摘 要：使用高通量測序技術(shù)對蟠龍菜不同貯藏溫度（4、20 ℃）下的細(xì)菌群落組成、動態(tài)變化及優(yōu)勢腐敗菌進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在所有蟠龍菜樣品中共檢測到19 個(gè)細(xì)菌門和166 個(gè)細(xì)菌屬，其中藍(lán)菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）為4 個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌門；氣單胞菌屬（Aeromonas）、unclassified_Chloroplast、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）相對豐度變化明顯；多樣性分析表明，2 組樣品隨貯藏時(shí)間的延長，屬水平上細(xì)菌豐度均存在明顯波動；低溫貯藏蟠龍菜的物種豐富度在40 d內(nèi)整體呈現(xiàn)不斷上升趨勢，貯藏初期（10 d內(nèi)）物種多樣性減少，并在10～40 d內(nèi)不斷發(fā)展；常溫貯藏樣品的菌群豐富度降低后波動上升，物種多樣性在貯藏15 d時(shí)最高；同時(shí)，20 ℃貯藏樣品中優(yōu)勢菌群在較短時(shí)間內(nèi)取得競爭優(yōu)勢，菌相的變化更為顯著，推測常溫貯藏蟠龍菜的腐敗菌為氣單胞菌屬和不動桿菌屬（Acinetobacter），低溫貯藏蟠龍菜的腐敗菌為氣單胞菌屬、不動桿菌屬和類芽孢桿菌屬；采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法從冷藏蟠龍菜中分離出托霍尼斯假單胞菌（Pseudomonas tohonis）、托拉假單胞菌（Pseudomonas juntendi）和耐冷假單胞菌（Pseudomonas psychrotolerans）3 種假單胞菌，推測假單胞菌屬的細(xì)菌為潛在腐敗菌。

關(guān)鍵詞：蟠龍菜；貯藏條件；高通量測序；細(xì)菌多樣性；優(yōu)勢腐敗菌

Changes in Bacterial Diversity and Dominant Spoilage Bacteria during Storage of Panlongcai， a Traditional Steamed Dish in Zhongxiang， Hubei

YUN Zhoumiao1，2， JIAN Qingmei1， HAN Jiayu1， WU Jinlin3， HUANG Yechuan1，2，*

（1. College of Bioengineering， Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， China;

2. College of Life Science and Engineering， Southwest University of Science and Technology， Mianyang 621010， China;

3. Hubei Runwu Food Co. Ltd.， Jingmen 431900， China）

Abstract： The bacterial community composition， its dynamic changes and the dominant spoilage bacteria in Panlongcai at different storage temperatures （4 and 20 ℃） were studied using high-throughput sequencing （HTS）. The results showed that a total 19 bacterial phyla and 166 bacterial genera were detected in all samples， with the dominant bacterial phyla being Cyanobacteria， Firmicutes， Proteobacteria and Bacteroidetes. The relative abundance of Aeromonas， unclassified Chloroplast， and Paenibacillus changed significantly. Diversity analysis showed that there were significant fluctuations in the abundance of bacteria at the genus level with extended storage， irrespective of storage temperature. The species richness of the bacterial community in Panlongcai stored at 4 ℃ showed an overall increasing trend over 40 days of storage， decreasing in the first 10 days and later increased progressively. During storage at 20 ℃， the species richness first decreased and then increased with fluctuations， reaching its peak on day 15. Furthermore， in the samples stored at 20 ℃， the dominant microbial community achieved a competitive advantage in a relatively short period， more pronounced changes in the microbial flora being observed. It was inferred that the spoilage organisms were Aeromonas and Acinetobacter for Panlongcai stored at"20 ℃， and Aeromonas， Acinetobacter， and Paenibacillus at 4 ℃. Three Pseudomonas species （P. tohonis， P. juntendi， and"P. psychrotolerans） were isolated from Panlongcai under refrigerated conditions， thus presuming that Pseudomonas is potential spoilage organism.

Keywords： Panlongcai; storage conditions; high-throughput sequencing; microbial diversity; dominant spoilage bacteria

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240407-070

中圖分類號：TS251.1" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）04-0009-08

引文格式：

云周苗， 簡清梅， 韓佳鈺， 等. 蟠龍菜貯藏期間細(xì)菌多樣性及優(yōu)勢腐敗菌分析[J]. 肉類研究， 2024， 38（4）： 9-16. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240407-070." "http：//www.rlyj.net.cn"YUN Zhoumiao， JIAN Qingmei， HAN Jiayu， et al. Changes in bacterial diversity and dominant spoilage bacteria during storage of panlongcai， a traditional steamed dish in zhongxiang， hubei[J]. Meat Research， 2024， 38（4）： 9-16. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240407-070." "http：//www.rlyj.net.cn

蟠龍菜，又稱盤龍菜、卷切，俗名剁菜，是湖北鐘祥經(jīng)典名菜之一，主要原料包括豬肉、魚肉、雞蛋、大蔥和生姜等，具有色澤鮮艷、肥而不膩、肉滑油潤及香味綿長的特點(diǎn)，迄今已有約500 年的食用歷史[1-2]。近年來，蟠龍菜經(jīng)初步改良后進(jìn)入了工業(yè)化生產(chǎn)階段，相關(guān)推廣策略研究也穩(wěn)步推進(jìn)[3]。蟠龍菜產(chǎn)品作為調(diào)理肉制品的一種，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)素，有利于微生物生長繁殖，因此，在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸及銷售等環(huán)節(jié)易被食源性致病菌污染[4-5]。造成蟠龍菜生產(chǎn)安全性風(fēng)險(xiǎn)的原因有生產(chǎn)規(guī)范化和現(xiàn)代化程度較低，大多由作坊式生產(chǎn)而成，因而生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)環(huán)境潔凈程度不達(dá)標(biāo)；蟠龍菜原輔料品種較多，且加工工藝較為復(fù)雜，這提高了生產(chǎn)過程中引入外源微生物及其他外源物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)；為避免高溫滅菌加速蟠龍菜中脂肪劣變，使其產(chǎn)生令人不能接受的不良風(fēng)味[6]，需降低殺菌溫度，縮短殺菌時(shí)間；此外，蟠龍菜加工工程中一般未使用防腐劑、抗氧化劑等添加劑。這些問題導(dǎo)致蟠龍菜產(chǎn)品貨架期普遍較短，運(yùn)輸和銷售需要一定冷藏條件，在一定程度上限制了其商品化發(fā)展。

目前，已有一些研究者對肉及肉制品腐敗微生物進(jìn)行了探討。Zhou Zhonglian等[7]認(rèn)為假單胞菌和熱殺索絲菌是冷凍豬肉中的主要腐敗菌，且這2 種菌相互作用會加速豬肉的腐敗進(jìn)程。Borch等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與冷藏肉制品變質(zhì)有關(guān)的細(xì)菌主要包括嗜熱芽孢桿菌屬、肉桿菌屬、乳酸桿菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬，且乳酸菌是其中的優(yōu)勢腐敗微生物。研究者在對不同熟肉制品進(jìn)行研究后得出相同結(jié)論，認(rèn)為乳酸菌是其中存在的優(yōu)勢菌種[9-11]。Dalgaard[12]認(rèn)為優(yōu)勢腐敗菌主導(dǎo)包裝魚產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)。然而，關(guān)于蟠龍菜菌相分析和微生物控制的相關(guān)研究還很少。

近年來，高通量測序技術(shù)已被證明比傳統(tǒng)微生物分析方法或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）更快速、有效和可靠，因而被廣泛用于監(jiān)測食品中微生物群落的動態(tài)變化[13-16]。Po?ka等[16]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合PCR-DGGE及高通量測序研究意大利薩拉米香腸成熟過程中的菌相變化，發(fā)現(xiàn)與PCR-DGGE相比，高通量測序技術(shù)鑒定出的生肉發(fā)酵主要參與者（乳酸桿菌和葡萄球菌）的多樣性更高。Tian Xiaojing等[17]采用傳統(tǒng)方法和高通量測序方法研究熟制后豬肉冷藏過程中的細(xì)菌多樣性變化，發(fā)現(xiàn)貯藏初期主要為芽孢桿菌、腸桿菌、假單胞菌和乳球菌，貯藏末期肉食桿菌屬成為優(yōu)勢菌群。本研究采用高通量測序技術(shù)研究蟠龍菜貯藏期間微生物群落豐度及多樣性的動態(tài)變化，為識別核心腐敗微生物和控制蟠龍菜腐敗提供參考，對于后續(xù)產(chǎn)品貨架期延長和質(zhì)量提升具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、草魚、大蔥、生姜、雞蛋、馬鈴薯淀粉、食鹽、味精 荊楚理工學(xué)院南門超市；大豆分離蛋白、卡拉膠、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（均為食品級） 河南萬邦化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C21-SN2105型電磁爐 廣東美的生活電器制造有限

公司；FA224C型電子分析天平 上海力辰邦西儀器科技有限公司；CH-LL06型家用小型絞肉機(jī) 河北廊坊近都家居用品有限公司；101-0A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；DW-86L626型立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；ZK-380型真空包裝機(jī) 永康斯飛格電器有限公司；BSP-100型生化培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份公司。

1.3 方法

1.3.1 蟠龍菜制備工藝

工藝流程：原料選擇→原料預(yù)處理→絞肉→攪拌并加料→成型→蒸制→冷卻→真空包裝→滅菌。

操作要點(diǎn)：絞肉：將豬瘦肉、魚肉按比例混合，絞成肉糜狀，肥肉絞至最大塊體積不超過1.5 cm3；攪拌并加料：按表1進(jìn)行加料，逆時(shí)針手動攪拌5 min；成型：將混合均勻的肉糜置于潔凈的保鮮膜上，將其裹成長約10 cm、直徑約6 cm的類圓柱體；蒸制：將成型后的肉糜坯置于蒸籠，蒸制20 min，在表面刷蛋黃液，繼續(xù)蒸5 min；真空包裝：將冷卻后的蟠龍菜裝袋并在0.1 MPa真空度下進(jìn)行抽真空操作并封口；滅菌：105 ℃滅菌20 min。

1.3.2 樣品采集

參照Samelis[18]、Kaur[19]等的方法。將4 ℃貯藏樣品在其包裝后的第0、10、20、30、40天取樣，分別命名為A-1～A-5；將20 ℃貯藏樣品在其包裝后的第0、5、10、15、20、25、30天取樣，分別命名為B-1～B-7。從超凈臺中取3 袋平行樣品，分別稱取10 g，切碎混合后作為該批次的最終樣品密封于無菌取樣袋中，4 ℃樣品共5 袋，20 ℃樣品共7 袋。取樣后將其置于－80 ℃避光貯藏，隨后基于16S rDNA進(jìn)行Illumina NovaSeq高通量測序，測序平臺為NovaSeq PE250。

1.3.3 基因組提取及Illumina NovaSeq測序

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株的DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，通過388F-806R通用引物擴(kuò)增16S rDNA V3～V4區(qū)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃穩(wěn)定延伸10 min；擴(kuò)增27 個(gè)循環(huán)，在4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增目的條帶大小，并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。純化后構(gòu)建克隆文庫，并進(jìn)行Illumina NovaSeq雙向測序。

1.3.4 傳統(tǒng)培養(yǎng)微生物的分離、純化和鑒定

從1.3.2節(jié)中4 ℃培養(yǎng)20、40 d的30～300 CFU的PCA平板中挑選典型菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，然后進(jìn)行革蘭氏染色、顯微鏡鏡檢和過氧化氫實(shí)驗(yàn)。挑取純菌落用甘油保存于－80 ℃冰箱中備用。后續(xù)使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌株DNA。以提取純化的細(xì)菌DNA為模板，用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，對測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接校準(zhǔn)后與NCBI上GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行同源性比對分析，進(jìn)而得出該微生物在屬種上的分類結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用fastp（v0.12.4）軟件對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控：采用滑動窗口策略，窗口大小設(shè)置為4，平均質(zhì)量值為20，最小保留序列長度為100，fastq自動去除接頭序列；利用QIIME2（2020.2.0）軟件dada2插件對質(zhì)控后的序列進(jìn)行reads的拼接、去重、嵌合體過濾，生成代表性序列，根據(jù)序列相似度將其歸為多個(gè)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。根據(jù)物種注釋，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品在門、屬分類水平上的序列數(shù)目。使用R語言繪制稀釋曲線、等級聚類曲線和熱圖。采用QIIME軟件（version 1.9.1）進(jìn)行α多樣性分析，通過Origin 2021軟件繪制樣品間的層級聚類樹，同時(shí)繪制門水平和屬水平相對豐度柱狀圖。使用凌波微課云平臺繪制主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）圖和Venn圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序數(shù)據(jù)合理性分析

通過Illumina NovaSeq平臺對蟠龍菜細(xì)菌群落進(jìn)行測序分析，12 個(gè)樣品的下機(jī)數(shù)據(jù)中含有0.46 G原始數(shù)據(jù)堿基和1 778 622 條原始序列讀段，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和過濾，得到815 019 條有效序列，然后對其進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、嵌合體過濾，形成OTU。以97%的相似度為標(biāo)準(zhǔn)對優(yōu)質(zhì)細(xì)菌序列進(jìn)行聚類和物種分類處理，共獲得1 733 個(gè)OTU，各蟠龍菜樣本的OTU數(shù)量分布處于74～245之間。各樣本的覆蓋率均大于99%，說明測序數(shù)目充足，測序序列可以代表蟠龍菜細(xì)菌群落組成情況，并進(jìn)行后續(xù)分析。

由圖1可知，當(dāng)序列數(shù)大于20 000后，稀釋曲線逐漸趨于平坦，增加測序數(shù)只能發(fā)現(xiàn)極少量物種，表明本次測序數(shù)據(jù)量足以反映蟠龍菜樣本的多樣性，也能體現(xiàn)樣品中大部分菌群的組成情況。

由圖2可知，不同樣品微生物豐度和均勻度存在顯著差異，其中B-3、B-4、B-5組樣品曲線較陡峭、水平跨度小，表明20 ℃貯藏樣品在貯藏第10～20天時(shí)微生物分布不均勻且豐富度較低。

2.2 蟠龍菜細(xì)菌群落的α多樣性分析

Shannon指數(shù)能夠反映物種多樣性；Chao1指數(shù)能夠反映物種豐富度，其能更敏捷地對稀有物種做出指示[20]；Ace指數(shù)可用來估計(jì)群落中含有OTU數(shù)目的指數(shù)，Ace指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。由表2可知，A組樣品Chao1指數(shù)、物種數(shù)、Ace指數(shù)在貯藏20 d內(nèi)不斷增大，貯藏20～40 d期間先減小后增加，并且貯藏結(jié)束時(shí)和貯藏開始時(shí)的值分別為最大值和最小值，說明4 ℃保存樣品的物種豐富度在40 d內(nèi)整體呈現(xiàn)不斷上升趨勢。同時(shí)，A組樣品Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)變化趨勢相同，為先下降后緩慢上升，然后降低，最終維持在一個(gè)相對穩(wěn)定的狀態(tài)，這表明蟠龍菜樣品貯藏初期（10 d內(nèi)）物種多樣性減少，在10～20 d內(nèi)不斷增加，隨后的20 d內(nèi)緩慢下降并保持穩(wěn)定。肖香[21]研究肴肉貯藏期間微生物多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，貯藏22 d時(shí)的物種多樣性最高，與本研究結(jié)果基本一致。物種多樣性呈上述動態(tài)變化可能是因?yàn)闃悠分谱鬟^程模擬了作坊式生產(chǎn)，生產(chǎn)環(huán)境并非完全無菌狀態(tài)，從而導(dǎo)致加工過程引入較多外源微生物，并且殺菌環(huán)節(jié)不能殺滅全部微生物，所以在貯藏0 d時(shí)具有較高的α多樣性水平；4 ℃的低溫抑制了部分嗜熱細(xì)菌生長，導(dǎo)致0～10 d時(shí)蟠龍菜中細(xì)菌多樣性下降；在之后10 d內(nèi)，部分受損或蟄伏細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境后開始生長和繁殖，故出現(xiàn)較多的特有菌群；隨貯藏時(shí)間延長，微生物之間出現(xiàn)共生、協(xié)同和拮抗等作用，加之營養(yǎng)成分和環(huán)境變化，從而導(dǎo)致菌群多樣性再次下降；最終蟠龍菜樣品中的不同細(xì)菌在競爭后形成一個(gè)較為穩(wěn)定的分布格局，整體處于動態(tài)平衡之中。

20 ℃貯藏樣品Chao1指數(shù)、物種數(shù)、Ace指數(shù)總體呈現(xiàn)出先回落后上升的趨勢，且最終數(shù)值大于初始值，表明在此期間蟠龍菜樣品的菌群豐富度先下降隨后波動上升。同時(shí)，其Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)在貯藏15 d時(shí)均為最大值，表明蟠龍菜樣品細(xì)菌多樣性在常溫貯藏15 d時(shí)最高。

2.3 蟠龍菜細(xì)菌群落的β多樣性分析

為深入探究蟠龍菜細(xì)菌群落在貯藏過程中存在的相似性，對細(xì)菌群落進(jìn)行PCoA和非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析。由圖3可知，PCo1為73.10%，PCo2為22.49%，其總和為95.59%，說明能在2 個(gè)主坐標(biāo)上對不同樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解釋。從貯藏溫度上來看，4 ℃貯藏樣品除A-3外的其他樣品距離較近，表明該溫度下樣品中菌群組成在貯藏初期和末期存在較大相似性。20 ℃貯藏蟠龍菜樣品細(xì)菌組成在制作完成時(shí)（B-1）、貯藏初期（B-2）、中期（B-3、B-4、B-5）和后期（B-6、B-7）均顯示出明顯差異，說明在該溫度條件下樣品中不同細(xì)菌間呈現(xiàn)出較強(qiáng)的競爭狀態(tài)，菌群結(jié)構(gòu)變化較快。與葉可萍等[22]的研究結(jié)果基本一致。

由圖4可知，在4 ℃貯藏條件下，所有蟠龍菜樣品分為2 簇，其中A-1單獨(dú)為一簇，其他樣品聚集成簇，說明在貯藏前30 d內(nèi)每10 d均有明顯差異。20 ℃貯藏條件下的樣品聚為3 簇，B-1單獨(dú)為一簇，B-3、B-4、B-5聚為一簇，其他樣品聚為一簇。綜合PCoA和UPGMA，二者結(jié)果基本一致，說明隨貯藏時(shí)間的延長，蟠龍菜細(xì)菌群落組成的相似性和差異性有一定變化，且20 ℃貯藏樣品的變化更為明顯。

2.4 門水平菌群結(jié)構(gòu)分析

聚類熱圖基于距離對物種和樣本分別進(jìn)行聚類，能反映所有樣本在特定分類水平上物種組成的相似性及差異性，同時(shí)揭示了某些菌群可能存在分布的特異性。本研究選擇相對豐度排名前100的物種繪制熱圖，選擇相對豐度排名前10的物種繪制柱狀圖。在所有蟠龍菜樣品中共檢測到19 個(gè)細(xì)菌門。由圖5可知，細(xì)菌主要組成分別為藍(lán)菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）4 個(gè)門。趙睿等[23]研究不同腌臘肉制品時(shí)得出的優(yōu)勢菌種同樣為這4 個(gè)菌門，相關(guān)研究[24-26]也表明，變形菌門、厚壁菌門這2 類門水平微生物是巴氏殺菌乳、燒雞和肴肉貯藏期間的主要優(yōu)勢菌群。

在低溫貯藏過程中，藍(lán)菌門占據(jù)絕對優(yōu)勢，前10 d其相對豐度由78.01%上升至88.62%，然后在之后的20 d內(nèi)在8%范圍內(nèi)波動；厚壁菌門相對豐度波動范圍為5.03%～7.62%；變形菌門相對豐度在前30 d從5.39%不斷增加到8.83%，隨后下降至7.84%，其相對豐度變化范圍較小。常溫貯藏過程中，藍(lán)菌門或厚壁菌門在不同時(shí)期內(nèi)變化較大，且在具有絕對優(yōu)勢時(shí)相對豐度最高，均超過87%；變形菌門和擬桿菌門相對豐度變化（2.44%～3.80%）較小。由圖6可知，蟠龍菜中物種的豐度隨貯藏時(shí)間延長而不斷發(fā)生變化，且A組中豐度較高的物種較多，與圖5所得結(jié)果一致。

2.5 屬水平菌群結(jié)構(gòu)分析

如圖7所示，在屬水平上，共檢測出166 個(gè)屬，在全部樣品中排名前10的優(yōu)勢細(xì)菌屬分別為不動桿菌屬（Acinetobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、unclassified_Chloroplast、unclassified_Enterobacteriaceae、乳桿菌屬（Lactobacillus）、unclassified_Mitochondria、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和鏈球菌屬（Streptococcus），占總豐度的98.86%，這與Stellato等[27]的研究結(jié)果基本一致。

在各貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長，屬水平上細(xì)菌的相對豐度有明顯波動，但組成并無明顯變化。低溫貯藏樣品中相對豐度變化最大的是unclassified_Chloroplast和Aeromonas，unclassified_Chloroplast在20 d時(shí)相對豐度最低，為37.43%，在其他時(shí)期均在70%左右；Aeromonas相對豐度出現(xiàn)多次變化，且幅度（2.31%～7.99%）存在較大變化；此外，Acinetobacter的相對豐度在貯藏后期比初期上升約3 倍。常溫貯藏樣品中變化較大的是unclassified_Chloroplast、Aeromonas和Paenibacillus。unclassified_Chloroplast相對豐度在5 d內(nèi)迅速從15.40%增至82.83%，隨后5 d快速下降至4%左右，直至25 d時(shí)再次快速升至66.89%，其菌群相對豐度呈現(xiàn)大幅度波動，且與低溫貯藏時(shí)呈現(xiàn)不同的波動趨勢，說明溫度對其生長繁殖產(chǎn)生了影響。Aeromonas相對豐度從貯藏初期的79.64%不斷下降至0.22%，隨后保持該相對豐度直至貯藏25 d（24.65%）。對Paenibacillus來說，在第10～20天內(nèi)相對豐度保持在94%，但是在貯藏0 d時(shí)，該屬物種處于不可檢測狀態(tài)，相對豐度存在較大變化。由圖7可知，Paenibacillus在低溫條件下并未占據(jù)優(yōu)勢，而是始終處于邊緣地位，其相對豐度維持在0.46%以內(nèi)，這是因?yàn)镻aenibacillus最適生長溫度為28～40 ℃[28]，低溫抑制了其生長繁殖。綜上所述，推測常溫貯藏蟠龍菜的腐敗菌為Aeromonas和Acinetobacter，低溫貯藏蟠龍菜的腐敗菌為Aeromonas、Acinetobacter和Paenibacillus。

由圖8可知，不同貯藏溫度和不同貯藏階段的樣品細(xì)菌屬水平組成具有明顯差異。在屬水平上，A組樣品中具有較高豐度的物種在不同貯藏階段變化明顯；B組樣品具有高豐度的物種較少，與A組間呈現(xiàn)較大差異。

2.6 蟠龍菜貯藏期間菌相變化

花瓣圖基于細(xì)菌菌群組成的相似性及差異，圖中每個(gè)花瓣代表一個(gè)樣品，花瓣共有部分代表所有樣品共有的OTU數(shù)，花瓣上的數(shù)字代表該樣品特有的OTU數(shù)目。由圖9A可知，4 ℃貯藏樣品核心OTU共有30 個(gè)，核心共有OTU數(shù)占總數(shù)的18.63%，說明蟠龍菜貯藏期間菌相具有較大變化。蟠龍菜制作當(dāng)天樣品中特有OTU數(shù)為48，在貯藏10 d時(shí)特有OTU數(shù)為11，貯藏20 d時(shí)上升至55，30 d時(shí)下降到9，40 d時(shí)為8，最后2 個(gè)階段OTU數(shù)幾乎持平。結(jié)果表明，貯藏期間菌群不斷演化；20 d時(shí)有最高數(shù)量的特有菌株，表明這個(gè)階段微生物處于快速生長時(shí)期，菌株較為豐富。

由圖9B可知，20 ℃貯藏樣品核心OTU數(shù)為17，核心共有OTU數(shù)占總數(shù)的比例為11.64%，說明樣品微生物多樣性在貯藏期間同樣具有較大變化。0～5 d樣品中特有OTU數(shù)從34降低至24，在貯藏10 d時(shí)降到最低值6，此后上升至19后又下降至8，25～30 d時(shí)幾乎持平，分別為18和20，表明貯藏期間菌群不斷演化。

由圖10可知，2 組樣品共有OTU數(shù)為291，且占比為63.54%。常溫貯藏樣品特有OTU數(shù)為44，4 ℃貯藏樣品中特有OTU數(shù)為123，約為常溫貯藏樣品的3 倍，這表明低溫環(huán)境有利于生產(chǎn)過程中引入的外源微生物的生長繁殖。常溫貯藏樣品特有OTU較少可能是由于在短時(shí)間內(nèi)優(yōu)勢腐敗菌取得競爭優(yōu)勢，從而在一定程度上抑制了其他微生物生長。

2.7 傳統(tǒng)培養(yǎng)法微生物菌種鑒定結(jié)果

由表3可知，16S rDNA全長擴(kuò)增測序比對后鑒定出的細(xì)菌分別為腸桿菌屬（Enterobacter）、分散潘托菌（Pantoea dispersa）、托霍尼斯假單胞菌（Pseudomonas tohonis）、托拉假單胞菌（Pseudomonas juntendi）和耐冷假單胞菌（Pseudomonas psychrotolerans）。腸桿菌屬細(xì)菌在自然界中廣泛分布，例如土壤、水體、植物及動物腸道，它們能利用多種碳源，并且具有分解復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)的能力。在食品工業(yè)中，這些細(xì)菌可能參與食品腐敗過程，對人類健康和食品安全構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)。分散潘托菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，屬于泛菌屬，通常具有較高的基因多樣性，并且能產(chǎn)生生物膜[29]，這使得它們能夠適應(yīng)不同生態(tài)位和環(huán)境壓力。雖然分散潘托菌主要與植物相關(guān)，但在某些情況下，它也可能與人類和動物的感染有關(guān)[30]。

假單胞菌屬是一類革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，廣泛存在于自然界中，包括土壤、水體和植物表面，且具有代謝多樣性和適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)。大量研究表明，假單胞菌在低溫肉制品中廣泛存在，且生長迅速，為優(yōu)勢菌種[31-32]。從蟠龍菜中分離出的托霍尼斯假單胞菌在低溫（0～10 ℃）、高濕環(huán)境中能發(fā)展成為優(yōu)勢菌群，這使它在冷藏食品的腐敗過程中尤為重要。托拉假單胞菌能在較寬的溫度范圍（4～40 ℃）和鹽質(zhì)量濃度范圍（1～7 g/100 mL NaCl）內(nèi)生長[33]，但該細(xì)菌在食品中的腐敗作用鮮見報(bào)道。耐冷假單胞菌能夠在低溫環(huán)境中生長和繁殖，不僅代謝能力強(qiáng)，而且能分解多種有機(jī)物，因而可能在蟠龍菜低溫貯藏中的腐敗過程中發(fā)揮一定作用。

結(jié)合高通量測序結(jié)果，假單胞菌屬的細(xì)菌相對豐度處于前10位，可將其作為潛在優(yōu)勢腐敗菌。因此在蟠龍菜加工和貯藏過程中，將假單胞菌屬的細(xì)菌作為抑菌防腐的重點(diǎn)之一有助于開發(fā)有效的防腐策略，以延長蟠龍菜保質(zhì)期并確保食品安全。

3 結(jié) 論

在所有蟠龍菜樣品中相對豐度最大的10 個(gè)屬占總豐度的98.86%。在各貯藏溫度條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長，屬水平上細(xì)菌的豐度存在明顯波動。低溫貯藏蟠龍菜的物種豐富度在40 d內(nèi)隨時(shí)間的延長不斷上升，貯藏后期較初期物種多樣性減少。常溫貯藏樣品的菌群豐富度降低后波動上升，物種多樣性在貯藏期間不斷增加。同時(shí)，常溫貯藏樣品中優(yōu)勢菌群在較短時(shí)間內(nèi)取得競爭優(yōu)勢，菌相變化更為顯著。根據(jù)高通量測序結(jié)果，推測常溫貯藏蟠龍菜的腐敗菌為氣單胞菌屬和不動桿菌屬，低溫貯藏蟠龍菜的腐敗菌為氣單胞菌屬、不動桿菌屬和類芽孢桿菌屬。采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法從冷藏蟠龍菜中分離出托霍尼斯假單胞菌、托拉假單胞菌和耐冷假單胞菌3 種假單胞菌，推測假單胞菌屬的細(xì)菌為潛在腐敗菌。本研究對4、20 ℃貯藏蟠龍菜樣品不同階段菌群動態(tài)變化及優(yōu)勢腐敗菌進(jìn)行探討，識別出核心優(yōu)勢微生物，對于后續(xù)產(chǎn)品針對性腐敗控制、保質(zhì)期延長和質(zhì)量提升提供了一定理論支持，對其工業(yè)化和規(guī)模化發(fā)展具有一定現(xiàn)實(shí)意義。

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