摘要 為解析玉米籽粒形成的遺傳基礎(chǔ)，探究Emp35 基因在玉米籽粒發(fā)育中的作用，對(duì)籽粒缺陷突變體empty pericarp35（emp35）進(jìn)行表型鑒定、胚乳細(xì)胞顯微觀察、胚乳貯藏物質(zhì)含量測(cè)定及圖位克隆。結(jié)果顯示：突變體籽粒發(fā)育緩慢，明顯小于同期發(fā)育的正常籽粒，成熟籽粒干癟呈空皮狀；胚乳細(xì)胞顯微觀察發(fā)現(xiàn)emp35 的胚和胚乳發(fā)育嚴(yán)重滯后，胚乳細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)異常；淀粉和蛋白質(zhì)積累減少；F2代分離果穗上正常籽粒與發(fā)育缺陷籽粒呈3∶1 分離，表明籽粒缺陷表型由單個(gè)隱性核基因突變所致。采用集團(tuán)分離分析法（bulked segregantanalysis， BSA） 將Emp35 定位于第8 染色體 127.90～163.36 Mb 區(qū)間，在該區(qū)間內(nèi)開發(fā)了4 個(gè)InDel 標(biāo)記，連鎖作圖將Emp35 精細(xì)定位于139 571 117～146 176 858 區(qū)間。

關(guān)鍵詞 玉米（Zea mays L.）； 籽粒發(fā)育； 集團(tuán)分離分析法； 基因定位； 表型鑒定

中圖分類號(hào) S513.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）02-0085-08

玉米籽粒產(chǎn)量由單位面積穗數(shù)、每穗粒數(shù)和籽粒質(zhì)量3 個(gè)因素構(gòu)成。籽粒質(zhì)量由籽粒庫容和胚乳充實(shí)程度所決定［1］，籽粒發(fā)育與充實(shí)程度影響籽粒產(chǎn)量。玉米籽粒發(fā)育包括胚胎發(fā)育、胚乳細(xì)胞分化和貯藏物質(zhì)積累3 個(gè)關(guān)鍵過程，每個(gè)發(fā)育過程都受眾多基因調(diào)控。目前，研究者已經(jīng)克隆了百余個(gè)控制籽粒發(fā)育進(jìn)程的基因［2］。

胚是玉米授粉后籽粒中最早開始發(fā)育的器官，也是決定種子發(fā)育的關(guān)鍵組織。胚發(fā)育缺陷突變體主要涉及能量供應(yīng)和重要蛋白質(zhì)合成相關(guān)功能，如Lem1 和Emb14 控制質(zhì)體核糖體的形成與組裝［3-4］；Emb8522 參與葉綠體RNA 的轉(zhuǎn)錄后加工［5］；Bige1編碼轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，參與信號(hào)通路的反饋調(diào)節(jié)［6］。一方面，玉米胚乳的發(fā)育和分化決定籽粒大小和籽粒質(zhì)量，影響胚乳發(fā)育的基因多與淀粉和蛋白質(zhì)的合成加工相關(guān)。如Opaque2 編碼轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控相關(guān)醇溶蛋白合成基因的表達(dá)［7］；Sh2 和Bt2 分別編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的大、小亞基，共同構(gòu)成淀粉合成系統(tǒng)中重要的酶［8］；Fl2、Opaque1、Opaque10 基因參與貯藏蛋白質(zhì)加工并形成蛋白質(zhì)體的生理過程［9-11］。另一方面，胚乳細(xì)胞在發(fā)育過程中會(huì)分化出功能特異的細(xì)胞群，如基底胚乳傳遞層、糊粉層細(xì)胞和胚周圍組織細(xì)胞，這些細(xì)胞可以從植株母體組織向籽粒運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與籽粒的發(fā)育和充實(shí)有著密切的關(guān)系［12］。如INCW2（Mn1）、Cr4 等基因變異引起胚乳細(xì)胞異常分化，導(dǎo)致胚和胚乳發(fā)育不良［13-14］。玉米籽粒發(fā)育和充實(shí)的調(diào)控途徑仍有待深入解析。

本研究以1 個(gè)從γ 射線誘變B73 的突變體庫中篩選得到的空種皮（empty pericarp， emp）籽粒表型突變體emp35 為材料，分析該突變體籽粒中胚和胚乳的動(dòng)態(tài)發(fā)育和主要貯藏物質(zhì)的含量變化，并開展Emp35基因定位，以期從發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)角度解析突變體的籽粒表型，進(jìn)而全面解析籽粒質(zhì)量形成的遺傳基礎(chǔ)，為玉米籽粒質(zhì)量的遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的emp35 突變體由長(zhǎng)江大學(xué)杜何為教授提供。將B73 種子經(jīng)γ 射線誘變處理后種植于大田，植株自交。突變體emp35 是從自交果穗中分離出來的籽粒發(fā)育缺陷突變體。由于純合emp35/emp35 無法繁殖，以emp35 雜合體植株（+/emp35）自交繁殖保存突變體基因型。通過+/emp35 與Mo17雜交，然后自交，選擇表型分離的自交果穗用于遺傳分析和基因定位。

1.2 籽粒發(fā)育表型觀察與遺傳分析

種植+/emp35 雜合單株，授粉后分別選取授粉后10、12、14、18 d 自交果穗上的幼嫩籽粒，縱向分割，保留籽粒中部厚2～3 mm 的組織用于包埋。石蠟包埋、染色以及切片參考Ren 等［15］的方法。切片樣片用體視顯微鏡觀察拍照。

取授粉后9、14 d 的幼嫩籽粒，從籽粒中部靠近頂端的位置進(jìn)行橫切，切片厚約2 mm，浸泡于2.5%戊二醛中固定。掃描電鏡制樣參照文獻(xiàn)［15］的方法進(jìn)行。樣品于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡平臺(tái)的JSM-6390LV 掃描電鏡（NTC， 日本）下觀察拍照。

取授粉后10 d 的野生型和突變體籽粒，從籽粒上部取微量胚乳組織固定于2.5% 戊二醛溶液中。透射電鏡制樣參考Cai 等［16］的方法。制樣后在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡平臺(tái)Hitachi-H7650 透射電子顯微鏡（Hitachi，日本）下觀察拍照。

收獲+/emp35 自交成熟果穗，選取21 個(gè)正常發(fā)育且籽粒數(shù)目較多的果穗，統(tǒng)計(jì)干癟皺縮籽粒和飽滿圓潤(rùn)籽粒數(shù)，計(jì)算野生型籽粒與突變籽粒的分離比，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

1.3 籽粒淀粉含量和蛋白組分含量測(cè)定

從+/emp35 植株自交果穗上隨機(jī)挑選野生型和突變體成熟籽粒，使用淀粉測(cè)定試劑盒（K-TSTA-100A/K， Megazyme， Ireland） 提取并測(cè)定玉米籽粒總淀粉含量，3 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包括3次技術(shù)重復(fù)。具體步驟見操作手冊(cè)。

采用硼酸鈉浸取法提取籽?？偟鞍踪|(zhì)，再用無水乙醇萃取總蛋白溶液分離醇溶蛋白和非醇溶蛋白［17］。采用BCA（ bicinchoninic acid）-標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑盒（KTP3006， Abbkine， China）測(cè)定野生型和突變體籽粒總蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白的含量，3 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包括3 次技術(shù)重復(fù)。具體步驟見操作手冊(cè)。

1.4 BSA測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

將+/emp35 單株與Mo17 雜交獲得F1，F(xiàn)1 單株分別自交，選取籽粒表型發(fā)生分離的授粉后14 d 的果穗。在果穗上挑選30 粒正常籽粒和30 粒發(fā)育缺陷籽粒，分別混合構(gòu)建野生型池（bulk-WT， Bwt）和突變型池（bulk-Mut， Bmt）。采用CTAB 法提取基因組DNA［18］。取親本B73、Mo17、Bwt 和Bmt 基因組DNA 各200 ng，按照Illumina Nextera DNA LibraryPrep Kit （FC-121-1030， Illumina， America）說明書構(gòu)建測(cè)序文庫，構(gòu)建好的DNA 文庫使用IlluminaHiSeq4000 測(cè)序儀（Illumina， USA）分別進(jìn)行雙端150 bp （PE150）測(cè)序。B73 和Mo17 測(cè)序深度為100×，每個(gè)混池的測(cè)序深度為30×。

對(duì)于測(cè)序原始數(shù)據(jù)，首先使用Cutadapt ［19］（version1.13）和Trimmomatic ［20］（version 0.36）軟件進(jìn)行篩選，過濾得到高質(zhì)量的clean data， 后用FastQC（https：//www. bioinformatics. babraham. ac. uk/projects/fastqc/）對(duì)測(cè)序長(zhǎng)度、GC 含量、測(cè)序質(zhì)量參數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用BWA［21］（ version 0.7.15-r1140）軟件的MEM 算法將質(zhì)量合格的PE reads （pairedendreads， 雙端測(cè)序片段）比對(duì)到B73 參考基因組AGPv4（http：//plants. ensembl. org/Zea_mays/ Info/Index）上，然后使用軟件Samtools［22］ （version1.3.1）將文件轉(zhuǎn)化為BAM格式。接著使用 Picard（ version1.9.1）工具中的 SortSam 對(duì) BAM 文件中的 reads 進(jìn)行排序，得到最終可以用于變異分析（variant calling）的 BAM 文件。使用 GATK［23］（ version 3.7）的 HaplotypeCaller模塊和GenotypeGVCFs 模塊進(jìn)行變異檢測(cè)，包括單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphisms，SNPs）和小片段（lt;10 bp）插入和缺失（insertion/deletion， InDel）。

完成變異檢測(cè)后，分別計(jì)算Bwt 和Bmt 基因組上各變異位點(diǎn)的突變r(jià)eads 與總reads 的比值，即SNP-index。再計(jì)算SNP-index （WT）與SNP-index（Mut）的差值，即Δ（SNP-index）。Δ（SNP-index）值高于閾值（在Plt;0.01 水平下進(jìn)行10 000 次計(jì)算）的基因區(qū)間即可認(rèn)為可能為目的基因所在區(qū)段。

1.5 候選基因的分子標(biāo)記定位

根據(jù)上述分析結(jié)果，選擇目標(biāo)基因區(qū)間在B73和Mo17、Bwt 和Bmt 之間的InDel 變異，進(jìn)一步將B73 序列與Mo17 參考基因組（http：//maize.plantbiology.msu.edu/）進(jìn)行比對(duì)，確定InDel 變異的真實(shí)性，并設(shè)計(jì)InDel 標(biāo)記引物（表1）。用所設(shè)計(jì)的InDel標(biāo)記檢測(cè)+/emp35 × Mo17 構(gòu)建的F2群體中的突變體籽粒的基因型。將基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入QTL lciMapping3.0軟件中，按照規(guī)定格式將Mo17 特有帶型記作“2”，B73 特有帶型記作“0”，雜合帶型記作“1”。 構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，計(jì)算重組率和遺傳圖距。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體籽粒表型

從γ 射線誘變B73 的突變體庫中篩選到1 個(gè)籽粒發(fā)育缺陷突變體，突變體籽粒干癟，只有空種皮，沒有或只有少量?jī)?nèi)容物，命名為empty pericarp 35（emp35）， 該突變體只能以雜合體形式保存。選取+/emp35 雜合體植株自花授粉后不同時(shí)間的果穗，觀察籽粒發(fā)育的動(dòng)態(tài)變化。授粉后12 d，籽粒顏色都為乳白色，野生型和突變體籽粒大小已有區(qū)別，突變體種皮皺縮（圖1A）。授粉后18 d 野生型籽粒呈現(xiàn)黃色，而突變體籽粒呈乳白色、胚乳不充實(shí)、籽粒大小明顯小于野生型 （圖1B）。成熟果穗上的野生型籽粒圓潤(rùn)飽滿、呈現(xiàn)金黃色，而突變體籽粒干癟皺縮或成片狀、籽粒無胚乳或僅有少量胚乳（圖1C、D）。

從不同發(fā)育時(shí)期的+/emp35 自交果穗上，選取野生型和突變體籽粒進(jìn)行石蠟切片和顯微觀察。授粉后10 和12 d 野生型籽粒胚分化產(chǎn)生胚芽鞘，胚乳細(xì)胞分化、數(shù)目多且分布致密（ 圖2A、B）；同時(shí)期突變體籽粒的胚為未分化的胚體，胚乳細(xì)胞數(shù)量少且分布松散，胚乳與種皮之間存在較大空隙（圖2E、F）。授粉后14 d，野生型籽粒胚分化出多片葉原基（圖2C），而突變體胚的分化仍停留在原胚階段（圖2G）。授粉后18 d，野生型籽粒胚發(fā)育接近完成，胚乳充實(shí)（圖2D）；而突變體籽粒的胚僅分化出盾片，胚乳中的基底胚乳傳遞層（basal endosperm transfer layer，BETL）細(xì)胞和糊粉層細(xì)胞沒有正常分化，籽粒外種皮皺縮（圖2H）?？梢?，e mp35 籽粒的胚發(fā)育遲緩，胚乳細(xì)胞的發(fā)育與分化異常，胚乳干物質(zhì)積累減少。

BETL 是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從母體向籽粒運(yùn)輸?shù)慕M織。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，授粉后12 和15 d 野生型籽粒已形成成熟的BETL 細(xì)胞和多層的傳遞層細(xì)胞，BETL 細(xì)胞沿垂直方向伸長(zhǎng)，次生細(xì)胞壁向胞內(nèi)交錯(cuò)生長(zhǎng)（圖2I、J）；而突變籽粒中僅有1 層分化異常的BETL 細(xì)胞（圖2K、L）。這些結(jié)果表明，Emp35 基因突變會(huì)導(dǎo)致BETL 細(xì)胞的發(fā)育和分化異常，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從母體向籽粒運(yùn)輸。

掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，授粉后9 d 的野生型籽粒胚乳細(xì)胞中已有較多成熟淀粉粒，淀粉粒分布集中（ 圖3A），授粉后15 d的野生型胚乳細(xì)胞中的淀粉粒充實(shí)、堆積緊密（圖3B）。授粉后9 d 的emp35 籽粒胚乳細(xì)胞中幾乎無淀粉粒存在（圖3C），授粉后15d 胚乳細(xì)胞中存在少量淀粉粒且分布零散（圖3D）。這些結(jié)果表明，emp35 籽粒胚乳細(xì)胞干物質(zhì)積累明顯落后于正常籽粒。

通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，授粉后10 d 野生型胚乳細(xì)胞中的線粒體形態(tài)完整，線粒體內(nèi)膜堆積排列規(guī)律整齊、內(nèi)嵴清晰可見、無明顯空泡（圖3E）。而突變體胚乳細(xì)胞中的線粒體結(jié)構(gòu)異常、體積縮小，線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)松散且有明顯空泡化現(xiàn)象（圖3F）。線粒體結(jié)構(gòu)缺陷可能導(dǎo)致供給細(xì)胞生長(zhǎng)的能量不足，對(duì)胚乳充實(shí)乃至整個(gè)籽粒發(fā)育過程產(chǎn)生不良影響。

2.2 突變體籽粒干物質(zhì)積累

胚乳細(xì)胞中淀粉和蛋白質(zhì)定量檢測(cè)結(jié)果顯示，平均每顆野生型籽粒中胚乳淀粉含量占胚乳干物質(zhì)的72.17%，而平均每顆emp35 籽粒中胚乳淀粉含量則僅占胚乳干物質(zhì)比的6.72%（圖4A），顯著低于野生型（Plt;0.001）。這與掃描電鏡觀察到的淀粉粒積累受阻現(xiàn)象吻合。

野生型和突變體籽粒中總蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白的含量測(cè)定結(jié)果顯示，emp35 籽?？偟鞍渍甲蚜Ｙ|(zhì)量的2.29%，顯著低于野生型籽粒的13.30%（Plt;0.001）（圖4B）。同時(shí)，emp35 籽粒醇溶蛋白和非醇溶蛋白的質(zhì)量比分別為1.53% 和0.96%，顯著低于野生型籽粒的10.26%和2.21%（ Plt;0.001），表明emp35 基因突變嚴(yán)重影響籽?？偟鞍住⒋既艿鞍准胺谴既艿鞍椎姆e累。

2.3 emp35 基因的定位

以+/emp35 雜合植株與Mo17 雜交，F(xiàn)1 代植株自交，部分F2 植株上的果穗存在正常籽粒與干癟籽粒的分離。在21 個(gè)分離果穗中，共有野生型籽粒4 675 粒、突變體籽粒1 545 粒，野生型與突變型分離比= 3.02∶1。χ2檢驗(yàn)表明，分離果穗上正常籽粒與突變體籽粒符合3∶1 的分離比（χ2=0.085， Plt;0.05），表明籽粒缺陷表型是由單個(gè)核基因隱性突變所致。

從表型分離的果穗上分別挑選30 粒野生型和30粒突變體籽粒，構(gòu)建野生型（Bwt）和突變體（Bmt）混池，對(duì)親本B73 和Mo17 及混池進(jìn)行重測(cè)序，結(jié)果顯示，B73 與Mo17 分別獲得422 989 871 和377 327 339個(gè)reads，分別可覆蓋參考基因組的95.03% 和79.90%，覆蓋深度達(dá)36.87×和30.76×。Bwt 和Bmt混池則分別獲得330 257 568 和270 665 372 個(gè)reads，可覆蓋B73 參考基因組的90.90% 和90.03%，覆蓋深度為25.82×和21.67×。將所有樣品的reads 序列比對(duì)到B73 參考基因組上，在2 個(gè)混池間共篩選到5 114 337個(gè)SNP 位點(diǎn)和681 377個(gè)InDel 位點(diǎn)。使用Δ（SNP-index）值進(jìn)行候選基因定位，Δ（SNP-index）值超過設(shè)定閾值的reads 集中在玉米第8 號(hào)染色體上127.90～163.26 Mb的物理區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間的物理距離為35.36 Mb（圖5A），Emp35基因可能位于該區(qū)間內(nèi)。

BSA-seq 分析結(jié)果顯示，第8 染色體146～163Mb 區(qū)間測(cè)序數(shù)據(jù)量低、核苷酸變異少，難以開發(fā)多態(tài)性標(biāo)記（圖5B）。因而，我們僅在第8 染色體128～146 Mb 區(qū)間內(nèi)每隔6 Mb 選取1 個(gè)InDel 變異，開發(fā)了4 個(gè)InDel 標(biāo)記（ID128、ID134、ID140 和ID146）。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這4 個(gè)標(biāo)記在B73 和Mo17、Bwt 及Bmt 之間均存在多態(tài)性，表明4 個(gè)InDel 標(biāo)記都與emp35 連鎖。選取授粉后14 d 的F2果穗，共挑選421 粒突變體種子，提取胚乳DNA，進(jìn)行基因型分析，構(gòu)建該染色體區(qū)段的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖，將Emp35 基因定位在139 571 147～146 176 858 Mb（ID140 的物理位置為chr8： 139 571 147～139 571 148，ID146 的物理位置為chr8： 146 176 858～146 176 859），與ID140 和ID146 的遺傳距離分別為4.17 和0.24 cM，對(duì)應(yīng)物理距離約為6.25 Mb 和359 kb（圖6）。

3 討論

玉米籽粒發(fā)育是決定產(chǎn)量的重要因素，而玉米籽粒發(fā)育缺陷突變體是研究籽粒發(fā)育機(jī)制的重要資源?？辗N皮突變體是一類胚和胚乳發(fā)育異常、籽粒皺縮、種子敗育，對(duì)產(chǎn)量產(chǎn)生極大影響的籽粒發(fā)育缺陷突變體。已克隆的Emp 基因大多數(shù)為編碼35 肽重復(fù)蛋白家族 （pentatricopepetide repeat protein，PPR）。PPR 蛋白家族是一類由多個(gè)串聯(lián)重復(fù)基序組成的蛋白質(zhì)，重復(fù)數(shù)為2～30，每個(gè)基序由35 個(gè)低保守度的氨基酸組成［24］。PPR 蛋白可以特異性識(shí)別并結(jié)合線粒體與葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄本，參與線粒體和葉綠體基因轉(zhuǎn)錄本的RNA 剪接、RNA 編輯、RNA翻譯、RNA 穩(wěn)定化和RNA 的成熟等轉(zhuǎn)錄后加工過程［25］。PPR 家族基因突變會(huì)直接影響線粒體成熟和正常功能，使呼吸作用受阻，進(jìn)而導(dǎo)致籽粒發(fā)育供能不足，引起籽粒變小和皺縮等嚴(yán)重缺陷表型。例如：Emp8 蛋白參與線粒體基因nad1 第四內(nèi)含子的反式剪接和nad4 第一內(nèi)含子的順式剪接，emp8 突變體胚與胚乳發(fā)育緩慢，籽粒變?。?6］。EMP9 參與線粒體ccmB-43 和 rps4-335 位點(diǎn)的 C-to-U 編輯，emp9 突變體籽粒干癟皺縮［27］。本研究中的籽粒發(fā)育缺陷突變體emp35 具有胚發(fā)育滯后、胚乳細(xì)胞發(fā)育不良、胚乳干物質(zhì)積累嚴(yán)重不足、種皮干癟塌陷、籽粒無生活力等表型。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)emp35 胚乳細(xì)胞的線粒體內(nèi)嵴排列松散，線粒體腔存在較多空泡。線粒體結(jié)構(gòu)的異常可能導(dǎo)致細(xì)胞代謝水平降低，細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)所需的能量供應(yīng)短缺，致使胚和胚乳發(fā)育異常。emp35 突變體展現(xiàn)的籽粒發(fā)育表型、生理生化指標(biāo)、微觀細(xì)胞結(jié)構(gòu)與PPR 基因的突變體類似，因此，我們推測(cè)Emp35 可能編碼1 個(gè)線粒體結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)蛋白，并可能是PPR 家族基因。

本研究中，F(xiàn)2群體的遺傳分析表明，emp35 的突變表型是由單個(gè)核基因隱性突變所致。通過BSAseq將Emp35 基因定位在8 號(hào)染色體上127.90～163.26 Mb 的區(qū)間內(nèi)。用4 個(gè)InDel 標(biāo)記分析F2群體中的突變體表型籽粒的基因型并作出遺傳連鎖圖，將Emp35 精細(xì)定位于139 571 147～146 176 858 區(qū)間內(nèi)。目前該定位區(qū)間內(nèi)沒有已克隆的玉米籽粒發(fā)育基因，表明Emp35 是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的籽粒發(fā)育相關(guān)基因。在后續(xù)研究中，將開展Emp35 的精細(xì)定位與基因克隆，探究Emp35 基因的表達(dá)部位，研究線粒體基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過程以驗(yàn)證Emp35 突變基因?qū)€粒體合成的影響，解析Emp35 基因在籽粒發(fā)育過程中的生理功能及作用機(jī)制，為玉米籽粒質(zhì)量的改良與穩(wěn)產(chǎn)品種的選育提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)References

［1］ 王漢寧，王曉明. 從源庫觀點(diǎn)看玉米籽粒產(chǎn)量的形成［J］. 甘

肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，27（1）：86-92.WANG H N，WANG

X M. Viewing the formation of maize grain yield from the

source-sink theory［J］.Journal of Gansu Agricultural University，

1992，27（1）：86-92（ in Chinese with English abstract）.

［2］ DAI D W，MA Z Y，SONG R T.Maize kernel development

［J/OL］. Molecular breeding，2021，41（1）：2［2023-04-26］.

https：//doi.org/10.1007/s11032-020-01195-9.

［3］ MA Z R，DOONER H K.A mutation in the nuclear-encoded

plastid ribosomal protein S9 leads to early embryo lethality in

maize［J］.The plant journal，2004，37（1）：92-103.

［4］ LI C L，SHEN Y，MEELEY R，et al.Embryo defective 14 encodes

a plastid-targeted cGTPase essential for embryogenesis

in maize［J］.The plant journal，2015，84（4）：785-799.

［5］ SOSSO D，CANUT M，GENDROT G，et al. PPR8522 encodes

a chloroplast-targeted pentatricopeptide repeat protein

necessary for maize embryogenesis and vegetative development

［J］.Journal of experimental botany，2012，63（16）：5843-5857.

［6］ SUZUKI M，SATO Y，WU S，et al. Conserved functions of

the MATE transporter BIG EMBRYO1 in regulation of lateral

organ size and initiation rate［J］.The plant cell，2015，27（8）：

2288-2300.

［7］ SCHMIDT R J，KETUDAT M，AUKERMAN M J，et al.

Opaque-2 is a transcriptional activator that recognizes a specific

target site in 22-kD zein genes［J］. The plant cell，1992，4

（6）：689-700.

［8］ GIROUX M J，HANNAH L C.ADP-glucose pyrophosphorylase

in shrunken-2 and brittle-2 mutants of maize［J］.Molecular

amp; general genetics，1994，243（4）：400-408.

［9］ COLEMAN C E，CLORE A M，RANCH J P，et al.Expression

of a mutant alpha-zein creates the floury2 phenotype in

transgenic maize［J］.PNAS，1997，94（13）：7094-7097.

［10］ WANG G F，WANG F，WANG G，et al.Opaque1 encodes a

myosin XI motor protein that is required for endoplasmic reticulum

motility and protein body formation in maize endosperm

［J］.The plant cell，2012，24（8）：3447-3462.

［11］ YAO D S，QI W W，LI X，et al.Maize opaque10 encodes a cereal-

specific protein that is essential for the proper distribution

of zeins in endosperm protein bodies［J/OL］. PLoS genetics，

2016，12（8）：e1006270 ［2023-04-26］. https：//doi. org/

10.1371/journal.pgen.1006270.

［12］ BOMMERT P，WERR W. Gene expression patterns in the

maize caryopsis：clues to decisions in embryo and endosperm

development［J］.Gene，2001，271（2）：131-142.

［13］ MILLER M E，CHOUREY P S. The maize invertase-deficient

miniature-1 seed mutation is associated with aberrant

pedicel and endosperm development［J］.The plant cell，1992，4

（3）：297-305.

［14］ BECRAFT P W，STINARD P S，MCCARTY D R.CRINKLY4：

a TNFR-like receptor kinase involved in maize epidermal

differentiation［J］.Science，1996，273（5280）：1406-1409.

［15］ REN X M，PAN Z Y，ZHAO H L，et al. EMPTY PERICARP11

serves as a factor for splicing of mitochondrial nad1 intron

and is required to ensure proper seed development in maize

［J］.Journal of experimental botany，2017，68（16）：4571-4581.

［16］ CAI M J，LI S Z，SUN F，et al.Emp10 encodes a mitochondrial

PPR protein that affects the cis-splicing of nad2 intron 1 and

seed development in maize［J］.The plant journal，2017，91（1）：

132-144.

［17］ CHEN X Z， YAO D S， SONG R T.Maize endosperm protein

extraction and analysis［J/OL］. Bio-protocol， 2013，3

（14）： e832［2023-04-26］. https：//doi.bio-protocol.org/e832.

［18］ DOYLE J. DNA protocols for plants［M］//HEWITT G M，

JOHNSTON A W B，YOUNG J P W.Molecular techniques

in taxonomy.Berlin：Springer，1991：283-293.

［19］ MARTIN M. Cutadapt removes adapter sequences from highthroughput

sequencing reads［J/OL］. EMBnet.journal， 2011，

17 （1） ： 10 ［2023-04-26］. https：//doi. org/10.14806/

ej.17.1.200.

［20］ BOLGER A M，LOHSE M，USADEL B. Trimmomatic：a

flexible trimmer for Illumina sequence data［J］.Bioinformatics，

2014，30（15）：2114-2120.

［21］ LI H，DURBIN R.Fast and accurate short read alignment with

Burrows-Wheeler transform［J］.Bioinformatics，2009，25（14）：

1754-1760.

［22］ LI H，HANDSAKER B，WYSOKER A，et al.The sequence

alignment/map format and SAMtools［J］. Bioinformatics，

2009，25（16）：2078-2079.

［23］ MCKENNA A， HANNA M， BANKS E， et al. The genome

analysis Toolkit： a MapReduce framework for analyzing next

generation DNA sequencing data ［J］. Genome research，

2010， 20（9）： 1297-1303.

［24］ SMALL I， PEETERS N. The PPR motif ： a TPR-related

motif prevalent in plant organellar proteins［J］. Trends in biochemical

sciences， 2000， 25（2）：45-47.

［25］ SCHMITZ-LINNEWEBER C，SMALL I. Pentatricopeptide

repeat proteins： a socket set for organelle gene expression［J］.

Trends in plant science， 2008， 13（12）： 663-670.

［26］ SUN F， ZHANG X Y， SHEN Y， et al. The pentatricopeptide

repeat protein EMPTY PERICARP8 is required for the

splicing of three mitochondrial introns and seed development

in maize［J］. The plant journal， 2018， 95：919-932.

［27］ YANG Y Z， DING S， WANG H C， et al. The pentatricopeptide

repeat protein EMP9 is required for mitochondrial cc?

mB and rps4 transcript editing， mitochondrial complex biogenesis

and seed development in maize［J］. New phytologist，

2017， 214（2）：782-795.

（責(zé)任編輯：張志鈺）