù)習(xí)中開拓學(xué)生視野,培養(yǎng)學(xué)生的推理能力。

7 總結(jié)

教師可以借助上述典型例題先歸納基礎(chǔ)知識,加深學(xué)生對基本原理的理解,例如引物5'端與模板鏈3'端堿基互補配對,子鏈的合成方向由5'端向3'端進行等。然后,教師進而適度拓展與延伸,引導(dǎo)學(xué)生分析引物的相關(guān)計算、PCR 退火溫度與特異擴增的關(guān)系等問題。最后,教師可以分析PCR 在基因工程中的應(yīng)用,如通過給目的基因加上與質(zhì)粒相同的限制酶識別序列,使目的基因與質(zhì)粒正確連接;通過對目的基因進行改造使宿主細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白品質(zhì)更好;通過給目的基因加上宿主細(xì)胞偏好的轉(zhuǎn)錄或者翻譯的序列,使目的蛋白高效表達(dá)。教師借助由淺入深的試題的歸類與分析,讓學(xué)生理解PCR 不僅用于擴增目的基因,還能解決基因工程遇到的實際問題,考察學(xué)生的科學(xué)思維,培養(yǎng)學(xué)生的關(guān)鍵能力。此外,教師在二輪復(fù)習(xí)及模擬題命制中,可以注意將前沿科技在高中生物學(xué)中適當(dāng)延伸,提升學(xué)生在以科研為背景的試題中獲取信息并解決問題的能力。