摘要：鹽敏感高血壓作為一種頑固性高血壓，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。雖然鹽皮質(zhì)激素受體激活和腎損傷在鹽敏感高血壓的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，但具體的病理機(jī)制目前并不明確。通過(guò)高鹽飲食誘導(dǎo)建立達(dá)爾鹽敏感（Dahl SS）大鼠高血壓模型，探究鹽敏感高血壓及腎損傷產(chǎn)生的病理機(jī)制。與鹽不敏感的SS-13BN 大鼠相比，長(zhǎng)期高鹽飲食會(huì)造成Dahl SS 大鼠腎臟中交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的局部激活，最終激活鹽皮質(zhì)激素受體（MR），導(dǎo)致上皮鈉通道（ENaC）表達(dá)增加、氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，從而發(fā)生腎纖維化病變，并引發(fā)腎臟中磷酸化肌動(dòng)蛋白（P-Cofilin）與足蛋白（Podocin）表達(dá)增加，造成足細(xì)胞損傷，最終引發(fā)腎損傷與高血壓癥狀。

關(guān)鍵詞：高鹽飲食；Dahl SS 大鼠；鹽敏感高血壓；腎損傷；鹽皮質(zhì)激素受體

中圖分類(lèi)號(hào)：R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

高血壓作為一種最普遍的慢性代謝性疾病，是導(dǎo)致心血管疾病的重要因素之一。人群中，因高血壓導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生甚至死亡的比例正在顯著增加[1]，而鹽敏感高血壓作為一種特殊的難治性高血壓，其病因繁多復(fù)雜?；蜻z傳、高鹽飲食、腎鈉攝入和排出失衡、交感神經(jīng)的過(guò)度興奮、交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的紊亂、炎癥和氧化應(yīng)激的增強(qiáng)、肥胖、精神壓力以及衰老等諸多因素，均是造成鹽敏感高血壓產(chǎn)生和迅速發(fā)展的重要原因[2-3]。由鹽攝入量的持續(xù)性增加而引起的交感神經(jīng)與鹽皮質(zhì)激素受體（MR）的過(guò)度激活是導(dǎo)致腎損傷、并最終發(fā)展成鹽敏感高血壓的根本因素[4]。

作為一種特殊的鹽敏感高血壓模型，達(dá)爾鹽敏感（Dahl SS）大鼠及對(duì)照鼠SS-13BN 大鼠常用于鹽敏感高血壓的研究。在高鹽飲食狀態(tài)下，Dahl SS 大鼠的血壓會(huì)出現(xiàn)爆發(fā)式增高，并伴有腎損傷。這樣的特點(diǎn)與人群中的鹽敏感人群相吻合，故常用于模擬人類(lèi)的鹽敏感高血壓模型，用于各種病理機(jī)制的研究及尋找潛在的治療藥物[2-3， 5-10]。研究表明Dahl SS大鼠高血壓及腎損傷的爆發(fā)與腎臟線粒體功能受損和能量代謝障礙[11]、足細(xì)胞損傷與腎小球病變[12]、氧化應(yīng)激與炎癥[13-14] 等因素密切相關(guān)。但由于Dahl SS高血壓模型發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，所以現(xiàn)今鮮有針對(duì)Dahl SS 大鼠高血壓模型進(jìn)行的病理機(jī)制系統(tǒng)研究。

本文通過(guò)高鹽飲食建立Dahl SS 大鼠高血壓模型，探究導(dǎo)致腎損傷與血壓升高潛在的病理機(jī)制，并揭示各因素之間明確的因果關(guān)系，為后續(xù)的藥物開(kāi)發(fā)提供有效的研發(fā)思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 動(dòng)物與試劑

6 周齡的Dahl SS 大鼠及對(duì)照鼠SS-13BN 大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；特殊訂制的0.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同） NaCl AIN-93G 和4%NaClAIN-93G 飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。血壓測(cè)量使用的是由上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)的ALC-NIBP 無(wú)創(chuàng)血壓分析系統(tǒng)。抗體α-ENaC（ PA5-96353） 、γ-ENaC（ PA5-110347）購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；β-ENaC（14134-1-AP）、GADPH（60004-1-Ig）、β-actin（11224-1-AP）、Cofilin（66057-1-Ig）、NPHS2（20384-1-AP）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；SGK-1（ab55281）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；NF-κB（3033S）、P-Cofilin（ 3313S） 購(gòu)自美國(guó)CST 公司； IL-4（ E-ELR0014c）、IL-1β（ E-EL-R0012c） 、去甲腎上腺素（ EEL-0047c） 、血管緊張素Ⅱ（ E-EL-R1430c） 、醛固酮（E-EL-0070c）、腎素（E-EL-R0030c）Elisa 試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司； 丙二醛（S0131S）和谷胱甘肽還原酶（S0055）試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型建立 6 周齡的Dahl SS 大鼠和SS-13BN 大鼠在恒溫?zé)o病原體、12 h 和12 h 光暗循環(huán)的鼠房中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，進(jìn)行一周的適應(yīng)性訓(xùn)練，并根據(jù)訓(xùn)練血壓的結(jié)果隨機(jī)分成4 組：SS-13BN rats+0.3% NaCl+Placebo；SS-13BN rats+4% NaCl+Placebo；Dahl SS rats+0.3%NaCl+Placebo；Dahl SS rats+4% NaCl+Placebo，其中，0.3%NaCl 代表低鹽飼料，4%NaCl 代表高鹽飼料，Placebo 代表安慰劑。每周進(jìn)行1 次尾套管無(wú)創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)，并且在第8 周時(shí)，在戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈取血并采集腎臟標(biāo)本，血液取出后靜置5 min，后在4 ℃、12 000 g條件下離心15 min，取上層血漿，分裝后放在?80 ℃ 冰箱儲(chǔ)存；腎臟縱切，一半固定于10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）中性甲醛溶液，用于組織學(xué)病理檢查，另一半液氮速凍，用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)方案都按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行設(shè)計(jì)和研究。

1.2.2 腎臟的組織病理學(xué)評(píng)估 通過(guò)Masson 染色評(píng)估腎臟的纖維化狀況：將縱切固定于10% 中性甲醛的腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟，并用蒸餾水沖洗起到補(bǔ)水作用， 然后按照標(biāo)準(zhǔn)改良后的Masson 染色實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行染色，并使用光學(xué)倒置顯微鏡觀察拍照。在200X 視野條件下，每張切片隨機(jī)選擇4 個(gè)腎臟區(qū)域進(jìn)行定量分析，并使用Image-ProPlus 6.0 測(cè)量陽(yáng)性區(qū)域的面積，通過(guò)藍(lán)色的膠原面積判斷腎纖維化的程度。

1.2.3 Western Blot 實(shí)驗(yàn) 使用RIPA（ Radio-ImmunoprecipitationAssay）裂解液，并輔以苯醛基磺酰氟（PMSF）和Cocktail 蛋白酶抑制劑提取腎臟標(biāo)本中的總蛋白，利用BCA 蛋白濃度測(cè)定法確定總蛋白濃度。樣品在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離，將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上（70 min），后在0.05 g/mL 的脫脂牛奶中阻斷非特異性蛋白2 h，再在4 ℃ 下與一抗過(guò)夜孵育。隔日，在室溫條件下用含0.2%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫的TBST 緩沖液清洗未結(jié)合的一抗，每次10 min。清洗結(jié)束后，將膜與HRP 標(biāo)記的二抗在室溫下孵育2 h，并清洗未結(jié)合的二抗。通過(guò)ECL 化學(xué)發(fā)光液將信號(hào)放大， 并使用化學(xué)發(fā)光儀獲取圖像， 最后用Image J 進(jìn)行灰度值計(jì)算。

1.2.4 免疫組化 將石蠟切片置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟處理，并在不同濃度梯度的酒精中進(jìn)行脫水處理。脫蠟脫水結(jié)束后， 將切片置于pH 為6.0 的1X 檸檬酸抗原修復(fù)液中，在95 ℃ 條件下進(jìn)行抗原修復(fù)，然后冷卻至室溫。隨后，用體積分?jǐn)?shù)為3% 的H2O2 室溫避光孵育20 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后在室溫下用5% 的牛血清白蛋白阻斷非特異性信號(hào)。將切片在4 ℃ 下與一抗過(guò)夜孵育，次日在室溫條件下用PBS 洗去多余的一抗，二抗孵育1 h后清洗未結(jié)合的二抗。在避光條件下進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木素染核和鹽酸乙醇分化操作，最后在梯度乙醇和二甲苯中脫水至透明，并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行中性樹(shù)膠封片處理。晾干后在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并拍片，每張切片在200X 視野下選擇4 個(gè)區(qū)域進(jìn)行定量分析，并使用Image-Pro Plus 6.0 量化二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色的信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn) 本文實(shí)驗(yàn)所有操作均嚴(yán)格遵守制造商說(shuō)明書(shū)規(guī)定的實(shí)驗(yàn)方案。樣品中的抗原與包被在酶標(biāo)板上的抗體結(jié)合后，洗去未結(jié)合的抗原，再依次加入生物素化抗體工作液和酶結(jié)合物工作液繼續(xù)孵育，形成免疫復(fù)合物。隨后加入顯色底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB），使其在辣根過(guò)氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，接著加入終止液停止反應(yīng)，然后在450 nm 處測(cè)量腎臟組織中各物質(zhì)的吸光度值，并用OriginPro2020 計(jì)算各樣品對(duì)應(yīng)的濃度。

1.2.6 GSH、MDA 的測(cè)定 剪取適量腎臟組織制備成組織勻漿，冰上儲(chǔ)存?zhèn)溆靡杂脕?lái)進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺（GSH）、丙二醛（MDA）的測(cè)定，整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和測(cè)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析及處理 本文中所有數(shù)據(jù)均用平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean + SEM）表示，使用SPSS26.0 軟件進(jìn)行組間的單因素方差分析，采用最小顯著差異法檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。n 代表每組樣本數(shù)， p lt;0.05 代表有顯著性差異。