摘" "要" "為解決微型月季小伊甸園規(guī)?；瘮U繁以及利用細胞工程進行后續(xù)品種改良等問題，對其進行組織培養(yǎng)研究。結果表明，以帶芽莖段為外植體時，合適的滅菌方式為75%乙醇消毒30 s后升汞浸泡滅菌8 min;適合腋芽萌發(fā)誘導的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8;適合腋芽增殖繼代的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8;適宜生根的培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8;組培苗合適的移栽基質為蛭石，成活率達95%，且植株長勢良好。

關鍵詞" "微型月季;組織培養(yǎng);繼代增殖;生根誘導

月季（Rosa chinensis）為世界著名鮮切花，有極高的觀賞價值。在品種繁多的月季中，微型月季（Rosa chinensis minima）植株矮小、花色繁多，非常適合盆栽，市場價值巨大。傳統(tǒng)微型月季種苗多采用扦插進行生產，相關研究集中在插穗的篩選、扦插基質、激素處理等方面。由于微型月季植株矮小，莖節(jié)較短，因此剪取插穗的量受限，制約了規(guī)?；敝?。微型月季離體培養(yǎng)是解決其規(guī)?；敝硢栴}的可行方法。微型月季“小伊甸園”株形緊湊，葉片油亮，花形標準，花期長，關于其離體培養(yǎng)技術尚未見到相關報道。對微型月季的離體培養(yǎng)雖有一定研究，但不同基因型響應培養(yǎng)條件有一定特異性，有必要對“小伊甸園”進行離體培養(yǎng)研究。我們用帶芽莖段作為外植體，探究合適的消毒滅菌方式，而后進行腋芽萌發(fā)誘導，隨后進行繼代增殖和生根誘導，進一步進行移栽種植，完善了“小伊甸園”組織培養(yǎng)體系，為種苗規(guī)?；a以及遺傳轉化研究奠定基礎。

1" "材料與方法

1.1" "試驗材料" "選擇無病蟲害、生長良好的“小伊甸園”植株，取半木質化中段枝條為外植體，去掉葉片，剪成帶1個芽的莖段，洗去表面污漬，沖洗干凈后吸干水分，置于培養(yǎng)瓶中備用。

1.2" "試驗方法

1.2.1" "外植體消毒滅菌處理" "將清洗好的莖段外植體用升汞（0.1% HgCl2溶液）浸泡滅菌（浸泡時間梯度設置為3、5、8、12 min），無菌水沖洗6次，洗去殘余升汞，避免對外植體持續(xù)毒害，即得到滅菌后的莖段外植體（處理編號為A1-A4）。同時將清洗好的莖段外植體采用75%乙醇浸泡消毒（浸泡時間30 s），無菌水沖洗3次，再用升汞滅菌（浸泡時間梯度設置為3、5、8、12 min），最后用無菌水沖洗6次，得到無菌外植體（處理編號為A5-A8）。

外植體消毒滅菌后接種至培養(yǎng)基（MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）進行培養(yǎng)。接種2周后統(tǒng)計污染率（污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%）和褐化率（褐化率=褐化外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%），綜合得到合適的滅菌條件。

1.2.2" "腋芽萌發(fā)誘導" "利用1.2.1中篩選得到的合適滅菌條件進行莖段外植體滅菌，得到無菌莖段外植體，然后以形態(tài)學上端向上接種至含有不同濃度6-BA、NAA和GA3的MS培養(yǎng)基（培養(yǎng)基設定為：MS+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6 g/L，pH 5.8）中，進行腋芽萌發(fā)誘導試驗。

腋芽萌發(fā)誘導培養(yǎng)基中的激素組合編號及濃度分別為：

B1：6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 1 mg/L;

B2：6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3 mg/L;

B3：6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3 mg/L;

B4：6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3 mg/L。

接種3周后統(tǒng)計腋芽萌發(fā)率（萌發(fā)率=萌發(fā)外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%），同時測量腋芽高度。

1.2.3" "叢生芽繼代增殖" "將萌發(fā)的腋芽切下接種于繼代增殖培養(yǎng)基（培養(yǎng)基設定為：MS+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6 g/L，pH 5.8）中，進行繼代增殖誘導得到叢生芽。激素濃度組合編號及濃度分別為：

C1：1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;

C2：2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;

C3：3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;

C4：1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA;

C5：2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA;

C6：3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

培養(yǎng)4周后統(tǒng)計增殖倍數(shù)和株高。

1.2.4" "生根誘導" "以1.2.3中增殖的叢生芽為外植體，待其長至2～3 cm時，切割成單苗轉接到生根培養(yǎng)基（培養(yǎng)基設定為：基本培養(yǎng)基+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8）上誘導生根?；九囵B(yǎng)基及激素濃度組合編號及濃度分別為：

D1：MS+IBA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L;

D2：MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;

D3：MS+IBA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L;

D4：1/2MS+IBA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L;

D5：1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;

D6：1/2MS+IBA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L。

生根培養(yǎng)6周后統(tǒng)計生根率（生根率=生根外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%），隨后將生根苗從培養(yǎng)瓶中取出，清洗干凈瓊脂，后統(tǒng)計測量平均生根數(shù)、平均根長及株高。

以上除特別說明外，各處理均在培養(yǎng)室內培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度控制在25±2 ℃，空氣濕度控制在60%～70%，光照強度為2 000～3 000 lx，光照周期為12 h/d。

1.2.5" "組培苗移栽" "當組培苗在生根培養(yǎng)基中長至3～4 cm高，有兩條以上正常根時，可進行煉苗移栽試驗。先將組培瓶置于非恒溫環(huán)境、自然光照條件下煉苗2 d，后打開瓶蓋煉苗7 d，其間不定時觀察并噴水保濕。之后將長勢基本一致的試管苗取出，洗凈殘留瓊脂，移入基質中，基質設定為沙子、蛭石、園土與木屑1︰1混合基質3種類型。組培苗移栽后置于溫室中，初期每天少量多次噴水保濕，濕度保持在80%以上，遮陽網適當遮光。移栽21 d后統(tǒng)計成活率（成活率=成活組培苗數(shù)/種植組培苗總數(shù)×100%）和平均株高。

1.3" "數(shù)據處理及分析" "以上所有試驗均重復3次，所得數(shù)據用Excel及SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，所展示數(shù)據為平均值±標準差。

2" "結果與分析

2.1" "外植體消毒滅菌處理" "不同消毒滅菌處理方式對污染率和褐化率影響如表1所示。

由表1可見，對比A1-A4處理，隨著升汞處理時間的增加，污染率逐漸降低，褐化率則有上升趨勢。同時對比A5-A8處理，也有相應的趨勢。在相同升汞處理時間下，預先經過75%乙醇消毒處理，污染率低于單用升汞滅菌，而在褐化方面無顯著差異。由此可見，先用75%乙醇消毒處理，再經升汞滅菌效果更好，不但污染率更低，而且對褐化率沒有顯著影響。綜合考慮，A7處理，即75%乙醇消毒30 s后升汞浸泡8 min滅菌，在污染率低的同時褐化率控制得也較好，是合適的消毒滅菌處理方式。

2.2" "腋芽萌發(fā)誘導" "接種后每天觀察腋芽萌發(fā)情況。接種培養(yǎng)3 d后，腋芽部位膨大，5 d后腋芽開始萌發(fā)。接種培養(yǎng)21 d后，由表2可知，處理B3的誘導率優(yōu)于其他處理，達到100%，差異顯著，且腋芽高度也顯著高于其他處理。因此在腋芽誘導時可使用處理B3培養(yǎng)基，即MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8。

2.3" "叢生芽繼代增殖" "由表3可知，6種激素配比下增殖倍數(shù)有顯著差異，其中C2增殖倍數(shù)最高，達4.49，顯著高于其他處理，同時在株高方面表現(xiàn)最好?？梢?-BA與NAA濃度比值在一定范圍內可達到較好效果。在繼代增殖時可選用C2培養(yǎng)基，即MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8。

2.4" "生根誘導" "生根誘導培養(yǎng)9 d后，D5培養(yǎng)基中的組培苗最先生根，之后其他處理陸續(xù)生根。6周后生長情況見表4。

由表4可知，當基本培養(yǎng)基為1/2MS時，同時添加IBA和NAA，均可達到較好的生根效果;當基本培養(yǎng)基為MS時，在IBA和NAA濃度較低時生根效果更好，可見基本培養(yǎng)基和激素濃度對生根均有一定影響?？傮w來看，當基本培養(yǎng)基為1/2MS時，生根率要顯著優(yōu)于MS。此外，平均根數(shù)和平均根長均有類似趨勢。

株高則有相反趨勢?？赡苁且驗榛九囵B(yǎng)基為1/2MS時，較低的離子濃度有利于生根誘導及根部生長，而MS培養(yǎng)基有較高的離子濃度，有利于植株上部生長。

以生根率和生根情況考察，誘導生根合適的培養(yǎng)基為D5，即1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8，此條件下生根率及根數(shù)根長表現(xiàn)最好，株高也表現(xiàn)不錯。

2.5" "組培苗移栽" "由表5可知，成活率方面，蛭石為栽培基質時達95%，顯著高于其他基質，沙子為基質時次之，土壤與木屑（1︰1）混合基質移栽成活率最低，僅有70%。此外在株高方面，蛭石為基質栽培時最高，因此在組培苗移栽時適宜選用蛭石為栽培基質。

3" "小結與討論

以帶芽莖段為外植體，得到合適的滅菌方式為75%乙醇消毒30 s后升汞浸泡滅菌8 min。同樣以莖段為外植體，有研究稱只需升汞滅菌3 min，還有研究稱需10 min。因此，實際處理時可根據污染情況采用不同的滅菌方法。

有報道表明，6-BA、NAA和 GA3組合對腋芽萌發(fā)誘導有良好效果，本研究結果與現(xiàn)有報道一致。有研究表明，低溫有利于腋芽萌發(fā)，而本研究在常溫下得到了100%的誘導率，可見低溫對“小伊甸園”腋芽萌發(fā)不是必需條件。

不同品種增殖倍數(shù)差異較大，有的只有2.1左右，有的則高達9.8，本試驗得到的結果為4.49，為比較合適的增殖倍數(shù)。

本試驗在同時添加IBA和NAA情況下，生根效果較好，與現(xiàn)有報道一致。

當基本培養(yǎng)基為1/2MS時，生根率總體顯著優(yōu)于MS時，有報道表明基本培養(yǎng)基為1/4MS或WPM時生根效果較好，與本試驗結果有出入，后續(xù)可進一步研究。

本研究顯示合適的移栽基質為蛭石，成活率高、長勢好，與現(xiàn)有報道一致。

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