摘要：為了解鵝星狀病毒（GAstV）capsid蛋白對細(xì)胞因子的影響，試驗(yàn)將構(gòu)建的pCMV-capsid真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細(xì)胞，提取核酸檢測細(xì)胞內(nèi)CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α、IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，capsid蛋白于12、36 h顯著抑制CCL2轉(zhuǎn)錄，12 h顯著促進(jìn)CCL5表達(dá)，24 h顯著抑制CCL5表達(dá)；capsid蛋白于24、36 h顯著促進(jìn)IL-1β的轉(zhuǎn)錄；capsid蛋白于24、36 h顯著抑制IFN-α的轉(zhuǎn)錄；capsid蛋白于36 h顯著促進(jìn)TNF-α的轉(zhuǎn)錄；capsid蛋白于24 h顯著抑制IFITM1的轉(zhuǎn)錄，于36 h顯著促進(jìn)IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明，GAstV capsid蛋白過表達(dá)能夠誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α和IFITM的轉(zhuǎn)錄，抑制CCL2和IFN-α的轉(zhuǎn)錄；對于CCL5，capsid蛋白早期促進(jìn)CCL5的轉(zhuǎn)錄，后期抑制CCL5的轉(zhuǎn)錄；對于IFITM1，capsid蛋白早期抑制IFITM1轉(zhuǎn)錄，后期促進(jìn)IFITM1轉(zhuǎn)錄。

關(guān)鍵詞：鵝星狀病毒；細(xì)胞因子；轉(zhuǎn)錄；RdRp蛋白

中圖分類號：S852.65+7" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0193-04

收稿日期：2023-04-21

基金項(xiàng)目：信陽農(nóng)林學(xué)院青年教師基金（編號：QN2021010）；河南省重點(diǎn)研發(fā)與推廣專項(xiàng)（科技攻關(guān)）（編號：232102111043）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師培養(yǎng)計(jì)劃；信陽農(nóng)林學(xué)院家禽重大疫病防控科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（編號：2022CXTD06）。

作者簡介：饒 丹（1988—），女，江西南昌人，碩士，講師，從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。E-mail：raodan2007@126.com。

通信作者：董建國，博士，副教授，從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。E-mail：dongjianguo213@163.com。

近幾年，由鵝星狀病毒（GAstV）引起的鵝痛風(fēng)癥狀較為常見。該病毒主要侵害雛鵝，鵝感染后臨床癥狀表現(xiàn)出動(dòng)作緩慢、頻繁縮頸、糞便發(fā)白并外有尿酸鹽包裹。在痛風(fēng)發(fā)病早期，患病雛鵝精神沉郁、食欲不振、體溫升高，經(jīng)常臥地不起，行走不穩(wěn)；在痛風(fēng)發(fā)病中期，患病雛鵝出現(xiàn)輕度跛行，雙腿肘部紅腫，采食量大幅度下降［1］。剖檢雛鵝臟器有白色尿酸鹽沉積，呈大理石樣外觀，腎臟最為明顯［2］。

GAstV基因組全長7 175 bp，共有3個(gè)開放閱讀框：ORF1a、ORF1b和ORF2。其中，ORF1a（3 255 bp）編碼多聚蛋白，ORF1b編碼RdRp蛋白，ORF2編碼capsid蛋白［3］。為研制有效的疫苗進(jìn)行鵝痛風(fēng)的防控，Sellers等表達(dá)了雞星狀病毒的capsid蛋白，雞群免疫后產(chǎn)生高水平的抗體［4］。榮雪路等采用制備的重組GAstV capsid蛋白免疫鵝，能夠100%保護(hù)鵝免受病毒攻擊［5］。這些結(jié)果表明，capsid蛋白具有重要免疫原性，在抵抗疫病入侵中發(fā)揮重要作用。而目前針對GAstV capsid蛋白參與免疫調(diào)控的研究較少。有研究表明，哺乳動(dòng)物急性痛風(fēng)炎性反應(yīng)發(fā)生過程中，細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用［6］。為探索capsid蛋白在免疫調(diào)控中的作用，本研究初步探討GAstV capsid蛋白對細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

293細(xì)胞由信陽農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院免疫病理實(shí)驗(yàn)室凍存；表達(dá)GAstV capsid蛋白的真核質(zhì)粒pCMV-capsid由信陽農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院免疫病理實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，本試驗(yàn)于2022年12月在信陽農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院免疫病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試劑

核酸提取試劑DNA/RNA Extraction Kit FT（Prepackaged）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（1st Strand cDNA Synthesis Kit，+gDNA wiper）、熒光定量試劑AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX Premixed），購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細(xì)胞因子CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α、IFNα和抗病毒蛋白IFITM基因定量檢測引物，由金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中復(fù)蘇293細(xì)胞，于5% CO2培養(yǎng)箱和含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并鋪入12孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

每孔細(xì)胞，使用50 μL無血清培養(yǎng)基稀釋 0.6 μg 真核質(zhì)粒pCMV-capsid-HA。同時(shí)，1.2 μL Lipofectamine 2000試劑加入50 μL無血清培養(yǎng)基。隨后將兩者混合，室溫靜置20 min，隨后將混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，分別于轉(zhuǎn)染后12、24、 36 h 收集細(xì)胞，于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 核酸的提取

使用FastPure Cell Total RNA Isolation Kit 提取細(xì)胞中總RNA，具體操作如下：將細(xì)胞加入Buffer RL，漩渦振蕩，轉(zhuǎn)移到收集管中，至無明顯細(xì)胞團(tuán)，12 000 r/min離心2 min。收集上清液，加入Buffer RL2（已加入無水乙醇），輕柔混勻，轉(zhuǎn)移至RNA Pure Columns中（RNAPure Columns已放入收集管中），12 000 r/min離心1 min，棄廢液。將剩余的液體全部加入吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，棄廢液，重復(fù)1次。向RNA Pure Columns中加入Buffer RW2（已加入無水乙醇），12 000 r/min離心 1 min，棄廢液，12 000 r/min離心2 min。向吸附柱中央部位懸空滴加100 μL的RNase-free ddH2O。室溫放置2 min，12 000 r/min離心1 min洗脫RNA。提取的RNA放于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)胞因子檢測

將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系如下：5×gDNA wiper Mix 2 μL，RNA 8 μL，5×RT Mix 2 μL，HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL，Random hexamers" 1 μL，RNase-free ddH2O 5 μL。反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。隨后采用染料法對細(xì)胞中的CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α和IFITM的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量檢測。定量檢測引物如下：CCL2F：5′-GCCTCCAGCATGAAAGTCTC-3′，CCL2R：5′-AGGTGACTGGGGCATTGAT-3′；CCL5F：5′-CTGCCTCCCCATATTCCTCG-3′，CCL5R：5′-CACACTTGGCGGTTCTTTCG-3′；IL-1βF：5′-AGGCACAAGGCACAACAGGCT-3′，IL-1βR：5′-AACAACTGACGCGGCCTGCC-3′；TNF-αF：5′-CCCTCTGGCCCAGGCAGTCA-3′，TNF-αR：5′-ATGGGTGGAGGGGCAGCCTT-3′；IFITM1F：5′-TCAGGTCAAGGATAGTCTGGAG-3′，IFITM1R：5′-AGGTTGTGTATTCCCACACTGTA-3′，IFITM2F：5′-GGAGGGAGAAAACTCCTTGGA-3′，IFITM2R：5′-GGCCAGTAGGTTGCACATTGT-3′。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAstV capsid蛋白影響趨化因子轉(zhuǎn)錄

293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-capsid-HA真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞中CCL2和CCL5的轉(zhuǎn)錄水平。由圖1可知，capsid蛋白于12、36 h顯著抑制CCL2轉(zhuǎn)錄，12 h顯著促進(jìn)CCL5表達(dá)，24 h顯著抑制CCL5表達(dá)。

2.2 GAstV capsid蛋白促進(jìn)IL-1β的轉(zhuǎn)錄

293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-capsid真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞中IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平，由圖2可知，capsid蛋白于24、36 h顯著促進(jìn)IL-1β的轉(zhuǎn)錄。

2.3 GAstV capsid蛋白抑制IFN-α的轉(zhuǎn)錄

293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-capsid真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞中IFN-α的轉(zhuǎn)錄水平。由圖3可知，capsid蛋白于24、36 h顯著抑制IFN-α的轉(zhuǎn)錄。

2.4 GAstV capsid蛋白對TNF-α轉(zhuǎn)錄的影響

293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-capsid真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞中IFN-α的轉(zhuǎn)錄水平，由圖4可知，capsid蛋白于36 h顯著促進(jìn) TNF- α的轉(zhuǎn)錄。

2.5 GAstV capsid蛋白對IFITM轉(zhuǎn)錄的影響

293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-capsid真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞中IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄水平，由圖5可知，capsid蛋白于24 h顯著抑制IFITM1的轉(zhuǎn)錄，于36 h顯著促進(jìn)IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄。

3 討論與結(jié)論

近幾年，鵝痛風(fēng)在我國江蘇、安徽、山東、廣東等養(yǎng)鵝地區(qū)頻繁發(fā)生，發(fā)病率高達(dá)80%，致使50%的病鵝死亡，嚴(yán)重影響鵝產(chǎn)業(yè)［7-8］。痛風(fēng)主要引起鵝各個(gè)內(nèi)臟器官表面尿酸鹽沉積，病毒有廣泛組織嗜性，主要侵害腎臟［2］。

在痛風(fēng)發(fā)生過程中，炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用。病毒感染宿主后，往往通過自身蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)自身增殖。趨化因子是白細(xì)胞（包括：單核細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）的趨化劑。人巨細(xì)胞病毒感染誘導(dǎo)人胚胎肺成纖維細(xì)胞中CCL2 mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)誘導(dǎo)CCL2的特異性配體CCR2的表達(dá)水平，干擾CCL2表達(dá)，抑制病毒復(fù)制［9］。艾滋病病毒Nef蛋白誘導(dǎo)CCL2的表達(dá)，有利于病毒入侵腦，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙［10］。CCL2能夠降低IFN-α的表達(dá)，并通過上調(diào)表面C-X-C基序趨化因子受體4的表達(dá)促進(jìn)艾滋病病毒的復(fù)制［11］。CCL5通過上調(diào)SAMHD1水平抑制甲型流感病毒的復(fù)制［12］。本研究顯示，GAstV capsid蛋白過表達(dá)能夠抑制CCL2的表達(dá)，而對于CCL5，capsid蛋白過表達(dá)后早期抑制CCL5表達(dá)，后期促進(jìn)CCL5表達(dá)。同時(shí)，GAstV capsid蛋白過表達(dá)能夠降低 IFN-α，后期促進(jìn)抗病毒蛋白IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄。趨化因子在病毒廣泛擴(kuò)散中發(fā)揮重要作用，而IFN和抗病毒蛋白具有重要的抗病毒特性。這些因子的改變是否會(huì)導(dǎo)致GAstV的廣泛組織嗜性，利于病毒增殖，有待于進(jìn)一步研究。

研究顯示，許多病毒感染會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)劇烈發(fā)生，進(jìn)而影響病毒自身增殖。流感病毒H1N1感染后，促進(jìn)人類單核細(xì)胞中IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平［13］。登革病毒通過誘導(dǎo)TNF-α分泌降低IRS-1，參與胰島素抵抗作用［14］。犬流感病毒感染巨噬細(xì)胞后，誘導(dǎo)TNF-α的分泌和細(xì)胞死亡［15］。豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染巨噬細(xì)胞后誘導(dǎo) TNF-α 的分泌，進(jìn)而抑制豬瘟病毒的復(fù)制，致使臨床上出現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征感染導(dǎo)致豬瘟疫苗免疫失?。?6］。貓傳染性腹膜炎病毒感染巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)TNF-α的分泌，上調(diào)Ⅱ型貓傳染性腹膜炎病毒受體貓氨基肽酶N在貓巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，利于病毒感染［17］。新型冠狀病毒感染會(huì)強(qiáng)烈、快速地刺激先天免疫反應(yīng)，激活炎性小體，釋放IL-1β，導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng)和肺部的損傷［18-19］。在尿酸鹽形成過程中，尿酸鹽結(jié)晶與巨噬細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致NLRP3激活，進(jìn)而活化 Caspase1，產(chǎn)生成熟的IL-1β，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)［20］。對感染GAstV雛鵝的腎臟中炎性因子的表達(dá)水平進(jìn)行研究，結(jié)果顯示腎臟中IL-1β和 TNF-α 的表達(dá)水平顯著升高，導(dǎo)致雛鵝腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性損傷［21］。本研究結(jié)果顯示，GAstV capsid蛋白顯著誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果表明GAstV capsid蛋白可能通過誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟的損傷和尿酸鹽沉積，具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜述所述，本研究顯示GAstV capsid蛋白過表達(dá)能夠誘導(dǎo)CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α和IFITM的轉(zhuǎn)錄，抑制IFN-α的轉(zhuǎn)錄。

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