摘要：研究山藥多糖（Dioscorea opposita Thunb. polysaccharides，DTPs）對運動疲勞小鼠的抗疲勞作用及作用機制。采用力竭游泳結(jié)合疲勞轉(zhuǎn)棒方法建立小鼠運動疲勞模型，分析小鼠力竭游泳時間和體重變化、疲勞代謝產(chǎn)物積累、相關(guān)酶活力水平、肝臟組織結(jié)構(gòu)和肌肝糖原變化。結(jié)果表明：山藥多糖能顯著延長小鼠力竭游泳時間，減輕小鼠體重下降和肝臟損傷，顯著降低血清乳酸（LD）、尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）含量并顯著提高超氧化物歧化酶（SOD）活力及肌糖原（MuG）和肝糖原（LG）含量，同時顯著降低谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平；此外，給藥組顯著上調(diào)骨骼肌中磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）mRNA表達、顯著降低蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）和糖原合成酶激酶-3（Glycogen synthase kinase-3 beta，Gsk-3β）的表達。綜上，山藥多糖能減少代謝產(chǎn)物積累、通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/Gsk-3β通路促進糖原合成來改善運動疲勞。

關(guān)鍵詞：山藥多糖；抗運動疲勞；力竭游泳；PI3K/AKT/Gsk-3β通路

中圖分類號：R96文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1002-4026（2024）06-0051-08

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

運動疲勞是指在長時間運動下，機體因產(chǎn)生疲勞感而不能維持既定的運動狀態(tài)[1]，是中樞和外周相互作用的結(jié)果，外部因素包括能量的過度消耗、代謝產(chǎn)物累積、免疫系統(tǒng)功能障礙以及活性氧的過度產(chǎn)生[2-3]等，對機體生理反應(yīng)及心理疾病存在巨大影響[4]。功能性食品不僅可以提供基礎(chǔ)營養(yǎng)，還可以預(yù)防或輔助治療疾病[5]。

山藥（Dioscorea opposita Thunb.）是薯蕷科植物的干燥根莖，含有豐富的多糖、微量元素、游離氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[6]，作為一種常見的藥食同源中藥材，具有顯著的抗疲勞作用[7]。山藥多糖是其主要成分之一，現(xiàn)有文獻報道，多糖類成分有調(diào)節(jié)能量代謝、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種功效[8-9]，此外，還可有效緩解運動疲勞[8]，但其作用機制尚不明確。

PI3K/AKT通路能夠促進代謝、增值、細胞存活、生長和血管生成，通過磷酸化多酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞功能的作用。糖原合成激酶3β是PI3K/AKT通路中AKT的重要底物。PI3K/AKT通路可以通過調(diào)節(jié)糖原合成的關(guān)鍵蛋白糖原合成酶激酶-3β以調(diào)節(jié)機體糖原的儲存，促進糖原合成。崔愷等[10]研究發(fā)現(xiàn)，潞黨參顯著性提高了疲勞小鼠骨骼肌及肝臟中PI3K、AKT、Gsk-3β、GS的蛋白表達，升高糖原合成從而提高運動耐力，緩解運動性疲勞。王祥山等[11]研究表明鹿鞭可以調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路增加小鼠能源物質(zhì)的儲存量以增加腎陰虛及腎陽虛小鼠體力。因此，PI3K/AKT/Gsk-3β通路在運動疲勞中有重要作用，山藥多糖是否通過PI3K/AKT/Gsk-3β通路發(fā)揮作用尚不清楚，本研究擬通過構(gòu)建小鼠疲勞模型，研究山藥多糖抗運動疲勞作用及其對PI3K/AKT/Gsk-3β通路的影響，旨在闡釋山藥多糖抗運動疲勞作用機制，為山藥多糖作為抗運動疲勞的食品補充劑或功能性食品提供理論參考依據(jù)。

山東科學(xué)2024年第6期曾婷，等：基于PI3K/AKT/Gsk-3β通路研究山藥多糖對運動疲勞小鼠的影響1儀器與材料

1.1實驗動物

昆明小鼠40只，21～24 g，雄性，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（京）2021-001，飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境，溫度（23±2） ℃，濕度50%～60%，12 h晝夜交替，實驗前將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝食攝水。動物實驗方案經(jīng)過山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心動物倫理委員會審查，審查批件號為SDUTCM20231007921。

1.2藥物與試劑

山藥多糖（課題組自提）；鹽酸帕羅西汀片（浙江華海藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20031106）；尿素氮（BUN，貨號C013-2-1）、糖原（GS，貨號A043-1-1）、超氧化物歧化酶（SOD，貨號A001-3）、乳酸（LD，貨號A019-2-1）、乳酸脫氫酶（LDH，貨號A020-2）、蛋白質(zhì)定量（TP，貨號A045-4）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT，貨號C010-2-1）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Trizol總RNA抽提試劑（碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號R0016）；定量PCR專用反轉(zhuǎn)錄試劑（產(chǎn)品編號RR047A）、高特異性qPCR試劑（產(chǎn)品編號RR820A）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3主要儀器

酶標(biāo)儀（SPecteaMax M2，美谷分子儀器上海有限公司）、研磨儀（Precellys Evolutions，妙生科技有限公司）、疲勞旋轉(zhuǎn)棒測定儀（ZB-200，成都泰盟科技有限公司）、超微量分光光度計（29061711，SimPliNano，思拓凡生物科技杭州有限公司）。

1.4實驗內(nèi)容

1.4.1山藥多糖提取及測定

參照葉美芝等[12]的方法并進一步優(yōu)化，取山藥切片烘干粉碎過80目篩提取多糖，具體操作：稱取80 g山藥粉，加入2 000 mL蒸餾水，在65 ℃、100 W條件下超聲90 min，每10 min攪拌1次，4 000 r/min離心取上清液濃縮至體積的1/10，醇沉24 h抽濾取醇沉物加入三氯乙酸4 ℃放置12 h去除蛋白，離心取上清液醇沉24 h，取醇沉物用蒸餾水溶解，透析48 h，真空干燥，得到山藥多糖。經(jīng)紫外分光光度法測定山藥多糖。

1.4.2動物分組及造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)后對小鼠進行游泳和轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練，篩選出運動水平相近的小鼠40只，隨機分為空白組（CG，等體積生理鹽水灌胃）、模型組（MG，等體積生理鹽水灌胃）、山藥多糖低劑量組（DTP-L，400 mg/kg）、山藥多糖高劑量組（DTP-H，800 mg/kg）[13]、陽性藥鹽酸帕羅西汀組（PG，3 mg/kg）。

參照Zhang等[14]的方法，進行疲勞模型的建立及評價：①力竭游泳，置小鼠于玻璃圓缸中（12 cm×40 cm），水深不少于30 cm，水溫（25.0±1.0） ℃，在小鼠尾部中下1/3處綁定重量為其體重5%的鉛皮進行游泳，直至鼠鼻浸沒水面下10 s未出水面時，記錄時間為力竭游泳時間；②疲勞轉(zhuǎn)棒，將小鼠放于轉(zhuǎn)速為25 r/min的疲勞轉(zhuǎn)棒儀上，記錄小鼠棒上的活動時間。每天上午力竭游泳，下午疲勞轉(zhuǎn)棒，造模1周后開始給藥，連續(xù)給藥3周，給藥組給藥30 min后進行力竭游泳。小鼠運動疲勞模型的建立根據(jù)小鼠力竭游泳時間長短來進行評價。

1.4.3樣本采集及檢測

小鼠最后一次給藥及游泳后，取小鼠外周血、肝臟、肌肉等樣品。全血室溫靜置1 h，以3 000 r/min離心20 min分離血清，于-80 ℃凍存?zhèn)溆茫蝗?%多聚甲醛固定肝臟組織用于HE染色。參照相應(yīng)試劑盒說明書測定血清LD、LDH、BUN、SOD水平，肝臟肌肉糖原含量及肝組織中AST活力。

1.4.4RT-qPCR法測基因相對表達水平

測定小鼠骨骼肌中PI3K、AKT、Gsk-3β與β肌動蛋白的相對表達量，基因序列見表1。

1.4.5統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraPhPad Prism 8統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組比較采用單因素方差分析和Dunnett多重比較檢驗，計量資料以X±S表示，Plt;0.05代表有顯著性差異，Plt;0.01代表有極顯著性差異。

2實驗結(jié)果

2.1山藥多糖對小鼠力竭游泳和體重的影響

如圖1所示，與CG組相比，MG組的力竭游泳時間顯著性減少（Plt;0.01）；與MG組比較，DTP-L組和DTP-H小鼠游泳時間顯著性提高（Plt;0.01，Plt;0.05），分別提高50.7%、21.1%。與CG組比較，MG組體重顯著性降低（Plt;0.01）；與MG組相比，DTP-L組可提高小鼠體重10.3%（Plt;0.05），DTP-H組有提高小鼠體重的趨勢，但沒有顯著性差異。

2.2山藥多糖對小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

對肝臟組織進行HE染色，結(jié)果如圖2所示，CG組肝臟組織中央靜脈周圍少量肝細胞水樣變性，胞質(zhì)疏松淡染，未見組織明顯腫脹，無明顯出血；MG小鼠肝臟組織可見彌漫性肝細胞水樣變性，胞質(zhì)疏松淡染，少量中央靜脈周圍可見少量肝細胞壞死，伴少量淋巴細胞浸潤，表明小鼠肝臟組織受到損傷，而DTP-L、DTP-H和PG組小鼠肝臟切片中并未有肝細胞壞死和淋巴細胞的浸潤，說明肝臟損傷得到修復(fù)，如表2和圖2。

2.3山藥多糖對小鼠BUN、LD、LDH濃度的影響

結(jié)果如圖3所示，與CG組相比，MG組血清BUN濃度顯著性升高（Plt;0.01），與MG組相比，DTP-L血清中BUN濃度減少28.4%（Plt;0.01），DTP-H血清中BUN濃度減少20.2%（Plt;0.01），PG血清中BUN濃度減少44.2%（Plt;0.01）；與CG組相比，MG組血清LD濃度顯著性升高（Plt;0.01），與MG組相比，DTP-H組濃度顯著降低29.7%（Plt;00.01）；與CG組相比，MG血清LDH活性升高，與MG組相比，DTP-H組LDH活力顯著降低了27%（Plt;0.01），PG組顯著性降低了62.8%（Plt;0.01）。

2.4山藥多糖對小鼠LG、MuG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

如圖4所示，與CG組相比，MG組LG顯著性升高，與MG組相比，DTP-L 肝臟中的LG質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了10.4%（Plt;0.05）；與CG組相比，MuG組LG升高，與MG組相比，DTP-L組和DTP-H組肌肉組織中MuG質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于MG組，分別提高了50.2%和46.3%（Plt;0.01）。

2.5山藥多糖對小鼠AST、SOD的影響

如圖5所示，與CG組相比， MG組血清SOD活力顯著性降低（Plt;0.01），與MG相比，DTP-L組和DTP-H組血清中SOD活力顯著升高（Plt;0.01）；與CG組相比，MG組AST水平顯著性升高（Plt;0.01），與MG相比，DTP-L組、DTP-H組和PG組肝組織中AST水平顯著性降低（Plt;0.01）。

2.6山藥多糖對糖原合成相關(guān)基因表達水平的影響

如圖6所示，與CG組相比， MG組小鼠骨骼肌中PI3K的mRNA顯著性降低，AKT、Gsk-3β的mRNA顯著性升高；與MG組相比，DTP-L、DTP-H、PG組小鼠骨骼肌中PI3K的mRNA表達水平顯著升高、ATK的mRNA表達水平顯著性降低，DTP-L、DTP-H組中Gsk-3β的mRNA表達水平顯著降低。

3討論與結(jié)論

目前，治療運動疲勞的藥物大多數(shù)含有類似興奮劑的成分，如麻黃堿、咖啡因等，通常會對心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生危害，且易發(fā)生藥物依賴[15]。藥食同源物質(zhì)是指既是食品又是中藥材的物質(zhì)，作為已有千年臨床用藥歷史且已被證明安全無毒的中藥，從中篩選和開發(fā)具有功效作用、長期食用無毒副作用的產(chǎn)品具有得天獨厚的優(yōu)勢。以絞股藍、鐵皮石斛為主要原料的石蘭牌鐵皮石斛絞股藍膠囊（國食健注G20041158）具有增加免疫力、緩解體力疲勞的作用，濟公緣牌鐵皮石斛西洋參浸膏（國食健注G20100554）具有增強免疫力功能等[16]；復(fù)方的藥食同源產(chǎn)品也獨具特色，如市場中的“八珍糕”原方即出自明代陳實功《外科正宗》，有健脾養(yǎng)胃之效[17]；將民間習(xí)用的健脾理濕食養(yǎng)方（四神湯）和黑芝麻結(jié)合研發(fā)一抗復(fù)方四神蒸糕，能健脾助運、化濕行滯[18]。

山藥是歷史悠久的藥食兩用中藥，山藥多糖是其重要功效成分，有研究表明，給癌癥相關(guān)疲勞小鼠灌胃山藥多糖后增加了小鼠力竭游泳時間，提高了腓腸肌中糖原含量和SOD活性，降低肌肉中IL-lβ、MDA、BUN和LDH的水平，同時減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和提高能量補充來改善癌癥相關(guān)性疲勞[9]。運動疲勞的產(chǎn)生會伴隨一系列生物標(biāo)志物的發(fā)生與變化，如BUN、LD、LDH、LG、MuG，當(dāng)運動強度增加時，身體從碳水化合物和脂肪獲得的能量不足，于是蛋白質(zhì)和氨基酸即成為代謝分解代償能量需求的替代來源，從而導(dǎo)致BUN的增加，同時，肌肉通過無氧糖酵解獲取足夠的能量時，會產(chǎn)生大量的LD[19]。LD和BUN含量與運動疲勞成正相關(guān)系，其消除的越快運動疲勞緩解的也越快[20]。LDH是一種催化丙酮酸和乳酸相互轉(zhuǎn)化的酶，在缺氧條件下清除乳酸和提供能量方面發(fā)揮著重要作用，LDH的升高是反映高強度運動誘導(dǎo)的細胞損傷和肌肉損傷程度的關(guān)鍵指標(biāo)[20]。此外，運動疲勞可引起肝損傷[21]，肝臟是能量儲存和利用能量的直接組織，LD在肝臟中轉(zhuǎn)化為糖原然后釋放到血液中，運動所需的能量最初來自糖原分解，后來自肝臟釋放循環(huán)糖原和非酯化脂肪酸，因此LG儲備的增加有助于耐力和運動能力提高[22]。MuG是一種儲存在肌肉組織中的能量物質(zhì)，可立即用于分解代謝，其儲存量的增加有助于在短期運動后及時為機體提供能量[23]。在本研究中，與模型組比較，DTP治療后LDH活力顯著降低，給藥組MuG和LG顯著性升高，表明補充DTP可以減輕運動疲勞引起的細胞和肌肉損傷，提高糖原的能量儲備與供應(yīng)；疲勞使小鼠肝臟組織中AST明顯高于空白組，組織學(xué)結(jié)果顯示模型小鼠肝組織中見彌漫性肝細胞水樣變性，少量中央靜脈周圍有少量肝細胞壞死，伴淋巴細胞浸潤，在給予DTP后以上肝損傷表現(xiàn)均得到了改善；同時，DTP顯著性提高SOD活力，從而及時消除運動疲勞引起的氧化和過氧化失衡，保護機體免受自由基損傷。

力竭游泳是建立疲勞模型和評價疲勞程度的常用方法，Nipate[24]每天實驗前1 h對小鼠進行灌胃，并連續(xù)21 d強迫小鼠游泳10 min建立模型，徐小珊等[25]采用慢性束縛與力竭游泳交替的方式，進行為期21 d的復(fù)合應(yīng)激造模。本實驗在力竭游泳的基礎(chǔ)上增加了疲勞轉(zhuǎn)棒，促使小鼠疲勞程度加深，給藥后發(fā)現(xiàn)DTP延長了疲勞小鼠力竭游泳時間，表明DTP干預(yù)可以有效提高小鼠運動耐力發(fā)揮抗疲勞作用。

PI3K/AKT/Gsk-3β通路可對營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的變化做出反應(yīng)，該通路通過調(diào)節(jié)糖原合成的關(guān)鍵蛋白Gsk-3β以促進糖原合成來提高糖原儲存[26]，為身體提供能量，即AKT是廣泛細胞功能重要信號中心的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，依賴PI3K激活的AKT參與細胞增殖、血管生成、衰老、凋亡和細胞存活的幾種下游途徑的活性，激活的AKT能磷酸化Gsk-3β，使其活性受到抑制，解除Gsk-3β對糖原合成酶（GS）的抑制，促進糖原生成[10，27]。在本研究中，山藥多糖通過上調(diào)PI3K和下調(diào)AKT、Gsk-3β mRNA表達來促進糖原的產(chǎn)生，這與Yu等[28]研究的山楂多酚微膠囊通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/Gsk-3β途徑提供能量發(fā)揮抗疲勞作用的結(jié)果一致。

綜上所述，山藥多糖通過延長小鼠游泳時間、減輕體重降低、減少疲勞代謝產(chǎn)物積累、提高肌肝糖原含量、增強血清超氧化物歧化酶活力和保護肝臟抗運動疲勞。此外，RT-qPCR結(jié)果表明，山藥多糖可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/Gsk-3β促進糖原合成來發(fā)揮抗運動疲勞作用，這為進一步開發(fā)山藥多糖提供科學(xué)依據(jù)和支撐。

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