關鍵詞：咖啡炭疽?。恢虏⌒?；生物學特性；拮抗菌篩選

中圖分類號：S435.712 文獻標志碼：A

咖啡是茜草科咖啡屬多年生經(jīng)濟作物，其產(chǎn)量及消費量是世界三大飲料作物（咖啡、茶葉、可可）之首。我國咖啡種植主要集中于云南和海南，云南作為咖啡的主產(chǎn)區(qū)，種植面積達11.8 萬hm²，98%的咖啡來自云南[1-2]。炭疽病是咖啡的一種常見病害，對咖啡果實的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重損失。當下咖啡炭疽病的防治一般多以百菌清、波爾多液等化學農(nóng)藥為主要手段，輔以修枝、清理病葉等手段，但長期使用化學農(nóng)藥易造成農(nóng)藥殘留、水源污染、土壤產(chǎn)生抗藥性等問題[3]。而生物防治具有無污染、無公害、高效等優(yōu)點，在各種病害的綜合防治中發(fā)揮著越來越重要的作用[4]。因此，明確云南咖啡炭疽病病原菌的生物學特性以及找到適合的生防菌對其進行生物防治，對云南咖啡產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

相關研究發(fā)現(xiàn)，卡哈瓦炭疽菌（Colletotrichumkahawae）會引發(fā)咖啡漿果?。–BD），導致高達80%的產(chǎn)量損失。膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C. acutatum）也發(fā)生在咖啡上，并導致成熟漿果疾病[5]，而且膠孢炭疽菌還被證實是引起老撾小粒種咖啡炭疽病的病原[6] 。CRISTóBAL-MARTíNEZ 等[7]在墨西哥咖啡發(fā)病的葉片、枝條和漿果上分離鑒定得到C. gigasporum、C. gloeosporioides 、C. karstii 、C.siamense 和C. theobromicola 等5 種炭疽菌。CAO等[8]報道了C. endophytica、C. fructicola、C. ledongense、C. siamense、C. tropicale、C. karstii和C. gigasporum 等海南地區(qū)咖啡的8 種炭疽病病菌。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所熱帶特色經(jīng)濟作物病害研究室于2018—2019 年，在云南省和海南省9個咖啡種植基地通過采集具典型炭疽病病癥的咖啡葉片進行病原菌分離，經(jīng)組織分離、純化，共獲得74個菌株，綜合相關研究數(shù)據(jù)表明，咖啡炭疽病在我國的發(fā)生情況比較嚴重[9]。

目前，咖啡炭疽病拮抗細菌以芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，拮抗真菌以木霉屬（Trichoderma）為主，且多數(shù)拮抗菌來源于根際土壤或者植物體內(nèi)，少有分離篩選自昆蟲的拮抗菌。ADEBANJO等[10]發(fā)現(xiàn)2 株綠色木霉菌（T. viride）對接種有炭疽病菌的種子具有良好的抗感染保護作用。汪遠等[11]從紅樹植物秋茄植株內(nèi)分離得到的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌Kc-38 菌株，開展該菌株對芒果炭疽病的防治研究，其防治效果可達到65.12%。RODRíGUEZ 等[12]通過研究發(fā)現(xiàn)，孢裂鏈霉菌（Ascochyta phaseoloru）對咖啡幼苗上的膠孢炭疽菌具有較高的抑制活性，對咖啡幼苗葉面施用孢裂鏈霉菌7 d 后，在咖啡幼苗葉片接種膠孢炭疽菌，可使咖啡炭疽病發(fā)病率降至32%～41%。陳梅春等[13]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌FJAT-2349 對枇杷炭疽病菌有抑制作用，其抑制率達87.8%，且該菌株的脂肽物質(zhì)也可有效抑制枇杷炭疽病菌。張曉勇等[14]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌SB023 的發(fā)酵液對芒果炭疽病病原菌有較好抑制活性。梁艷瓊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌JNC2 對柱花草炭疽病菌的抑制效果較好，其抑菌率可達66%以上。蔡甜星等[16]利用從土壤中分離得到的放線菌V17對膠孢炭疽菌進行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)該菌株可以通過抑制菌絲和孢子生長而抑制病原菌的生長。任森等[17]從昆蟲腸道中獲得10 株木霉菌，平板對峙顯示加納木霉（T. ghanense）HNDF-T-6 對芒果炭疽病菌的抑菌率可高達85.64%。張靜雅等[18]從木薯根際土中分離得到對木薯炭疽病菌具抑制效果的短密木霉（T. brevicompactum）、棘孢木霉（T. asperellum）和長枝木霉（T. longibrachiatum），其中長枝木霉ZJB3-12 對木薯炭疽病菌的抑制效果最好。炭疽病發(fā)生為害較廣，但對咖啡炭疽病的相關研究較少，并且鮮有對咖啡炭疽病進行拮抗菌篩選的相關研究。實驗室前期從景洪市大窩塘村采集感染炭疽病的新鮮咖啡病葉，并分離鑒定出4 株咖啡炭疽病菌，本研究對4 株病原菌進行生物學特性研究，選用實驗室已有不同來源的拮抗菌，采用平板對峙法篩選出對病原菌具有較好抑制作用的生防菌株，為咖啡炭疽病生物防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株病原菌：供試病原菌共4 株，暹羅炭疽菌（C. siamense）、果生刺盤孢菌（C.fructicola）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、草莓炭疽病菌（C. theobromicola）各1 株。

拮抗菌：供試拮抗菌共26 株，包括10 株芽孢桿菌（Bacillus sp.）、1 株迪茨氏菌（Dietzia sp.）、6 株泛菌（ Pantoea sp. ） 、3 株類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）、1 株微桿菌（Microbacteriumsp.）、1 株腸桿菌（Enterobacter sp.）、1 株莫拉菌（Moraxella sp.）、1 株紅球菌（Rhodococcus sp.）、1 株不動桿菌（Acinetobacter sp.）、1 株克呂沃爾氏菌（Kluyvera sp.）。其中，21 株分離自澤蘭實蠅（Procecidochares utilis）幼蟲、3 株分離自美洲大蠊（Periplaneta americana）、2 株分離自土壤。均保存于本實驗室，備用。

1.1.2 供試培養(yǎng)基馬 鈴 薯 蔗 糖 瓊脂培養(yǎng)基（PSA）：馬鈴薯20 g/L，蔗糖2 g/L，瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯20 g/L，葡萄糖2 g/L，瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌30 min。

燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA）：燕麥3 g/L，瓊脂1.8 g/L，121 ℃滅菌30 min。

察氏培養(yǎng)基（Czapek）：硝酸鈉0.2 g/L，磷酸氫二鉀0.1 g/L，氯化鉀0.05 g/L，硫酸鎂0.05 g/L，硫酸亞鐵0.001 g/L，蔗糖3 g/L，瓊脂2 g/L，121 ℃滅菌20 min。

葡萄糖CAM 培養(yǎng)基：玉米粉20 g/L，葡萄糖2 g/L，瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/L，酵母提取物0.5 g/L，氯化鈉1 g/L，瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑和儀器蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、酵母浸粉和氯化鈉等分析純試劑均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。超凈工作臺購自江蘇安泰空氣技術有限公司，冰箱購自青島海爾股份有限公司，高壓滅菌鍋購自ZEALWAY GR85DA，–80 ℃超低溫冰箱購自THErmo 906，SPX-300B-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，普通天平購自賽多利斯科學儀器有限公司，人工氣候箱購自寧波東南儀器有限公司，電熱鼓風恒溫干燥箱購自上海市崇明實驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 致病性測定參考徐丹丹等[19]的方法，略有改動。將菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，在28 ℃的條件下培養(yǎng)7 d，備用。選擇新鮮、健康、大小均一的咖啡嫩葉作為接種材料，在接種前，先用3%～5%的次氯酸鈉水溶液浸泡10 min，然后于70%酒精浸泡30 s，再用滅菌水沖洗3 次，用無菌濾紙吸干組織表面殘留的水分，置于接種盤中。取菌株生長過程中產(chǎn)生的橘紅色分生孢子團于無菌水中，將其配成濃度為105 個/mL 的孢子懸浮液。各取50 μL 孢子懸浮液于葉片穿刺部位進行涂抹接種，每個處理重復3 次，并以穿刺不接種的咖啡葉片作為對照（CK）。處理后的咖啡葉片置于培養(yǎng)皿中保持濕潤處理，于28 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。定期觀察葉片產(chǎn)生的病斑情況，選擇病斑最大即致病性最強的病原菌進行后續(xù)實驗。

1.2.2 病原菌株生物學特性研究（1）不同培養(yǎng)基對真菌菌絲體生長的影響。在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 的病原菌在無菌環(huán)境下打成直徑為6 mm的菌餅，分別接種到PDA、PSA、OA、Czapek、葡萄糖CAM 培養(yǎng)基上。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔12 h 通過十字交叉法測定并記錄菌絲直徑。每個處理設置3 個重復。比較不同培養(yǎng)基對菌絲體生長速率的影響。

（2）不同碳源對真菌菌絲體生長的影響。參考王漢榮等[20]和張春霞等[21]的方法，并略作修改。以Czapek 培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別加入等量的葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、淀粉、乳糖替換Czapek 培養(yǎng)基中的蔗糖，配置對應培養(yǎng)基，以蔗糖為碳源作對照。根據(jù)1.2.2-（1）的方法，比較不同碳源對菌絲體生長速率的影響。

（3）不同氮源對真菌菌絲體生長的影響。與1.2.2-（1）相同，以Czapek 培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別加入等量的賴氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、胰蛋白胨、氯化銨替換Czapek 培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配置對應培養(yǎng)基，以硝酸鈉為氮源作對照。根據(jù)1.2.2-（1）的方法，比較不同氮源對菌絲體生長速率的影響。

（4）不同溫度對真菌菌絲體生長的影響。以上述試驗獲得的最適培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，設置15、20、25、28、30、37 ℃ 6 個不同的溫度梯度。根據(jù)1.2.2-（1）的方法，測定不同溫度條件下菌絲體的生長速率。

（5）不同pH 對真菌菌絲體生長的影響。以最適PDA 培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，用0.1%鹽酸或0.1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，設置5、6、7、8、9、10 等6 個pH 梯度。根據(jù)1.2.2-（1）的方法，測定不同pH 條件下菌絲體的生長速率。

（6）光照時長對真菌菌絲體生長的影響。以最適PDA 培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，設置3 個不同光照條件，L∶D 分別為24∶0、12∶12、0∶24。根據(jù) 1.2.2-（1）的方法，測定不同光照條件下菌絲體的生長速率。

1.2.3 室內(nèi)拮抗菌的篩選參照何明川等[22]的方法。供試拮抗菌提前在LB 液體培養(yǎng)基中活化，然后將發(fā)酵液稀釋涂布，得到相應的菌株，再接種至LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。用無菌牙簽在距菌餅約2 cm 處以“十”字線對稱接種拮抗菌，開展平板對峙試驗，然后置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理設置3 個重復。與對照組進行比較，計算抑菌率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 20.0 、GraphPad Prism 8.0 和Microsoft Excel 2010 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析和制作圖表[23]；采用Duncan’s 新復極差法檢驗不同處理間的差異顯著性。

相關計算公式：菌落直徑（cm）=（橫徑+縱徑）/2；抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%，其中處理菌落直徑為對稱拮抗菌兩點間的距離減去拮抗菌的抑菌圈半徑[22]。

2 結果與分析

2.1 病原菌致病性測定

致病性結果如圖1 所示，Wyq1、Yyq1、Xbd1、Hb1 菌株均能侵染新鮮健康的咖啡葉片并引發(fā)癥狀。用橘色粘團配置的孢子液侵染4 d 后，葉片發(fā)病癥狀為：Wyq1 菌株侵染后的病斑直徑為6.8～9.2 mm；Yyq1 菌株侵染后的病斑直徑為4.5～6.4 mm；Hb1 菌株侵染后的病斑直徑為7.2～10.1 mm ； Xbd1 菌株侵染后的病斑直徑為19.0～23.0 mm；而CK 葉片僅有穿刺后氧化留下的孔洞。結果表明Xbd1 菌株的致病性最強。

2.2 咖啡炭疽病病原真菌生物學特性

2.2.1 不同培養(yǎng)基對真菌菌絲體生長的影響如圖2 所示，在不同培養(yǎng)基上，Xbd1 菌株的菌絲生長有差異。可以看出培養(yǎng)132 h 后適合Xbd1 菌株生長的培養(yǎng)基有PDA、PSA、Czapek 培養(yǎng)基，菌落直徑分別達53.1、52.8、52.4 mm，但在葡萄糖CAM 培養(yǎng)基（CPA）上，其菌落直徑僅42.4 mm，表明葡萄糖CAM 培養(yǎng)基不適宜菌株Xbd1 生長，PDA 培養(yǎng)基是其最適生長培養(yǎng)基。

2.2.2 不同碳源對真菌菌絲體生長的影響如圖3 所示，培養(yǎng)132 h 后，Xbd1 菌株菌絲體在葡萄糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖不同碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑無顯著差異，菌落直徑分別為53.4、53.2、52.7、52.4 mm，而以乳糖為碳源的培養(yǎng)基中其菌落直徑最小，僅為39.1 mm，生長速度相對較慢。因此，Xbd1 菌株生長的最適碳源為葡萄糖。

2.2.3 不同氮源對真菌菌絲體生長的影響如圖4 所示，培養(yǎng)132 h 后，Xbd1 菌株在不同氮源中對有機氮源和無機氮源的利用差異顯著。以胰蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中，其菌落直徑最大為52.6 mm，其次是硝酸鈉和酵母浸膏，菌落直徑分別為52.4、46.0 mm，牛肉浸膏和賴氨酸培養(yǎng)基中的菌落直徑較小，分別為41.3、37.2 mm，以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基中其菌落直徑最小，僅21.0 mm，氯化銨是最不適合該菌株生長的氮源。因此，Xbd1 菌株的最適氮源為胰蛋白胨。

2.2.4 溫度對真菌菌絲體生長的影響如圖 5 所示，在15～28 ℃時，隨溫度的升高，Xbd1 菌株的菌落直徑逐漸增大，30 ℃時菌落直徑逐漸減小，37 ℃時菌株生長受到嚴重抑制，菌絲無法在PDA培養(yǎng)基上擴展。從菌落直徑來看，Xbd1 菌株生長的最適溫度為28 ℃，其菌落直徑為53.9 mm。

2.2.5 pH 對真菌菌絲體生長的影響如圖 6 所示，在不同pH 條件下，Xbd1 菌株菌絲的營養(yǎng)生長差異不顯著，在pH 為5～10范圍內(nèi)該菌株均可以較好生長，pH 為7時營養(yǎng)生長最快，其菌落直徑為52.1 mm。

2.2.6 光照時長對真菌菌絲體生長的影響如圖7 所示，Xbd1 菌株在不同光照時長下的生長存在顯著差異。該菌株在24 h 光照條件下生長最好，其菌落直徑為54.0 mm；其次是12 h 光照；0 h 光照條件下菌株生長情況最差，其菌落直徑僅36.4 mm。

2.3 拮抗菌的篩選

通過拮抗菌的室內(nèi)平板對峙試驗，由表1可知，26株供試拮抗菌中（表中未體現(xiàn)抑制率為0的菌株），僅有5 株芽孢桿菌具有拮抗效果，其抑菌活性均較好，分別為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）MC4-2、特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）D5-8、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）MC2-1、彎曲芽孢桿菌（B. flexus）ZLSY3 和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliticus）GJ7，其中枯草芽孢桿菌MC4-2 的抑菌效果最好，抑菌率為57.8%；其次是貝萊斯芽孢桿菌MC2-1，抑菌率為55.8%；特基拉芽孢桿菌D5-8 抑制率較低，僅為47.0%。

3 討論

膠孢炭疽菌屬子囊菌亞門腔孢綱黑盤孢目黑盤孢科炭疽菌屬真菌，病原菌分生孢子長圓形、圓柱形或橢圓形，單細胞，無色[24]，是一種咖啡的弱病原體，感染成熟漿果，導致壞死病變。該病原菌也可以引起辣椒、芒果、檸檬、橡膠[25]、大豆等其他作物的炭疽病。徐丹丹等[19]采用孢子懸浮液對咖啡葉片進行致病性試驗，結果表明，分離到的咖啡炭疽菌中，與膠孢炭疽菌復合種相似的CA-16、CA-6 兩株病原菌的致病性較強，其病斑直徑可以達到19.2～25.5 mm。陸英等[26]通過菌餅接種法接種咖啡葉片，并以病斑占葉片的面積來判斷其致病力強弱，通過試驗發(fā)現(xiàn)鑒定的3種炭疽菌中，草莓炭疽菌（C. theobromicola）的致病力最強。本研究在進行致病性探究時采用孢子懸浮液涂抹接種咖啡葉片，發(fā)現(xiàn)菌株Xbd1 的病斑直徑可達19.0～23.0 mm，與菌株Yyq1、Wyq1、Hb1 相比，菌株Xbd1 的致病性最強。

光照、pH、溫度、培養(yǎng)基類型、氮源、碳源等因素對炭疽病病原菌的生長有較大影響[27]。本研究結果表明：適合菌株Xbd1 生長的培養(yǎng)基有PDA、Czapek、PSA 培養(yǎng)基，而PDA 培養(yǎng)基是最適培養(yǎng)基。肖文斐等[28]在研究膠孢炭疽菌的生物學特性時也發(fā)現(xiàn)PDA 培養(yǎng)基是最適合其生長的培養(yǎng)基，其次是PSA 培養(yǎng)基。適合Xbd1 菌株生長的最佳氮源是胰蛋白胨，最佳碳源為葡萄糖。Xbd1 菌株在15～30 ℃范圍內(nèi)均可生長，30 ℃以上生長減緩，37 ℃時嚴重抑制生長，Xbd1 菌株適宜生長的溫度范圍與黃思良等[27]的研究結果相比，Xbd1 菌株的溫度范圍稍窄。與姚錦愛等[29]研究的適宜溫度范圍一致。最適生長溫度與李菲菲[30]的研究結果一致，均為28 ℃。Xbd1 菌株對酸堿的耐受性很強，生長范圍較廣，pH 在5～11之間均可生長。Xbd1 菌株在不同的酸堿和溫度條件下均可較好生長，說明其適應性很強。李延浩[31]研究發(fā)現(xiàn)不同光照條件對菌株生長并無影響，而本研究中全光照和全黑暗條件下Xbd1 菌株長勢較好，而12 h 光照條件下菌株長勢較差，其可能與光照交替有關，說明同一病原菌在不同寄主植物上的發(fā)病情況以及生物學特性均存在一定差異。

目前炭疽菌的拮抗菌多以芽孢桿菌屬為主，芽孢桿菌具有特殊的性質(zhì)，可以產(chǎn)生抗生素，對真菌和一些細菌病原體具有拮抗活性，其代謝物可以促進植物生長，并且通過影響根際微生物，觸發(fā)宿主的防御反應提高植物的抗逆性，使芽孢桿菌成為很好的生物防治劑[32]。本研究開展炭疽病拮抗菌的篩選，拮抗細菌來源于土壤、美洲大蠊腸道以及澤蘭實蠅幼蟲。本研究篩選到5 株抑制效果較好的拮抗菌，分別是枯草芽孢桿菌（B.subtilis）MC4-2、特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）D5-8、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）MC2-1、彎曲芽孢桿菌（B. flexus）ZLSY3、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）GJ7，其中拮抗效果最好的是來自美洲大蠊腸道的枯草芽孢桿菌MC4-2，但楊苑等[33]的研究結果表明，分離自土壤的枯草芽孢桿菌對炭疽菌的抑制率最弱，僅為34%，抑菌效果的差異可能是拮抗菌不同來源導致。徐睿等[34]利用油茶內(nèi)生菌誘變獲得枯草芽孢桿菌YL13，研究表明，該菌株對5 種油茶炭疽菌[膠孢炭疽菌、暹羅炭疽菌（C. siamense）、果生炭疽菌（C. fructicola）、哈銳炭疽菌（C. horii）、山茶炭疽菌（C. camelliae）]均有拮抗效果，該菌株的發(fā)酵濾液對膠孢炭疽菌的抑制率高達83.46%。呂倩等[35]從南海深海沉積樣品中分離篩選得到一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（ B. methy lotrophicus），該芽孢桿菌產(chǎn)生的抗真菌脂肽對黃瓜炭疽病有一定的抑制作用。韓長志等[36]在核桃根際土壤中分離出芽孢桿菌，并通過平板對峙獲得其對核桃炭疽病的抑制率可達到80%以上。真菌對膠孢炭疽菌也有較好的抑制作用，胡麗杰等[37]在枸杞中分離得到4 株內(nèi)生真菌，其中鐮刀屬菌株NQ8GII4 對膠孢炭疽菌的抑制率高達93.43%。

高云慨[38]從海南芒果表面和傷口處篩選得到4 株有較好生防活性的酵母菌，其中一株蒙畢赤氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）LZ5 對芒果炭疽病菌有明顯的抑制作用。本研究僅探究拮抗菌對膠孢炭疽菌的室內(nèi)抑制作用，還應展開拮抗機制和田間防治效果方面的研究。

4 結論

通過咖啡炭疽病病原菌致病性測定及其拮抗菌篩選，明確4 株病原真菌Wyq1（C. siamense）、Yyq1（C. fructicola）、Xbd1（C. gloeosporioides）、Hb1（C. theobromicola）中Xbd1 菌株的致病性最強，對其進行生物學特性研究，并通過平板對峙篩選到對Xbd1 菌株具有抑菌效果較好的5 株拮抗菌，為咖啡炭疽病的防治及其生防菌劑的開發(fā)奠定基礎。