摘要 為研究蛋白質(zhì)的體外泛素化過程，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)和純化APPBP1/UBA3（ E1）、UBC12 （E2）、Cullin1-Rbx1 （E3）和Nedd8 （neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein8）蛋白，制備FITC-Cysteine 綠色熒光素標(biāo)記的泛素Ub（Ubiquitin），構(gòu)建了SCF 泛素連接酶的體外泛素化體系，同時(shí)實(shí)現(xiàn)快速檢測SCF 泛素連接酶中Cullin1 蛋白的自泛素化修飾。結(jié)果表明，建立的體外SCF E3 自泛素化活性反應(yīng)體系具有較高的可操作性和便利性。

關(guān)鍵詞 SCF 泛素連接酶； 泛素化修飾； Cullin1 蛋白； 熒光標(biāo)記

中圖分類號 Q814 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號 1000-2421（2024）02-0273-07

SCF 復(fù)合物（multisubunit SKP1/Cullin1/Fbox，SCF）是一種被廣泛研究的多亞基E3 泛素連接酶，該復(fù)合物是最大的一個(gè)泛素化連接酶蛋白家族，由SKP1、Cullin1 和F-box 蛋白組成，這些蛋白質(zhì)相互連接并執(zhí)行不同的功能。人類、秀麗隱桿線蟲和植物中分別有約70、300 和1 000 種SCF 泛素連接酶［1］。SCF 泛素連接酶在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和生理機(jī)制等方面起著關(guān)鍵的作用，目前已有較多文獻(xiàn)報(bào)道了它參與植物次生代謝、植物脅迫、植物激素信號傳導(dǎo)和植物光形態(tài)建成等過程［2-5］。當(dāng)植物面臨病原體的威脅時(shí)，利用SCF 泛素連接酶復(fù)合物降解其自身防御反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白或者病原體的蛋白質(zhì)，從而抑制病原體入侵［6-7］。SCF E3 連接酶在幾種關(guān)鍵植物激素的感知和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，包括生長素、茉莉酸、三萜內(nèi)酯、赤霉素和乙烯。例如，在水稻的獨(dú)腳金內(nèi)酯（strigolactone， SL）信號通路中，穩(wěn)定的抑制顯性矮桿突變體蛋白DWARF53（D53）及其同系物在缺少SLs 的情況下可以募集植物輔抑制因子TPL/TPR 蛋白并抑制下游反應(yīng)，在SL 存在的情況下，獨(dú)角金內(nèi)酯受體DWARF14（D14）蛋白感知SLs 信號，觸發(fā)SCF 泛素連接酶介導(dǎo)D53 蛋白泛素化，隨后被蛋白酶體系統(tǒng)降解，解除對下游反應(yīng)的抑制［8-10］。

蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡對細(xì)胞生存和發(fā)育至關(guān)重要［11-12］。蛋白質(zhì)降解有2 種主要途徑：自噬和泛素蛋白酶體系統(tǒng)（autophagy and ubiquitin-proteasomesystem）［13］。自噬功能以溶酶體依賴的方式降解細(xì)胞中過量或異常的蛋白質(zhì)，而泛素蛋白酶體系統(tǒng)以蛋白酶體依賴的方式特異性泛素化并降解錯(cuò)誤折疊和受損的蛋白質(zhì)。泛素蛋白酶體系統(tǒng)在真核生物中高度保守，對許多生物過程有重要作用。ATP依賴的泛素偶聯(lián)途徑包括泛素激活酶（ubiquitin activatingenzyme， E1）、泛素偶聯(lián)酶（ubiquitin conjugatingenzyme， E2）和泛素蛋白連接酶（ubiquitin ligase，E3），然后通過26S 對蛋白進(jìn)行降解［14-16］。在所有真核生物中，SCF 泛素連接酶具有相似的模塊化結(jié)構(gòu)，Cullin 蛋白（植物中的Cullin1、Cullin3 和Cullin4）具有一個(gè)細(xì)長支架結(jié)構(gòu)，在其一端與催化亞基RBX1 相互作用，在另一端與底物受體亞基相互作用［17-19］。SCF E3 復(fù)合物的關(guān)鍵特征是Cullin 蛋白C 末端一個(gè)保守的賴氨酸被Nedd8（neural precursor cell expresseddevelopmentally down-regulated protein 8）共價(jià)修飾。SCF 復(fù)合物的形成和激活是一個(gè)受調(diào)控的過程，首先SCF 復(fù)合物中的Cullin 蛋白被Ned‐dylation 修飾，被修飾后SCF E3 復(fù)合物才能被激活［20-21］。與泛素化過程一樣，Neddylation8 修飾與Cullin 蛋白的結(jié)合是通過E1（APPBP1/UBA3）、E2（UBC12）和E3（Cullin-Rbx）多酶級聯(lián)來實(shí)現(xiàn)的［22］。遺傳學(xué)研究表明，Neddylation8 修飾對體內(nèi)SCF E3復(fù)合物的活性有重要影響［22-24］。

建立體外泛素化修飾檢測系統(tǒng)對于研究E3 泛素連接酶在生長發(fā)育中的分子機(jī)制十分重要。然而，由于多亞基SCF E3 泛素連接酶的組成比較復(fù)雜，獲得具有活性的E3 復(fù)合體組分存在較大困難，迄今為止，多亞基SCF E3 泛素連接酶的體外活性檢測體系尚不成熟。本研究構(gòu)建SCF 泛素連接酶的體外泛素化體系，實(shí)現(xiàn)快速檢測SCF 泛素連接酶中Cullin1 蛋白的自泛素化修飾，旨在為研究E3 連接酶的機(jī)制提供基礎(chǔ)平臺(tái)。