摘要：[目的]驗(yàn)證ACT基因是否適用于文冠果種子發(fā)育的相關(guān)基因表達(dá)分析，并篩選出在文冠果基因表達(dá)分析中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。[方法]本研究采用了4種數(shù)學(xué)算法（△CT、BestKeeper、NormFinder、geNorm）評(píng)估12個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，并利用在線工具RefFinder綜合評(píng)價(jià)。[結(jié)果]在文冠果不同發(fā)育時(shí)期種子內(nèi)參基因綜合評(píng)分排名為PP2Agt; Tip41gt; EF-1agt; 18rgt; UCEgt;β-TUBgt; UBQgt;α-TUBgt; CYPgt; SAMgt;ACTgt; GADPH；在文冠果不同組織內(nèi)參基因綜合評(píng)分排名為PP2Agt; Tip41gt;CYPgt; 18rgt; UBQgt; SAMgt; EF-1αgt; UCEgt; GADPHgt; α-TUBgt; ACTgt;β-TUB。[結(jié)論]PP2A和Tip47基因是文冠果基因表達(dá)分析最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞：文冠果；內(nèi)參基因；基因表達(dá)；種子發(fā)育

中圖分類(lèi)號(hào)：S727.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2024）03-0079-07

文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge），又名黃角（Yellow horn），落葉灌木或小喬木，是無(wú)患子科文冠果屬的唯一植物，廣泛種植于我國(guó)三北地區(qū)，抗性強(qiáng)，尤其抗旱，是我國(guó)特有的觀賞、藥用及油用的高收入木本經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。文冠果種子富含油脂，種仁含油率達(dá)60%以上，不飽和脂肪酸組成高達(dá)92%，富含油酸（約30%）、亞油酸（約45%）以及在植物中極為罕見(jiàn)的神經(jīng)酸（約3%），是生產(chǎn)高品質(zhì)生物柴油和健康食用油的原料，具有優(yōu)秀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由此可見(jiàn)，研究文冠果種子不飽和脂肪酸的合成機(jī)制，對(duì)培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的文冠果品種具有現(xiàn)實(shí)意義。截止至今，已有文冠果種子發(fā)育轉(zhuǎn)錄組的文獻(xiàn)分析出一些重要的不飽和脂肪酸合成相關(guān)候選關(guān)鍵基因，探究這些基因在文冠果各組織，尤其不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)模式，尤為關(guān)鍵。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是大多數(shù)科學(xué)家常用的檢測(cè)基因表達(dá)豐度的可靠技術(shù)，具有高靈敏性、特異性、精確性，而一個(gè)可靠的內(nèi)參基因（RGs）是前提。內(nèi)參基因一般選擇在植物中穩(wěn)定表達(dá)的管家基因，常見(jiàn)的管家基因有actin（ACT）、糖醛酸-3-磷酸脫氫酶基因（GADPH）、延長(zhǎng)因子1a（EF-1a）、泛素酶基因（UBQ）、泛素結(jié)合酶基因（UCE）以及18S核糖體RNA（18S），然而這些基因的表達(dá)在不同物種的不同組織和其不同發(fā)育時(shí)期中的穩(wěn)定性有較大差異，需要深入研究。

大量關(guān)于文冠果基因表達(dá)的研究均采用actin作為內(nèi)參基因，王旭等通過(guò)對(duì)7個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性研究，發(fā)現(xiàn)UBQ和elF-4a為適用于性別分別相關(guān)基因的最優(yōu)內(nèi)參基因。然而，近年來(lái)神經(jīng)酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值被逐漸挖掘，其種子油脂合成與代謝相關(guān)基因的研究亟待深入，需要進(jìn)一步研究文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期的最適內(nèi)參基因需要被進(jìn)一步研究，以便提高其油脂合成與代謝相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)的準(zhǔn)確性?；诖?，本研究首先以SapBase數(shù)據(jù)庫(kù)中文冠果各組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（http：//www.sapindaceae.com/）中常見(jiàn)內(nèi)參基因的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)作為依據(jù)，挑選12個(gè)在各組織表達(dá)量較穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因；采用qRT-PCR法測(cè)試這12個(gè)候選內(nèi)參基因在文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的表達(dá)水平C。值；利用4種常見(jiàn)的評(píng)估內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性的數(shù)學(xué)算法評(píng)價(jià)這12個(gè)候選內(nèi)參基因在文冠果不同組織和種子發(fā)育不同時(shí)期中的穩(wěn)定性，隨即利用在線工具RefFinder對(duì)這12個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行綜合排名選出最佳內(nèi)參基因。最后，以超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成關(guān)鍵酶3-酮酯酰-CoA合酶（KCS）基因驗(yàn)證選擇的最佳內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，本研究旨在選擇穩(wěn)定、可靠的文冠果內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

文冠果成熟實(shí)生苗（五年生以上）生長(zhǎng)于內(nèi)蒙古通遼市開(kāi)魯縣（43°32＇N，120°30＇E），林間正常管理。文冠果根、莖、葉、花采集于5月10日，種皮采集于6月7日，不同發(fā)育時(shí)期種子胚乳分別采集于6月18日（謝花后第30 d，30DAP），6月26日（38 DAP），7月3日（45DAP），7月11日（53 DAP），7月21日（63DAP），采集年份均為2022年，5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期種子胚乳形態(tài)特征見(jiàn)圖1。每種文冠果組織采集生物學(xué)重復(fù)樣品3份。

1.2 RNA提取和cDNA鏈合成

文冠果各植物組織的提取方法參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)，經(jīng)過(guò)降解酶RQ1 RNase-Free DNase（Promega，美國(guó)）降解殘留的基因組DNA后，以1Ug RNA為模板，利用GoScriptTM Reverse TranscriptionSystem（Promega，美國(guó)）試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，稀釋10倍后凍于-20℃待用

1.3 候選內(nèi)參基因選擇和熒光定量引物設(shè)計(jì)

參照SapBase數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.sapinda-ceae.com/）中文冠果各組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRA編號(hào)：SRP304628），選擇在各組織表達(dá)量較穩(wěn)定的12個(gè)內(nèi)參基因作為候選，同時(shí)以超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成關(guān)鍵酶3-酮酯酰-CoA合酶（KCS）基因作為驗(yàn)證基因，基因編號(hào)均來(lái)源于SapBase數(shù)據(jù)庫(kù)。熒光定量PCR（qRT-PCR）引物由軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，引物信息列于表1。擴(kuò)增序列均測(cè)序檢驗(yàn)其正確性。

1.4 熒光定量PCR程序和數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR由ABI StepOne7000（美國(guó)）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀完成，反應(yīng)體系為30.0 pL，包括SYBRqPCRSuperMix15.0μL，上游引物（10.0pmoI·L-1）1.0 μL，下游引物（10.0μmoL·L-1）1.0μL，ROX 0.5 μL，ddH2O 12.5 μL。反應(yīng)采用三步法，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 10s，60℃ 20 s．72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 20 s，1個(gè)循環(huán)。熔解曲線在65～95℃間獲得以驗(yàn)證引物的特異性。引物的擴(kuò)增效率和線性相關(guān)系數(shù)由cDNA按5個(gè)稀釋倍數(shù)（1、10-1、10-2、10-3、10-4）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。

4種常見(jiàn)的評(píng)估內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性的數(shù)學(xué)算法ΔCT、Best-Keeper、geNorm及NormFinder用于評(píng)價(jià)12個(gè)候選內(nèi)參基因在文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的穩(wěn)定性。最后利用在線工具RefFinder（http：//150.216.56.64/referencegene）綜合排名。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增效率和引物特異性分析

所有樣品RNA均利用Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀測(cè)試RNA濃度和完整性，樣本RNA濃度分布于128.5～433.9 ng·μL-1，RIN值均大于7.0，瓊脂糖電泳檢測(cè)均顯示有明顯的28S和18S條帶，RNA質(zhì)量達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。12個(gè)候選內(nèi)參基因的基因名稱、SapBase編號(hào)、引物序列、擴(kuò)增長(zhǎng)度、擴(kuò)增效率、相關(guān)系數(shù)及Cq平均值均列于表1。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在107 bp（GADPH）～256 bp（UCE），擴(kuò)增效率在98.23%（GADPH）～101.35%（β-TUB）。12個(gè)候選內(nèi)參基因熔解曲線均為單一峰（圖2），表明無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增發(fā)生。

2.2 候選內(nèi)參基因表達(dá)譜

qRT-PCR法得到12個(gè)候選內(nèi)參基因在文冠果不同組織和不同種子發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)水平Cq值，Cq值越小，基因表達(dá)量越高。這些內(nèi)參基因C。值在文冠果各個(gè)組織有較大差異。這所有檢測(cè)的組織中，PP2A平均C。值最高27.39，分布于25.47～28.69；ACT平均Cq值最低21.51，分布18.69～23.65（表1，圖3）。這12個(gè)候選內(nèi)參基因的變異系數(shù)分別為7.18% （ACT）、3.01%（UBQ）、4.54%（UCE）、3.24%（18r）、6.64%（GADPH）、4.56%（EF-1α）、8.84%（β-TUB）、10.68% （α-TUB）、4.13% （PP2A）、3.87% （Tip41）、9.60%（SAM）、3.11%（CYP）。

2.3 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

常見(jiàn)的內(nèi)參基因穩(wěn)定性算法有ACT、BestKeeper、NormFinder以及GeNorm。這4種算法中，ACT法是根據(jù)Cq值的標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值來(lái)評(píng)價(jià)，標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值越低的內(nèi)參基因，穩(wěn)定性越強(qiáng)；BestKeeper算法是根據(jù)Cq值的變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值聯(lián)合評(píng)價(jià)，變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值越低，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越強(qiáng)；NormFinder和GeNorm算法均根據(jù)平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)計(jì)算，表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)與內(nèi)參基因的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)。

上述4種內(nèi)參基因穩(wěn)定性算法用于評(píng)價(jià)12個(gè)候選內(nèi)參基因在文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的穩(wěn)定性。如表2所示，根據(jù)AC-r和BestKeeper算法分析，PP2A和Tip41在文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中穩(wěn)定性均為最優(yōu)，NormFinder和GeNorm算法分析的最優(yōu)結(jié)果與△CT和BestKeeper算法不同，但PP2A和Tip41均在排名前四的行列。在文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期中，所有算法均顯示ACT和GADPH為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在不同組織中，所有算法均顯示ACT和β-TUB為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

在線工具RefFinder根據(jù)4種數(shù)學(xué)算法的排名綜合評(píng)價(jià)這12個(gè)候選內(nèi)參的穩(wěn)定性。結(jié)果如表2所示，在文冠果不同發(fā)育時(shí)期種子內(nèi)參基因綜合評(píng)分排名為PP2Agt;Tip41gt; EF-1agt; 18rgt; UCEgt;β-TUBgt; UBQgt; α-TUBgt; CYPgt; SAMgt; ACTgt;GADPH;在文冠果不同組織內(nèi)參基因綜合評(píng)分排名為PP2Agt;Tip41gt;CYPgt; 18rgt; UBQgt; SAMgt;EF-1αgt; UCEgt; GADPHgt; α-TUBgt; ACTgt;β-TUB。PP2A和Tip41在文冠果不同發(fā)育時(shí)期種子和不同組織中的排名均為最高，表明為最合適的內(nèi)參基因。

2.4 驗(yàn)證挑選的內(nèi)參基因

為了評(píng)估上述選擇的最優(yōu)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，本研究以選擇的最優(yōu)內(nèi)參基因PP2A和Tip41及文獻(xiàn)中最常用的ACT作為后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因，利用qRT-PCR法計(jì)算種子高表達(dá)目標(biāo)基因KCS在文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的表達(dá)水平。結(jié)果如圖4所示，以PP2A和Tip41作為內(nèi)參基因達(dá)到大致相同的KCS表達(dá)模式（圖4A、B）。KCS主要在種子發(fā)育期38～53 DAP高表達(dá)。在除了種子外的其他組織中，在種皮中幾乎不表達(dá)，不參與計(jì)算，在花中高表達(dá)，然而，當(dāng)采用ACT作為內(nèi)參基因時(shí)，其表達(dá)模式有所不同（圖4C）。在以PP2A和Tip41作為內(nèi)參基因時(shí)，KCS基因在種子發(fā)育30 DAP的表達(dá)最低，作為標(biāo)準(zhǔn)值“1”，在莖的表達(dá)量高于葉片；而以ACT作為內(nèi)參基因在根中的表達(dá)量最低，且在葉片中的表達(dá)量高于莖。在不同發(fā)育時(shí)期種子中，KCS基因以PP2A和Tip41作為內(nèi)參基因計(jì)算時(shí)，種子發(fā)育63 DAP的表達(dá)量高于30 DAP，而以ACT作為內(nèi)參基因時(shí)相反。上述結(jié)果表明，以不同穩(wěn)定性的內(nèi)參基因計(jì)算得到的組織特異性表達(dá)分析結(jié)果有所不同。由此可見(jiàn)，選擇可靠穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)RT-PCR實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度非常重要。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）技術(shù)因其具有高靈敏性、特異性、精確性等特點(diǎn)，是分析基因表達(dá)水平和核酸含量的應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。不同物種之間沒(méi)有固定的內(nèi)參基因，例如常用的內(nèi)參基因ACT、GADPH、UBQ等在不同植物物種的不同組織的不同發(fā)育時(shí)期可表現(xiàn)出表達(dá)差異。由此可見(jiàn)，為特定植物的特定組織發(fā)育的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)選擇可靠的內(nèi)參基因極為必要。

文冠果油是在植物種油中極為罕見(jiàn)的含有神經(jīng)酸的木本油料來(lái)源，大量文獻(xiàn)均以內(nèi)參基因ACT作為文冠果基因表達(dá)分析的唯一內(nèi)參基因，其穩(wěn)定性是否適宜文冠果種子發(fā)育中相關(guān)基因的表達(dá)分析未有確定。本研究選擇了12個(gè)常見(jiàn)且表達(dá)較為穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因，利用4種數(shù)學(xué)算法（ΔC-r、BestKeeper、NormFinder、geNorm）評(píng)估它們?cè)谖墓诠N子發(fā)育過(guò)程中和不同組織中的穩(wěn)定性，同時(shí)采用網(wǎng)絡(luò)在線工具RefFinder綜合這4種算法的結(jié)果并排名。

PP2A和Tip41在文冠果不同發(fā)育時(shí)期種子和不同組織中的排名均為最高，為本研究的最適內(nèi)參基因，而UBQ和Tip41是油用牡丹（PaeoniaostiiT．Hong et J．X．Zhang）種子發(fā)育過(guò)程中的最適內(nèi)參基因，PP2A排名中游；UBCE2是草果（Amomum tsaoko Crevost et Lemarie）種子發(fā)育的最適內(nèi)參基因；UCE、RPS13和RPII是美藤果（Plukenetia volubilisL．）種子發(fā)育最適內(nèi)參基因。以上結(jié)果表明不同物種不同發(fā)育組織最適內(nèi)參基因大部分均不相同，值得研究。最為關(guān)鍵的是本研究結(jié)論中的最適內(nèi)參基因與前期大部分研究報(bào)道所使用的并不一致，前期大量研究均采用ACT基因作為文冠果基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，而本研究結(jié)果表明ACT基因在文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中內(nèi)參穩(wěn)定性排名較差，并不適合用于基因表達(dá)的研究，同時(shí)王旭等研究也表明ACT基因不是研究文冠果性別分化和不同組織的最適內(nèi)參基因，且排名同樣靠后。據(jù)此，本研究最重要的意義是更正用于文冠果基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，以期獲得更準(zhǔn)確的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)4種數(shù)學(xué)算法（ACT、BestKeeper、NormFinder、geNorm）對(duì)文冠果12個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性和有效性的評(píng)估，發(fā)現(xiàn)PP2A和Tip41基因在文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中穩(wěn)定表達(dá)，是文冠果基因表達(dá)分析最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。本研究為文冠果qRT-PCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化提供了有效依據(jù)。

（責(zé)任編輯：張研）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31870594）和西北農(nóng)林科技大學(xué)高層次人才科研經(jīng)費(fèi)