摘" 要：石榴花為兩性花原基，石榴胚珠為雙珠被、厚珠心的倒生型胚珠，胚珠正常發(fā)育的花為完全花，胚珠發(fā)育異常形成不完全花，花后脫落，是造成落花落果、坐果率低和樹體養(yǎng)分流失的主要原因，嚴重影響石榴產(chǎn)量和果實品質(zhì)。從石榴胚珠發(fā)育形態(tài)解剖學、內(nèi)源激素以及INO、CRC、BEL1、STK等轉錄調(diào)控因子在石榴胚珠發(fā)育中的功能等方面，綜述近年來石榴胚珠發(fā)育研究進展。

關鍵詞：石榴；完全花；不完全花；胚珠；發(fā)育機制

中圖分類號：" S665.4" 文獻標識碼：" A

文章編號：" 1002-2910（2024）05-0006-06

Research progress on the development of pomegranate ovules

ZHAO Yujie1， JIAO Jian 1， ZHENG Xianbo1， YUAN Zhaohe2*

（1.Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450046， China;2.Nanjing Forestry University， Nanjing， Jiangsu 210037，China）

Abstract：Pomegranate flower is bisexual flower primordium， abnormal ovule development forms functional maleflowers， and normal ovule development flowers are bisexualflowers. Pomegranate ovules are inverted ovules with double integuments and thick nucellate. The formation of functional maleflower is due to abnormal and stagnant development of ovule integument. Functional male flower typically drop and fail to set fruit. Thess result in flower and fruit dropping， low fruiting rate and loss of tree nutrients， which affects the yield and fruit quality of pomegranate.This review focuses on the study of pomegranate ovule development in recent years， including the morphoanatomy study ofovule development， endogenous hormones， the functions of INO， CRC， STK， and BEL1 transcriptional regulatory factors in pomegranate ovule development.

Key words：pomegranate; bisexual flower; functional male flower; ovule;developmental mechanism

收稿日期：2024-05-27

基金項目：河南省科技攻關項目（242102110284）。

*通信作者：苑兆和（1963-），男，山東招遠人，教授，從事石榴種質(zhì)資源與遺傳育種及生物信息學研究。E-mail： zhyuan88@hotmail.com

作者簡介：趙玉潔（1988-），女，河南開封人，副教授，從事果樹分子生物學與遺傳育種、石榴和蘋果發(fā)育生物學等相關研究。

E-mail： z1184985369@163.com

石榴（Punica granatumL.）是一種具有食用價值、藥用價值及保健功能的水果，深受大眾喜愛，具有巨大的市場潛力。石榴花分為完全花和不完全花兩種類型，完全花的子房肥大、室多，花柱長而直，為可育雌蕊；不完全花的胚珠發(fā)育異常，子房瘦小，室少，花柱細短，柱頭小，為不育雌蕊。石榴花為兩性花原基，不完全花雌蕊敗育是由于胚珠發(fā)育異常（胚珠內(nèi)珠被原基形成后發(fā)育停滯，導致胚珠發(fā)生不同程度的退化），不能形成卵細胞所致［1，2］。石榴胚珠為雙珠被、厚珠心的倒生型胚珠，子房中胚珠的數(shù)量直接決定石榴籽粒數(shù)量，石榴籽粒由革制堅硬的內(nèi)種皮和肥厚多汁的外種皮構成［3］，進而影響果實大小。石榴心皮愈合形成子房室后，在子房內(nèi)壁發(fā)育出半球狀胎座，然后胎座上形成許多胚珠原基。不完全花由于胚珠發(fā)育異常，花后脫落，是造成落花落果、坐果率低和樹體養(yǎng)分流失的主要原因，嚴重影響生產(chǎn)中石榴的產(chǎn)量和果實品質(zhì)。因此，研究石榴胚珠發(fā)育及其調(diào)控機制尤為重要。

1石榴胚珠發(fā)育形態(tài)解剖學研究

石榴花具有獨特的合心皮雌蕊，由一個細長花柱、盤狀柱頭和子房形成?；ㄖ闹車@著花藥，花藥在底部擴大成一個錐形柱基。石榴的子房下位，結構特殊，發(fā)育模式高度復雜。石榴完全花和不完全花花形和大小顯著不同，完全花外形筒狀，子房發(fā)育飽滿；不完全花花形鐘狀，子房敗育，花柱長度低于雄蕊高度［4，5］。突尼斯、大籽、泰山紅和Angel Red四個品種的完全花和不完全花發(fā)育形態(tài)差異明顯，不完全花的子房均為瘦小狀，且花大小明顯小于完全花。完全花花柱長度高于不完全花，且不完全花花柱長度在四個品種中無差異；完全花子房縱徑和橫徑均大于不完全花，且差異顯著［4］。以上研究表明，不同品種石榴不完全花雌蕊敗育的特征明顯，且石榴雌蕊敗育現(xiàn)象具有普遍性。

石榴胚珠為雙珠被（外珠被和內(nèi)珠被）。觀察泰山紅石榴胚珠發(fā)育的組織結構發(fā)現(xiàn)，石榴完全花和不完全花花蕾縱徑3.0～5.0 mm時，胚珠原基開始形成，胚珠形態(tài)均未出現(xiàn)差異?；ɡ倏v徑5.1～8.0 mm時，完全花胚珠伸長并開始彎曲生長，不完全花胚珠伸長生長?；ɡ倏v徑在8.1～10.0 mm時，完全花胚珠內(nèi)珠被和外珠被原基形成，并彎曲呈90°生長；不完全花胚珠彎曲生長，未觀察到珠被原基形成?；ɡ倏v徑為10.1～13.0 mm時，完全花外珠被比內(nèi)珠被較快生長，呈現(xiàn)半封閉狀態(tài)，大孢子孢原細胞和大孢子母細胞被形成；不完全花胚珠呈90°彎曲，極少胚珠分化出珠被原基?；ɡ倏v徑為13.1～15.0 mm時，完全花發(fā)育成成熟胚珠；不完全花胚珠發(fā)育停滯在珠被原基形成期［6］。以上結果證實，花蕾縱徑為8.0～13.0 mm時期是石榴胚珠發(fā)育的關鍵時期。

2石榴完全花和不完全花發(fā)育生理生化研究

2.1石榴花發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量變化分析

植物激素是調(diào)控植物生長與發(fā)育的一類重要物質(zhì)［7，8］。分析泰山紅石榴花發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量變化表明，在完全花花原基中脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）含量高可能誘導子房敗育，促進雄蕊器官發(fā)育，從而發(fā)育成為不完全花［9］。在花蕾縱徑為3.0～14.0 mm階段，不完全花中吲哚乙酸（IAA）的含量高于完全花，而在花發(fā)育后期完全花含量高于不完全花。玉米素核苷（ZR）和油菜素內(nèi)酯（BR）含量變化呈現(xiàn)相似的變化趨勢，在花蕾縱徑為10.1～20.0 mm階段，完全花中的含量高于不完全花。在花蕾縱徑為3.0～12.0 mm 階段，茉莉酸（JA）含量在完全花和不完全花中無差異；花器官成熟發(fā)育期，完全花含量高于不完全花。GA、ZR和ABA可能促進雌性花器官敗育，這與赤霉素可促進部分植物的雄性表達并參與其雄性表達相一致［10］，但與ABA對瓜類植物的雌化作用和細胞分裂素起促雌作用的報道相悖，說明同種激素對不同植物的效應并不一致，這可能是由于不同植物的調(diào)控性別表達的機理不同［8，11，12］。高含量激動素（KT）和IAA與低含量的ABA利于甜光顏石榴完全花的生長，尤其是植物激素生長促進物質(zhì)和低含量的生長抑制物質(zhì)之間的平衡，對完全花的發(fā)育和后期坐果起關鍵作用［13］。

2.2石榴花發(fā)育過程中酶活性變化分析

大量研究表明，酶活力與植物器官分化有一定的相關性。在石榴不完全花中超氧化物歧化酶SOD活性顯著高于完全花，過氧化氫酶CAT活性在完全花和不完全花中差異不顯著?？喙闲詣e分化過程中，過氧化物酶POD和SOD活性與雌性呈正相關，而CAT活性與雄性呈正相關［14］。青錢柳雌花中POD活性較高，而CAT活性在雌花中活性最低［15］。核桃雄花生理分化階段SOD活性沒有明顯的變化，而POD活性呈現(xiàn)最高峰；雌花生理分化階段SOD活性變化比較平穩(wěn)，而POD活性出現(xiàn)最高峰［16］。綜合以上研究表明，不同物種花器官分化過程中酶活性與雌雄器官分化關系也有所不同。

3" 石榴胚珠發(fā)育分子機制研究

石榴花器官發(fā)育受多種因素的影響和調(diào)控，已知調(diào)控植物胚珠發(fā)育中MADS-box［17，18］、YABBY［19-21］和TALE［22］等轉錄調(diào)控因子占據(jù)非常重要的地位（表1）。

3.1" INO基因調(diào)控石榴胚珠發(fā)育機制

植物YABBY轉錄因子家族成員INO參與胚珠極性的決定［23］和外珠被發(fā)育［24］，在單珠被和擬南芥的雙珠被中INO僅在珠被最外層細胞中特異性表達，表明INO功能在不同物種內(nèi)具有保守性［25-27］。研究報道，BRs通過BZR1介導INO的轉錄來調(diào)控外珠被的發(fā)育［28］。石榴中鑒定出一個INO同源基因，PgINO蛋白定位在細胞核具有典型的轉錄因子的亞細胞定位特性。在石榴花發(fā)育過程中，PgINO完全花表達量高于不完全花，且在完全花胚珠發(fā)育的關鍵階段表達量呈上升趨勢。轉基因功能驗證發(fā)現(xiàn)，在擬南芥花序和幼果發(fā)育期過表達石榴PgINO基因促進STK基因的表達。35S：：PgINO轉基因擬南芥株系花序形態(tài)和花苞數(shù)量與野生型較為一致，INO回補株系花苞數(shù)量較野生型數(shù)量明顯少；35S：：PgINO和35S：：PgINO/ino株系果莢和野生型擬南芥果莢形態(tài)較為一致［6］。35S：：PgINO轉基因T3株系單果莢種子平均為34.8，數(shù)量均高于野生型，且差異顯著；35S：：PgINO/ino系種子數(shù)量高于野生型，但差異不顯著。GUS組織染色結果表明，PgINO在花、種子發(fā)育中表達，但在葉片中不表達［4，6］，表明PgINO參與石榴花序、種子和種皮的發(fā)育過程。以上結果表明，石榴PgINO參與調(diào)控胚珠和種子發(fā)育。

3.2" CRC基因調(diào)控石榴胚珠發(fā)育機制

在多數(shù)植物中，CRC基因以單拷貝形式存在，但在茄科植物中以CRCa/CRCb（Petunia hybrida）或CRC1/CRC2（Solanum lycopersicum）存在［29-31］，這是由于茄科植物進化過程中的α六倍體復制的結果［32］。在矮牽牛中，2個PhCRC基因是蜜腺發(fā)育所必需的［30］；但在番茄中，SlCRCa在幼嫩花芽中特異性表達，SlCRCb在幼嫩花芽和花中表達［29，31］。在crc knu雙突變體的花分生組織發(fā)育表現(xiàn)出不穩(wěn)定性［33］，而crc突變體部分表型能被生長素運輸抑制劑所恢復［34］。在多種被子植物crc突變體中，花序分生組織的發(fā)育同樣具有不穩(wěn)定性［33］。

石榴中鑒定出一個CRC同源基因PgCRC，其蛋白定位在細胞核。在石榴胚珠發(fā)育的關鍵階段，PgCRC在完全花中的表達量高于不完全花［6］。轉基因功能研究表明，在轉錄水平上，PgCRC促進STK和SEP3表達［4，6］。35S：：PgCRC過表達擬南芥株系的花苞數(shù)量明顯減少，35S：：PgCRC/crc回交株系花苞數(shù)量也明顯較野生型數(shù)量少；35S：：PgCRC/crc株系和野生型擬南芥果莢發(fā)育正常，但35S：：PgCRC/crc株系部分果莢頂端出現(xiàn)發(fā)育缺陷［6］。35S：：PgCRC轉基因T3株系單果莢種子平均為33.6，種子數(shù)量高于野生型（平均26粒），且差異顯著；35S：：PgCRC/crc回交株系的種子數(shù)量少于野生型，且差異顯著。35S：：PgCRC轉基因株系和crc突變體回補株系的GUS染色結果表明，PgCRC在花序、種子和種皮中表達［4，6］。以上結果表明，石榴PgCRC基因參與調(diào)控胚珠發(fā)育。

3.3" BEL1基因調(diào)控石榴胚珠發(fā)育機制

BEL1在胚珠珠被和表皮細胞中表達，是調(diào)控胚珠發(fā)育的重要基因之一［41，42］。植物AG-SEP-BEL1模型調(diào)控心皮的發(fā)育，并調(diào)控WUS（WUSCHEL）表達；在胚珠中，BEL1負調(diào)控AG基因表達［43，44］。研究發(fā)現(xiàn)，WUS在bel1突變體的異常珠被組織處異位表達，表明BEL1在合點處抑制WUS的表達［44，45］。石榴BEL1同源基因功能研究表明，35S：：PgBEL1擬南芥株系花序的花苞數(shù)量明顯較野生型數(shù)量少，35S：：PgBEL1株系果莢發(fā)育正常。35S：：PgBEL1轉基因株系的種子數(shù)量均少于野生型，且差異顯著。在轉錄水平上，PgBEL1在花序發(fā)育中抑制INO和SEP3基因的表達，但可以促進CRC的表達；在幼嫩果莢中PgBEL1促進INO和SEP3基因的表達［4-6］。研究表明，PgBEL1參與調(diào)控石榴胚珠發(fā)育。

3.4" STK基因調(diào)控石榴胚珠發(fā)育機制

植物中已鑒定出的胚珠特征決定基因有擬南芥SEEDSTICK（STK，即AGL11）、SHATTERPROOF1/2（SHP1/SHP2，即AGL1/AGL5）［35，36］和矮牽牛FLORAL BINDING PROTEIN7/11（FBP7/11）［37］等。STK與FBP7/11屬于同源基因，其在決定胚珠特征、珠柄的正常生長及種子發(fā)育過程中均發(fā)揮重要的作用［36］。在擬南芥中，STK參與調(diào)控胚珠和種子正常發(fā)育，其表達具有很強的時間特異性和組織特異性［38，39］。石榴STK同源基因PgAGL11CDS全序列696 bp。PgAGL11在雌蕊中表達量顯著高于其他花器官，且在胚珠敗育關鍵時期（花蕾縱徑8.1 ～ 15.0 mm），完全花雌蕊中表達量極顯著高于不完全花雌蕊；PgAGL11過量表達轉基因擬南芥花表現(xiàn)為雄蕊變短，花瓣變小，花柱變長，柱頭表面乳突狀物質(zhì)變長［40］。研究結果初步證明，PgAGL11可能在石榴雌蕊敗育過程中發(fā)揮重要作用。

3.5石榴miR166調(diào)控胚珠發(fā)育機制

miRNA（microRNA）是一類真核生物自身基因的非編碼小分子RNAs，長度多數(shù)為21～24 nt［46，47］。在細胞核中，RNA聚合酶Ⅱ轉錄miRNA基因生成具有莖環(huán)結構的pri-miRNAs，隨后在Dicer酶剪切作用下生成miRNA/miRNA雙鏈，最終miRNA鏈在細胞質(zhì)中與AGO等蛋白結合形成RNA誘導沉默復合體，進而調(diào)控靶基因。植物miRNA自2002年在擬南芥中被首次報道以來［48］，大量研究表明其在轉錄后水平上發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，參與植物生長發(fā)育調(diào)控（表2）［47，49］。

miR165/166在分生組織活動調(diào)控方面與花器官中分生組織的形成密切相關［50］。miR165/166的過表達影響花器官發(fā)育，如在men1和jba-1D突變體中miR166被過表達，突變體的雌蕊群很小、心皮數(shù)量減少。研究表明，石榴Pg-miR166a-3p在不完全花雌蕊中表達量顯著高于完全花。35S：：Pg-miR166a-3p轉基因擬南芥植株表現(xiàn)為種莢變小、種子數(shù)量減少、株高變低、花原基數(shù)量和植株分支數(shù)量增多，種子數(shù)量減少的主要原因為胚珠原基數(shù)量減少［51］。Pg-miR166a-3p可能通過調(diào)控靶基因表達影響胚珠發(fā)育而參與調(diào)控雌蕊敗育［51］。

4" 小結與展望

石榴胚珠發(fā)育研究表明，花蕾縱徑8.0～13.0 mm是石榴不完全花胚珠敗育的關鍵階段，PgINO、PgCRC、PgBEL1和PgSTK是調(diào)控石榴胚珠發(fā)育的重要因子。但是，PgINO、PgCRC和PgBEL1上游調(diào)控因子以及PgSEPs、PgAG在石榴胚珠發(fā)育中的功能及其與胚珠發(fā)育相關基因的協(xié)同調(diào)控關系尚不明確。對石榴胚珠發(fā)育研究不僅可拓展園藝植物胚珠發(fā)育理論體系，而且對石榴花期管理具有重要的意義。

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