摘" 要：以虹鱒（Oncorhynchus mykiss）二倍體雌魚為母本，二倍體偽雄魚為父本，采用靜水壓法，研究誘導(dǎo)虹鱒三倍體的產(chǎn)生，初步探索靜水壓法誘導(dǎo)虹鱒三倍體的適宜條件。結(jié)果顯示，虹鱒三倍體誘導(dǎo)率受處理起始時(shí)間、處理壓力和持續(xù)時(shí)間的影響。靜水壓誘導(dǎo)虹鱒三倍體的最佳條件為處理起始時(shí)間30 min～40 min，靜水壓壓力65 MPa～70 MPa，持續(xù)時(shí)間4 min～6 min。

關(guān)鍵詞：虹鱒（Oncorhynchus mykiss）；三倍體；靜水壓法

中圖分類號(hào)：S961.2；S965.122文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-2419（2024）06-0701-04

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）屬鮭形目（Salmoniformes）、鮭科（Salmonidae）、大麻哈魚屬（Oncorhynchus），是中國(guó)主養(yǎng)的冷水魚品種之一。因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、口感豐富、無(wú)肌間刺、易加工制作，備受消費(fèi)者喜愛，因此人們對(duì)虹鱒的需求旺盛，虹鱒人工養(yǎng)殖行業(yè)得以迅速完善[1]。虹鱒三倍體即不育虹鱒，與普通虹鱒相比，具有個(gè)體大、生長(zhǎng)速度快、養(yǎng)殖周期短、餌料系數(shù)低、肉質(zhì)品質(zhì)高、抗病力強(qiáng)、商品價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[2-6]。虹鱒三倍體苗種18月齡可生長(zhǎng)到3 kg以上，是制作生魚片的理想魚類，相比于虹鱒二倍體，養(yǎng)殖利潤(rùn)可增加30%左右[3]。因此，開展虹鱒三倍體育種研究對(duì)虹鱒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

目前，中國(guó)大多采用熱休克法誘導(dǎo)虹鱒三倍體，但熱休克法會(huì)對(duì)虹鱒的受精卵造成某種程度的損傷。靜水壓法的原理是利用均質(zhì)流體（如水）對(duì)物體施加全方位且均勻的壓力，抑制細(xì)胞第二極體的排出而產(chǎn)生三倍體的過程。與熱休克法相比，靜水壓法對(duì)受精卵的刺激相對(duì)較小且處理時(shí)間較短，效果優(yōu)于熱休克法[7]。該試驗(yàn)以二倍體雌魚為母本，二倍體偽雄魚為父本，采用靜水壓法，研究誘導(dǎo)虹鱒三倍體的適宜條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

受精卵的采集、孵化及靜水壓誘導(dǎo)的過程、在石河子瑪河鱒魚園進(jìn)行，倍性鑒定在新疆天蘊(yùn)有機(jī)農(nóng)業(yè)有限公司尼勒克縣實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

選擇體表無(wú)傷、健康活潑、性腺發(fā)育良好的3+齡二倍體雌魚和二倍體偽雄魚作為親魚，雌雄比例2∶1。

1.3 試驗(yàn)儀器

靜水壓力機(jī)（型號(hào)APVM 2.7），流式細(xì)胞儀（型號(hào)CyFlow Cube 8）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 采精和采卵

在室外采卵過程中利用遮陽(yáng)傘、網(wǎng)保障全程避光。采精、卵前將魚體擦拭干凈，避免水、污物流入采集好的精、卵中。將精液采集至燒杯中，避光在5℃～10℃的低溫保存；將卵擠入塑料盆中，每10萬(wàn)粒卵加入精液5 mL。

1.4.2 人工授精

人工授精應(yīng)在避光環(huán)境中進(jìn)行，授精方式為干法授精[8]。將精液加入盛有卵的塑料盆中，加入清水激活精子，用羽毛輕輕攪拌，使精卵充分接觸。再加入少量清水，快速而均勻地?cái)嚢? min，再換水?dāng)嚢?～3次，盡量去除過量的精液、未受精的死卵和血塊等雜物。漂洗完成后，受精卵需遮光分組靜置。

1.4.3 加壓實(shí)驗(yàn)

采用單因素實(shí)驗(yàn)法，在水溫8℃～10℃左右條件下，設(shè)置20 min、30 min、40 min 3個(gè)處理起始時(shí)間梯度，起始時(shí)間是指從精子卵子受精后漂洗完成，進(jìn)行遮光靜止時(shí)開始計(jì)時(shí)，至放入靜水壓力機(jī)達(dá)到既定壓力的時(shí)間；60 MPa、65 MPa、70 MPa 3個(gè)處理壓力；4 min、5 min、6 min 3個(gè)加壓持續(xù)時(shí)間。

采用靜水壓法進(jìn)行虹鱒三倍體的誘導(dǎo)，利用靜水壓力機(jī)對(duì)虹鱒的受精卵進(jìn)行一定強(qiáng)度的靜水壓處理。待到既定的受精時(shí)間，將靜置后的受精卵倒入靜水壓力機(jī)內(nèi)的小鋼桶內(nèi)，勻速加壓至既定壓力后，開始計(jì)時(shí)，待到達(dá)處理壓力的持續(xù)時(shí)間后，緩慢逐步進(jìn)行梯度降壓至常壓，每組用卵約2 000粒。三倍體虹鱒誘導(dǎo)試驗(yàn)方案見表1。

1.4.4 受精卵孵化

受精卵采用常規(guī)桶式孵化器流水孵化，孵化室內(nèi)進(jìn)行遮光處理，保證受精卵孵化階段所需的暗光條件，并減少振動(dòng)。每周使用亞甲基藍(lán)對(duì)受精卵進(jìn)行消毒處理。當(dāng)孵化積溫達(dá)到220℃·d，胚胎出現(xiàn)黑色眼點(diǎn)后，統(tǒng)計(jì)受精卵成活率。

1.4.5 倍性鑒定

分別在受精卵發(fā)眼階段、魚苗上浮階段、魚苗全長(zhǎng)3 cm～4 cm時(shí)采用流式細(xì)胞儀（CyFlow Cube 8）進(jìn)行三倍體虹鱒的倍性鑒定[9]，以二倍體虹鱒血液為對(duì)照組，通過分析紅細(xì)胞細(xì)胞核中相對(duì)DNA含量確定倍性，三倍體虹鱒紅細(xì)胞的DNA含量為二倍體的1.5倍左右。

2 結(jié)果

2.1 處理起始時(shí)間的確定

靜水壓法誘導(dǎo)虹鱒三倍體，不同處理起始時(shí)間的誘導(dǎo)結(jié)果見圖1。從圖中可以看出，在處理壓力為70 Mpa，靜水壓持續(xù)時(shí)間為4 min時(shí)，處理起始時(shí)間為20 min時(shí)和處理起始時(shí)間為30 min、40 min的受精卵成活率和三倍體率之間均存在顯著差異（P＜0.05），處理起始時(shí)間為30 min和40 min的受精卵成活率和三倍體率均不存在顯著差異（P＞0.05）。受精卵成活率和三倍體率隨著處理起始時(shí)間的延長(zhǎng)，均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

綜合以上分析，在處理壓力為70 Mpa，壓力持續(xù)時(shí)間為4 min時(shí)，最佳處理起始時(shí)間為40 min。

2.2 靜水壓持續(xù)時(shí)間的確定

靜水壓法誘導(dǎo)虹鱒三倍體，不同靜水壓持續(xù)時(shí)間的誘導(dǎo)結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，在處理起始時(shí)間為40 min，處理壓力為70 Mpa時(shí)，靜水壓持續(xù)時(shí)間為4 min和持續(xù)時(shí)間為5 min、6 min的受精卵成活率之間存在顯著差異（P＜0.05），靜水壓持續(xù)時(shí)間為4 min、5 min、6 min時(shí)受精卵三倍體率均不存在顯著差異（P＞0.05）。受精卵成活率隨著靜水壓持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。受精卵三倍體率隨著處理起始時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)。

綜合以上分析，在處理起始時(shí)間為40 min，處理壓力為70 Mpa時(shí)，最佳靜水壓持續(xù)時(shí)間為4 min。

2.3 靜水壓處理壓力的確定

靜水壓法誘導(dǎo)虹鱒三倍體，不同靜水壓壓力的誘導(dǎo)結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，在處理起始時(shí)間為40 min，靜水壓持續(xù)時(shí)間為6 min時(shí)，靜水壓壓力為60 Mpa、65 Mpa、70 Mpa時(shí)受精卵成活率之間均存在顯著差異（P＜0.05），受精卵三倍體率均不存在顯著差異（P＞0.05）。受精卵成活率隨著靜水壓壓力的增大，呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。受精卵三倍體率隨著靜水壓壓力的增大，呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)。

綜合以上分析，在處理起始時(shí)間為40 min，靜水壓持續(xù)時(shí)間為6 min時(shí)，最佳處理壓力為65 Mpa。

3 討論

該試驗(yàn)中，受精卵的成活率和孵化率較低，分析原因主要有以下兩點(diǎn)：一是親魚的質(zhì)量不佳，導(dǎo)致受精卵質(zhì)量差，成活率低；二是操作手法不夠熟練，操作方式有待改進(jìn)，在加壓操作過程中反復(fù)傾倒轉(zhuǎn)運(yùn)受精卵產(chǎn)生的振動(dòng)可能會(huì)影響成活率。三是孵化環(huán)境有待改善，孵化水溫不穩(wěn)定也是影響孵化率的因素之一。

加壓起始時(shí)間是影響靜水壓法誘導(dǎo)虹鱒三倍體的因素之一，加壓起始時(shí)間是指從精子卵子受精后漂洗完成，進(jìn)行遮光靜止時(shí)開始計(jì)時(shí)，放入靜水壓力機(jī)達(dá)到既定壓力的時(shí)間。在該試驗(yàn)中，加壓起始時(shí)間為30 min、40 min相比于加壓起始時(shí)間為20 min的受精卵成活率和三倍體率顯著上升，在40 min時(shí)達(dá)到最高。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著加壓起始時(shí)間的延長(zhǎng)，受精卵成活率和三倍體率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這與陳落落等[7]研究結(jié)果基本一致。陳落落等[7]的研究表明，采用靜水壓法的起始時(shí)間處于10 min～30 min的時(shí)間

范圍內(nèi)，虹鱒受精卵的發(fā)眼率及上浮率皆隨著起始時(shí)間的增加而顯著提高，在30 min時(shí)達(dá)到頂峰，初步確定了誘導(dǎo)虹鱒三倍體最優(yōu)的起始時(shí)間在30 min～35 min內(nèi)，該研究還指出，虹鱒受精卵在未吸水之前較軟具有黏性，隨著胚胎吸水膨脹，其對(duì)外界的水溫、靜水壓等理化因子的抵抗力會(huì)隨之上升，更有利于虹鱒三倍體的誘導(dǎo)，該試驗(yàn)也印證了這一觀點(diǎn)。

該試驗(yàn)采用靜水壓法人工誘導(dǎo)虹鱒三倍體，通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)，篩選出誘導(dǎo)虹鱒三倍體的最佳條件為：受精卵靜置40 min后，在65 MPa的靜水壓力下處理4 min，此條件下受精卵成活率和三倍體率最高。

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Triploid test of Oncorhynchus mykiss induced by hydrostatic pressure

SHI Chunming1， LI Chunyu2， YANG Bowen1， ZHANG Yu1， JIAO Fei1， XING Junxia1， HAN Ruibang2， CAI Lingang1

（1.Xinjiang Institute of Fishery Science， Urumqi 830000， Xinjiang China; 2. Xinjiang Tianyun Organic Agriculture Co.， LTD.， Nilek 835700， Xinjiang China）

Abstract：Using the diploid female of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss） as the mother and the diploid pseudomale as the father， the hydrostatic pressure method was used to induce triploid of rainbow trout， and the appropriate conditions for inducing triploid of rainbow trout by hydrostatic pressure method were initially explored. The results showed that the triploid induction rate of rainbow trout was affected by the initial time， pressure and duration of treatment. The optimum conditions for inducing triploid of rainbow trout by hydrostatic pressure were the initial treatment time of 30 min～40 min， hydrostatic pressure of 65 MPa～70 MPa， and duration of 4 min～6 min.

Keywords：Oncorhynchus mykiss; Triploid; Hydrostatic method

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)任務(wù)專項(xiàng)（2022B02006）。

作者簡(jiǎn)介：時(shí)春明（1997- ）男，高級(jí)農(nóng)藝師。研究方向：瀕危魚類的養(yǎng)殖和漁業(yè)工程。E-mail：1006487270@qq.com。