摘要：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對接技術(shù)探討西洋參抗衰老的潛在有效成分及其作用機(jī)制。利用斑馬魚衰老模型評價(jià)西洋參的抗衰老活性；使用數(shù)據(jù)庫篩選出西洋參活性成分及其與抗衰老相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，并繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），篩選核心靶點(diǎn)；對核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析和分子對接驗(yàn)證。SA-β-Gal染色結(jié)果表明西洋參具有顯著的抗衰老活性。數(shù)據(jù)庫篩選出西洋參活性成分11個(gè)，抗衰老的潛在核心靶點(diǎn)AKT1、STAT3、JUN等53個(gè)。GO和KEGG分析的結(jié)果顯示西洋參的抗衰老作用可能涉及對外源刺激的反應(yīng)、凋亡過程負(fù)向調(diào)控、PI3K-AKT信號通路、ErbB信號通路等。分子對接結(jié)果顯示有效成分polyacetylene PQ-2和PQ-2與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合緊密，AKT1和HRAS與多種成分結(jié)合緊密。西洋參可能通過polyacetylene PQ-2和PQ-2等多種成分作用于AKT1、HRAS、MAPK1等多個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌抵抗、ErbB信號通路等多條通路發(fā)揮抗衰老作用，為西洋參在抗衰老應(yīng)用方面提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：西洋參；抗衰老；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；作用機(jī)制；斑馬魚模型

中圖分類號：R285文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-4026（2024）06-0042-09

衰老是一種復(fù)雜的自然現(xiàn)象，表現(xiàn)為持續(xù)的進(jìn)行性功能下降和慢性疾病風(fēng)險(xiǎn)增加。它受遺傳、免疫和環(huán)境等多因素的影響，是一個(gè)不可逆的過程[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球60歲以上人口占總?cè)丝诘?3.7%，該比例仍在繼續(xù)增長[2]。隨著老年人口基數(shù)的增長，衰老相關(guān)疾病發(fā)生的數(shù)量也在不斷增加，因此對老齡化過程潛在機(jī)制的挖掘，并找到有效的抗衰老治療干預(yù)措施具有重要的研究價(jià)值。衰老受免疫力降低、基礎(chǔ)代謝減慢、抗氧化相關(guān)酶的活性降低等多種生理過程的影響[3]。從抑制以上生物過程的角度出發(fā)，篩選出西洋參中潛在的抗衰老藥物。

中藥對于復(fù)雜病因的防治具有天然優(yōu)勢，其能夠通過單靶點(diǎn)疊加作用、多靶點(diǎn)協(xié)同作用及毒性分散效應(yīng)發(fā)揮藥效并削弱自身毒性[4]。西洋參屬于五加科植物，清朝吳儀洛所著《本草從新》中記載西洋參具有治療多痰、咳嗽、精神虛弱、身心疲勞等功效，對人的軀體補(bǔ)而不燥[5]。藥理研究表明，西洋參具有抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[6]。然而，關(guān)于西洋參抗衰老的活性及機(jī)制報(bào)道甚少。

中藥的成分繁多，研究有較大難度。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有將多成分、多通路和多靶點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)研究的特點(diǎn)，使得對中藥的研究更加便捷[7]，被越來越多地應(yīng)用于中藥藥理分析，為中醫(yī)問題的研究提供更基礎(chǔ)、更科學(xué)的解釋[8]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測西洋參抗衰老的潛在有效成分及靶點(diǎn)，并運(yùn)用分子對接技術(shù)分析了最佳結(jié)合位點(diǎn)。探討了西洋參抗衰老的主要成分和分子生物學(xué)機(jī)制，為后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1斑馬魚

實(shí)驗(yàn)所用的野生型AB品系斑馬魚由山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)由山東省科學(xué)院生物研究所動物倫理委員會審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號 SWS20220705 ）。斑馬魚養(yǎng)殖在28 ℃恒溫水循環(huán)系統(tǒng)中，明暗交替時(shí)間為14 h / 10 h，每天喂食兩次。于實(shí)驗(yàn)前一天，將雌雄斑馬魚放入交配缸的兩側(cè)，次日上午抽去隔板使其交配。1.5 h后，收集受精卵，并用胚胎培養(yǎng)水（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、 0.4 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L MgSO4 ）清洗3遍以去除雜質(zhì)。清潔后的胚胎放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中備用。

1.1.2藥物與試劑

西洋參干燥根，產(chǎn)地美國，由威海市文登區(qū)道地參業(yè)發(fā)展有限公司提供；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒（#C0602）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；過氧化氫叔丁醇（TBHP，#C13512156）購自上海麥克林生化股份有限公司；苯基硫脲（PTU，#BCBW4842）購自美國Sigma公司；4%多聚甲醛（PFA，#BL539A）購自白鯊生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，#SL33131901）購自北京酷來搏科技有限公司；無水乙醇（#10009218）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3儀器

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生科技有限公司）；恒溫光照培養(yǎng)箱（HPG280-BX，東聯(lián)電子技術(shù)有限公司）；Zoom V16體視熒光顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）；超聲波清洗機(jī)（SB-5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2方法

1.2.1西洋參提取物的獲取

將西洋參根研磨成粗粉末，精確稱取1 g粗粉末溶于8 mL的50%乙醇中。50 ℃超聲振蕩1 h后，過濾，濾液蒸干即得西洋參提取物。

1.2.2西洋參提取物的抗衰老活性評價(jià)

挑選受精后6 h（6 hpf）的健康斑馬魚胚胎置于12孔板中，每孔10條，設(shè)置空白組、模型組（TBHP， 500 μmol/L）和不同質(zhì)量濃度的西洋參提取物組（PQL.，12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L），加入3% PTU抑制斑馬魚黑色素的形成，各孔溶液體系為3 mL，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)在28 ℃恒溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)至受精后6 d（6 dpf），期間每兩天更換一次藥液。暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將斑馬魚用PBS清洗三遍后置于4% PFA中固定過夜。次日用PBS清洗三遍，利用β-半乳糖苷酶染色劑進(jìn)行染色，染色完成后用PBS清洗三遍，各組隨機(jī)選取10條斑馬魚置于Zoom V16體式顯微鏡下用32倍放大倍數(shù)采集圖像。使用Image Pro Plus 5.1對圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用GraphPad Prism 8.0.2對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3西洋參活性成分的篩選及作用靶點(diǎn)的獲取

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）檢索西洋參的化學(xué)成分，并設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，篩選出活性成分[9-10]。使用PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）檢索活性成分獲取作用靶點(diǎn)。最后，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）對收集到的作用靶點(diǎn)進(jìn)行名稱規(guī)范。

1.2.4衰老相關(guān)靶點(diǎn)的獲取及共有靶點(diǎn)的篩選

在GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM （https：//www.genecards.org）和DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）中，以“aging”為檢索詞篩選相關(guān)基因。在GeneCards中，優(yōu)先選擇Score值大的靶點(diǎn)。將結(jié)果進(jìn)行合并去重，獲取衰老相關(guān)靶點(diǎn)。將西洋參活性成分靶點(diǎn)和衰老靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖并獲取共有靶點(diǎn)。

1.2.5西洋參-衰老的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String（https：//string-db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，物種選擇“Homo sapiens”，設(shè)置medium confidencegt;0.4。將得到的PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入CytoScape 3.9.1軟件，用Centiscape 2.2功能對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算度值（degree）、介數(shù)中心性和接近中心性，選取度值、介數(shù)中心性和接近中心性高于相應(yīng)中值的目標(biāo)節(jié)點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.2.6GO分析與KEGG富集分析

利用David（https：//david.ncifcrf.gov/）對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析，物種選擇“人類”，設(shè)置Plt;0.05為篩選條件。GO分析包括生物過程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）和細(xì)胞成分（cellular component， CC）。使用Bioinformatics（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

1.2.7“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將西洋參活性成分、核心靶點(diǎn)、KEGG前20條通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.8分子對接

選擇degree值排序前6的核心靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)行分子對接。利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲得靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得活性成分配體的mol2結(jié)構(gòu)。使用AutoDockTools 1.5.7軟件對靶蛋白和配體進(jìn)行分子對接，使用PyMoL 2.5.5軟件對對接結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GraphPad Prism 8.3.0，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）對各組間差異的顯著性進(jìn)行分析（Plt;0.05具有顯著性差異）[11]。

2結(jié)果

2.1β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色

為了評價(jià)西洋參提取物的抗衰老活性，首先進(jìn)行了SA-β-Gal染色，結(jié)果如圖 1所示。與空白組相比，模型組斑馬魚的SA-β-Gal染色強(qiáng)度顯著上升，表明TBHP成功誘導(dǎo)了斑馬魚發(fā)生衰老；經(jīng)西洋參提取物處理后顯著降低，表明西洋參提取物具有顯著的抗衰老活性。

2.2西洋參活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測

從TCMSP網(wǎng)站中篩選出11種活性成分，見表 1。將PharmMapper和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中得到的11種成分的2 111個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重，獲得623個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3衰老相關(guān)靶點(diǎn)的獲取與篩選及共有靶點(diǎn)的篩選

將GeneCards、OMIM和DisGeNET獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重，并選擇Score值排序前3 000的靶點(diǎn)作為與衰老相關(guān)的靶點(diǎn)。將衰老相關(guān)靶點(diǎn)與西洋參活性成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1獲得263個(gè)交集靶點(diǎn)的韋恩圖。

2.4西洋參抗衰老的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫得到西洋參抗衰老潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，然后利用CytoScape 3.9.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。PPI網(wǎng)絡(luò)共有263節(jié)點(diǎn)和5 303條邊，利用Centiscape 2.2工具對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到degree值為40.327、CC為261.278和BC為0.002。將degree、BC和CC作為篩選條件，篩選得到53節(jié)點(diǎn)和995條邊，將這53個(gè)靶點(diǎn)作為西洋參抗衰老的核心靶點(diǎn)。其中，degree值排名前10的核心靶點(diǎn)為AKT1、STAT3、JUN、CASP3、ESR1、TNF、EGFR、ALB、MAPK3、MTOR。PPI網(wǎng)絡(luò)圖與核心靶點(diǎn)篩選過程圖詳見OSID開放科學(xué)與數(shù)據(jù)圖1。

2.5GO分析與KEGG富集分析

將核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。GO分析得到生物過程（biological process， BP）471個(gè)，細(xì)胞組成（cell component， CC）53個(gè)，分子功能（molecular function， MF）82個(gè)，分別選擇P值最小的前10條進(jìn)行可視化（圖2）。其中，生物過程涉及對外源刺激的反應(yīng)、凋亡過程負(fù)向調(diào)控等；細(xì)胞組成包括大分子復(fù)合物、線粒體等；分子功能主要涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等。這充分說明西洋參通過多種生物過程來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和分子功能，從而發(fā)揮抗衰老的活性。

為了探究西洋參抗衰老的信號通路機(jī)制，我們進(jìn)行了KEGG富集分析，共獲得155條結(jié)果，主要涉及PI3K-AKT信號通路、ErbB信號通路等。選擇P值最小的前20條信號通路進(jìn)行可視化（圖3）。

2.6“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

將西洋參活性成分、靶點(diǎn)和通路信息導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.1軟件中，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。按照degree值排名，得到西洋參在抗衰老方面的主要成分有罌粟堿、PQ-2、聚乙炔PQ-2、曼陀羅靈、殷金醇棕櫚酸酯、胡蘿卜苷_qt。degree值排名前6的靶點(diǎn)有MAPK1、AKT1、PIK3CA、MAPK3、HRAS、SRC。

2.7分子對接

分別將degree排名前6的活性成分與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，對接所需結(jié)合能如表2所示，結(jié)合能熱圖見圖5。將結(jié)合能小于-5 kcal/mol（1 kcal=4.184 kJ）的對接結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖6。各靶點(diǎn)在PDB數(shù)據(jù)庫的編號如下，AKT1（7NH5）、HRAS（3K8Y）、MAPK1 （3SA0）、MAPK3 （4QTB）、PIK3CA （7PG5）、SRC （2H8H）。

3討論

SA-β-Gal是廣泛使用的細(xì)胞衰老生物標(biāo)志物，衰老細(xì)胞內(nèi)的SA-β-Gal含量會明顯升高[12]。SA-β-Gal是一種在β-D-半乳糖苷中裂解β-D-半乳糖殘基的酶，這種酶積聚在衰老細(xì)胞的溶酶體區(qū)室中；X-Gal是一種與吲哚相連的半乳糖組成的無色可溶性化合物，SA-β-Gal在pH 6.0條件下水解X-Gal，于細(xì)胞培養(yǎng)物或組織中釋放出深藍(lán)色的不溶性產(chǎn)物，從而可以檢測衰老細(xì)胞[13]。我們利用斑馬魚實(shí)驗(yàn)證明了西洋參具有抗衰老活性。

通過對西洋參和衰老的交集靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選得到AKT1、STAT3、JUN、CASP3、TNF、EGFR、ALB等西洋參抗衰老的潛在核心靶點(diǎn)。AKT控制基本的細(xì)胞功能，包括增殖、凋亡、代謝和轉(zhuǎn)錄；AKT1是AKT的一個(gè)亞型，參與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)，對細(xì)胞周期進(jìn)程和調(diào)節(jié)產(chǎn)生多重影響[14]。STAT3是IL-6激活的急性期反應(yīng)因子（APRF）復(fù)合物的一個(gè)組成部分，在刺激肝臟先天免疫介質(zhì)的表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用[15]。JUN是AP-1轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)亞型，與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、炎癥和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[16]。半胱天冬酶（Caspases）參與細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥的信號通路；CASP3是半胱天冬酶主要的效應(yīng)子，對在細(xì)胞凋亡終末期裂解的大多數(shù)底物進(jìn)行蛋白水解[17]。TNF在許多細(xì)胞類型中激活促炎和應(yīng)激反應(yīng)信號；TNF-α是TNF家族的一員，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種有效的炎癥細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)復(fù)雜的免疫反應(yīng)，并具有抗癌作用[18]。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，參與控制細(xì)胞增殖和生長的信號通路，靶向EGFR酪氨酸激酶活化對神經(jīng)退行性疾病和腦損傷有治療作用[19]。ALB是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)，主要功能是調(diào)節(jié)血液的膠體滲透壓，是血漿中的主要鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[20]。由此推測，西洋參可能通過作用于這些靶點(diǎn)，對細(xì)胞增殖、生長和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而達(dá)到抗衰老的效果。

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)西洋參可能通過內(nèi)分泌抵抗通路、ErbB信號通路、PI3K-AKT信號通路等發(fā)揮抗衰老作用。虛弱與衰老過程密切相關(guān)，生理衰退會隨著虛弱加速；內(nèi)分泌系統(tǒng)是虛弱的關(guān)鍵系統(tǒng)之一，它與大腦、免疫系統(tǒng)和骨骼肌有著復(fù)雜的相互關(guān)系[21]。Nrg-ErbB信號對發(fā)育、成人和衰老大腦中的許多功能是必不可少的，Nrg和/或ErbB基因被破壞的小鼠顯示出與精神、發(fā)育和年齡相關(guān)的疾病[22]。PI3K/AKT通路與細(xì)胞增殖、葡萄糖代謝、細(xì)胞存活、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)合成有關(guān)，并且PI3K/AKT通路在實(shí)體瘤、免疫介導(dǎo)疾病、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病中表達(dá)不平衡[23]。由此推測，西洋參可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、細(xì)胞代謝和免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗衰老作用。

最后，分別將degree排名前六的靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對接，結(jié)合效果最好的靶點(diǎn)為AKT1和HRAS。AKT與細(xì)胞的增殖、存活和代謝有關(guān)，有研究表明敲除AKT會使小鼠的體型縮小、睪丸和胸腺中自發(fā)細(xì)胞凋亡增加[24]，并且AKT1過表達(dá)消除了miR-495誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和增殖抑制[25]。HRAS是RAS的一種亞型，參與RAS蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活；抑制HRAS會促進(jìn)靜止細(xì)胞向衰老過渡，阻止抑制可阻止衰老進(jìn)程[26]。分子對接的結(jié)果顯示西洋參活性成分可以與衰老靶點(diǎn)穩(wěn)定結(jié)合發(fā)揮抗衰老作用。

綜上所述，本研究通過SA-β-Gal染色、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和分子對接技術(shù)探究了西洋參抗衰老的活性、潛在有效成分及其作用機(jī)制。通過篩選核心靶點(diǎn)和對其進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)西洋參通過AKT、HRAS、PI3K-AKT信號通路等多靶點(diǎn)和多通路共同作用的方式發(fā)揮抗衰老效果，涉及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等生物過程。本文對西洋參抗衰老的機(jī)制研究為理論預(yù)測，缺乏具體的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，下一步將通過藥理實(shí)驗(yàn)等方法鑒定有效成分、驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)與通路，以期為實(shí)際應(yīng)用提供指導(dǎo)。

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