一、引言

2016年，為響應(yīng)聯(lián)合國(guó)可持續(xù)發(fā)展目標(biāo)（SDGs）提出的對(duì)全球清潔、安全廁所的迫切需求，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）成立ISO/PC 305項(xiàng)目組，開(kāi)始啟動(dòng)ISO 30500《無(wú)下水道衛(wèi)生系統(tǒng) 預(yù)制組合式處理單元 設(shè)計(jì)和測(cè)試安全性能通用標(biāo)準(zhǔn)》（Non-sewered Sanitation Systems—Prefabricated Integrated Treatment Units—General Safety and Performance Requirements for Design and Testing）編制工作。該文件于2018年10月正式發(fā)布實(shí)施，為世界各國(guó)提供了無(wú)下水道衛(wèi)生廁所產(chǎn)品基本性能的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)對(duì)我國(guó)廁所行業(yè)的技術(shù)發(fā)展和運(yùn)行管理具有較強(qiáng)的指導(dǎo)和規(guī)范作用。ISO 30500標(biāo)準(zhǔn)第七章“性能測(cè)試”規(guī)定了無(wú)下水道衛(wèi)生廁所系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱“廁所系統(tǒng)”）排出的固體產(chǎn)物和出水水質(zhì)要求，其健康衛(wèi)生指標(biāo)采用人體腸道致病菌、人體腸道病毒、人體腸道寄生蟲(chóng)、人體腸道原蟲(chóng)4種微生物指標(biāo)，即分別采用（埃希氏）大腸桿菌、MS2大腸桿菌噬菌體、豬蛔蟲(chóng)卵、活性產(chǎn)氣萊膜梭菌孢子作為4種人體健康衛(wèi)生指標(biāo)的指示微生物。本研究針對(duì)廁所系統(tǒng)排出的固體產(chǎn)物和出水的微生物指標(biāo)要求，通過(guò)對(duì)4種微生物指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比研究，旨在論證在國(guó)內(nèi)4種微生物作為替代指示微生物的合理性，以及在國(guó)內(nèi)可直接采用ISO 30500標(biāo)準(zhǔn)中的無(wú)下水道廁所微生物性能指標(biāo)體系的相關(guān)要求。

二、ISO 30500標(biāo)準(zhǔn)中微生物性能指標(biāo)要求

ISO 30500標(biāo)準(zhǔn)共分為8個(gè)章節(jié)和5個(gè)附錄文件。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了廁所系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和試驗(yàn)安全與性能通用要求，以及可持續(xù)管理要求。系統(tǒng)由前端（便器設(shè)施）和后端（處理裝置）組成，無(wú)需連接下水道或排水管網(wǎng)系統(tǒng)，并可收集、輸送和充分處理廁所系統(tǒng)輸入物，最終保證固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)產(chǎn)物可以安全資源利用或直接排放。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了廁所系統(tǒng)設(shè)計(jì)的總體要求、技術(shù)要求、前端附加要求、性能測(cè)試以及可持續(xù)性要求。標(biāo)準(zhǔn)第7章“性能測(cè)試”具體規(guī)定了廁所系統(tǒng)的固體產(chǎn)物、出水、臭味、氣體和噪聲的排放性能指標(biāo)參數(shù)，以及實(shí)驗(yàn)室測(cè)試和現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)證測(cè)試對(duì)應(yīng)的方法。其中，實(shí)驗(yàn)室性能測(cè)試階段及現(xiàn)場(chǎng)性能測(cè)試階段廁所系統(tǒng)排出物（固體產(chǎn)物、出水）中4類影響人體健康的微生物指示物的輸出閾值和對(duì)數(shù)減少值，具體要求如表1所示。

三、替代指示微生物篩選依據(jù)

在技術(shù)性能評(píng)估或驗(yàn)證研究中，替代微生物應(yīng)該能夠保守地估計(jì)目標(biāo)病原體的降低效率的程度。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）發(fā)布的《水處理膜分離過(guò)濾技術(shù)手冊(cè)》（Membrane Filtration Guidance Manual EPA 815-D-03-008）中對(duì)替代指示物的特征明確，由于對(duì)經(jīng)濟(jì)上或病原體特性的考慮，使用替代物可能是挑戰(zhàn)測(cè)試最可行的選擇。

水環(huán)境中病原微生物污染評(píng)價(jià)主要通過(guò)兩個(gè)方法：一是采用病原微生物的指示微生物反映水環(huán)境中病原微生物污染狀況；二是直接檢測(cè)水環(huán)境中病原微生物。病原微生物的指示微生物通常應(yīng)具備以下幾個(gè)特征：（1）僅存在于受污染水體中；（2）數(shù)量上高于待測(cè)定的病原體；（3）與病原微生物對(duì)自然條件和污染處理過(guò)程的抗性相似；（4）易于通過(guò)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)分離、鑒定和計(jì)數(shù)。

很多研究表明，水體中的病原微生物主要包括細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物和病原蠕蟲(chóng)4大類，大部分為腸源性，即由糞便污染環(huán)境，再通過(guò)消化道（糞—口途徑）進(jìn)入新的宿主。由于大腸桿菌對(duì)環(huán)境壓力及水處理的耐受力低于其他病原體，不適合用其指示其他病原體的存在情況。建立所有潛在水傳播病原體，包括細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)等的運(yùn)行目標(biāo)是不切實(shí)際的，而且也沒(méi)有充足的數(shù)據(jù)。因此，目標(biāo)被衍生為代表4類病原體的參考病原體：細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng)，每一個(gè)類別在該類別內(nèi)病原體的物理化學(xué)和生物學(xué)特性以及對(duì)各種處理技術(shù)的抗性方面都是獨(dú)特的。

四、技術(shù)性能評(píng)價(jià)的試驗(yàn)設(shè)施和實(shí)驗(yàn)室要求

產(chǎn)品計(jì)數(shù)性能評(píng)價(jià)等需要在適當(dāng)?shù)脑O(shè)施中進(jìn)行微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)，以滿足基于風(fēng)險(xiǎn)的性能指南或相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。因此，建議由受過(guò)微生物學(xué)和水質(zhì)科學(xué)及其實(shí)驗(yàn)室分析方法方面培訓(xùn)和經(jīng)驗(yàn)豐富的人員在適當(dāng)且最好是經(jīng)過(guò)認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室中對(duì)產(chǎn)品技術(shù)的性能進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于人類病原體的技術(shù)驗(yàn)證研究等測(cè)試應(yīng)在被認(rèn)證為生物安全二級(jí)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

而對(duì)于非致病性微生物的技術(shù)研究類檢測(cè)，如大腸桿菌的非致病性菌株、非致病性細(xì)菌孢子和細(xì)菌病毒（例如大腸桿菌噬菌體），建議應(yīng)在獲得生物安全一級(jí)認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。因此，如果在無(wú)生物安全認(rèn)證的國(guó)家進(jìn)行此類測(cè)試，則鼓勵(lì)實(shí)驗(yàn)室滿足并遵循世界衛(wèi)生組織（WHO）《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》中所述的規(guī)范。

另外，WHO也建議在試驗(yàn)挑戰(zhàn)的水體中加入足夠濃度的指示細(xì)菌、病毒和原蟲(chóng)替代物，遵循相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，研究隨著時(shí)間的推移，各指示微生物滅活的程度。建議指示細(xì)菌、病毒和原蟲(chóng)的替代物分別為大腸桿菌、大腸桿菌噬菌體和產(chǎn)莢膜梭菌或芽孢，以記錄氯或其他化學(xué)消毒處理后的對(duì)數(shù)減少值。

當(dāng)然，這些參考性替代指示微生物的選擇在不同國(guó)家和地區(qū)會(huì)有不同，要考慮當(dāng)?shù)貤l件，包括水傳播疾病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度以及原水特性，即充分考慮具有地方特點(diǎn)的流行性病學(xué)進(jìn)行篩選。

綜上所述，選擇非致病替代微生物應(yīng)用于產(chǎn)品性能評(píng)價(jià)，從可操作性以及對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求等方面都將有利于評(píng)估工作的開(kāi)展。

五、微生物性能指標(biāo)體系替代指示微生物對(duì)標(biāo)研究

（一）腸道細(xì)菌篩選——（埃希氏）大腸桿菌作為替代指示菌對(duì)標(biāo)研究

以往，關(guān)于污水處理系統(tǒng)的出水水質(zhì)要求以及水體中微生物性能測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)和指南都是基于大腸菌群的減少。目前常用的腸道致病菌指示物包括總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌與腸球菌等。

1．各種腸道致病菌指示糞便污染情況分析

從表2可以看出，大腸桿菌與腸球菌是優(yōu)于總大腸菌群、糞大腸菌群的糞便指示物，在污染嚴(yán)重的水體中，沙門(mén)氏菌亦可用于技術(shù)性能評(píng)估或驗(yàn)證，三者均可作為腸道細(xì)菌的替代指示微生物。當(dāng)病原體檢測(cè)不可行時(shí)，推薦使用非致病性大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株進(jìn)行水處理技術(shù)的細(xì)菌挑戰(zhàn)性檢測(cè)。

2．國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中大腸桿菌指標(biāo)規(guī)定

國(guó)內(nèi)外污泥及污水中關(guān)于大腸桿菌指標(biāo)要求的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)如表3所示。

當(dāng)前，美國(guó)EPA、歐盟及WHO等推薦選用腸球菌和大腸桿菌指示糞便污染，我國(guó)現(xiàn)階段仍較多采用糞大腸菌群作為糞便指示物。在國(guó)內(nèi)可以采用ISO 30500標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于腸道細(xì)菌替代指示微生物大腸桿菌的相關(guān)規(guī)定。

（二）腸道病毒篩選——MS2大腸桿菌噬菌體以及SC噬菌體、F-RNA噬菌體作為替代指示微生物的對(duì)標(biāo)研究

1．腸道病毒選擇細(xì)菌病毒噬菌體作為指示病毒的原因

腸道病毒選擇細(xì)菌病毒噬菌體作為指示病毒的原因主要有以下幾個(gè)方面：（1）在污水中普遍存在，其數(shù)量高于腸道病毒；（2）對(duì)自然條件及水處理過(guò)程的抗性高于細(xì)菌，接近或超過(guò)動(dòng)物病毒；（3）噬菌體是細(xì)菌病毒，可作為人類病毒的替代品，對(duì)人沒(méi)有致病性，可進(jìn)行高濃度接種和現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)；（4）檢測(cè)噬菌體的操作具有簡(jiǎn)便快速、安全、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

目前，噬菌體作為模式病毒，已被用于評(píng)價(jià)水和污水的處理效率、闡明病毒滅活機(jī)理以及改進(jìn)病毒檢測(cè)方法等領(lǐng)域的研究。大腸桿菌噬菌體可以用于評(píng)估通過(guò)過(guò)濾過(guò)程去除病毒的有效性或測(cè)量消毒過(guò)程的有效性。美國(guó)EPA也提出用大腸桿菌噬菌體作為病毒指示微生物。

2.SC噬菌體和F-RNA噬菌體作為比較典型的大腸桿菌噬菌體的區(qū)別

從表4可以看出，SC噬菌體和F-RNA噬菌體均可作為腸道病毒的替代指示微生物。

3.國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中SC噬菌體和F-RNA噬菌體指標(biāo)規(guī)定

國(guó)內(nèi)外污泥及污水中關(guān)于SC噬菌體和F-RNA噬菌體指標(biāo)要求的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)如表5所示。

從表中可以看出，國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)污水或糞便中關(guān)于SC噬菌體和F-RNA噬菌體的標(biāo)準(zhǔn)要求，在國(guó)內(nèi)可以采用ISO 30500標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于腸道病毒替代指示微生物F-RNA噬菌體的相關(guān)規(guī)定。

（三）腸道蠕蟲(chóng)篩選——豬蛔蟲(chóng)卵作為替代指示微生物的對(duì)標(biāo)研究

蠕蟲(chóng)可以以成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)、卵或卵子的形式存在。卵和幼蟲(chóng)具有高度傳染性，潛伏期長(zhǎng)，在環(huán)境中持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、感染劑量低，沒(méi)有任何實(shí)際的宿主免疫力，對(duì)環(huán)境污染和消毒具有很高的抵抗力，是廢水和污泥中最難滅活的生物寄生蟲(chóng)。

1.豬蛔蟲(chóng)卵作為腸道蠕蟲(chóng)替代指示生物原因

蛔蟲(chóng)是已知的最頑強(qiáng)的蠕蟲(chóng)，已被用作模型寄生蟲(chóng)，以確定處理廢水和污泥的質(zhì)量；蛔蟲(chóng)卵在不利的pH值、干燥和溫度條件下被發(fā)現(xiàn)是對(duì)滅活最具抵抗力的蠕蟲(chóng)卵屬。

在研究廢水和污泥中蠕蟲(chóng)卵的去除效果時(shí)，由于豬蛔蟲(chóng)對(duì)人類的感染性較低，在形態(tài)學(xué)上與蛔蟲(chóng)相同，并且顯示出98.1%的遺傳相似性，因此常被用作蛔蟲(chóng)的替代物。

2.國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中蛔蟲(chóng)卵指標(biāo)規(guī)定

國(guó)內(nèi)外污泥及污水中關(guān)于蛔蟲(chóng)卵指標(biāo)要求的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)如表6所示。

國(guó)內(nèi)目前僅對(duì)污水和污泥中的蛔蟲(chóng)卵死亡率做了相關(guān)要求，尚無(wú)污水或糞便中關(guān)于蛔蟲(chóng)卵活卵數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)要求。在國(guó)內(nèi)可以采用ISO 30500標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于腸道蠕蟲(chóng)替代指示微生物豬蛔蟲(chóng)卵的相關(guān)規(guī)定。

（四）腸道原蟲(chóng)篩選——活性產(chǎn)氣莢膜梭菌孢子作為替代指示微生物的對(duì)標(biāo)研究

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一類廣泛存在于人類與動(dòng)物糞便及污水中的腸道致病菌，屬厭氧菌，只能在無(wú)氧條件下繁殖。產(chǎn)氣莢膜梭菌在大多數(shù)水體中不繁殖，而且是糞便污染的特異性指示菌。其孢子與賈第鞭毛蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)等的孢子在水體中存活時(shí)間相當(dāng)，數(shù)量與寄生蟲(chóng)污染程度有一定相關(guān)性，故常用于指示此類原蟲(chóng)的污染。

1.產(chǎn)氣莢膜梭菌孢子作為腸道原蟲(chóng)替代指示微生物原因

產(chǎn)氣莢膜梭菌孢子由于對(duì)化學(xué)消毒和環(huán)境穩(wěn)定性的抵抗，被認(rèn)為是隱孢子蟲(chóng)卵囊在處理過(guò)程和運(yùn)輸模型中的實(shí)驗(yàn)替代物。在物理過(guò)濾過(guò)程中，1 μm的孢子可作為更大的（5 μm）卵囊的活動(dòng)方式的保守指標(biāo)。由于對(duì)氯滅活的抗性，它們也可能是化學(xué)消毒法滅活后隱孢子蟲(chóng)的最佳替代物。Venczel等人（1997）發(fā)現(xiàn)，對(duì)于混合氧化消毒劑，這兩種微生物的滅活方式很相似，但相比于隱孢子蟲(chóng)卵囊暴露在游離氯中4小時(shí)內(nèi)沒(méi)有測(cè)量到滅活量，而產(chǎn)氣莢膜梭菌卻在4小時(shí)內(nèi)被滅活了1.4 log10。因此可認(rèn)為產(chǎn)氣莢膜梭菌孢子比隱孢子蟲(chóng)卵囊具有更強(qiáng)的抵抗能力。

Payment等人發(fā)現(xiàn)，在水處理過(guò)程中，產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌與隱孢子蟲(chóng)、賈第蟲(chóng)和人類腸道病毒有很好的相關(guān)性。紫外線輻射和微生物熱滅活對(duì)細(xì)菌孢子的殺滅效果不如對(duì)原生動(dòng)物、營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌和病毒的殺滅效果好。因此，產(chǎn)氣莢膜梭菌孢子可以提供一個(gè)保守的指標(biāo)，證明這些技術(shù)對(duì)水傳播原生動(dòng)物如隱孢子蟲(chóng)、賈第蟲(chóng)和內(nèi)阿米巴的有效性。

2.國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中產(chǎn)氣莢膜梭菌/芽孢指標(biāo)規(guī)定

國(guó)內(nèi)外污泥及污水中關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌/芽孢指標(biāo)要求的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)如表7所示。

國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)污水或糞便中關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌及其芽孢的標(biāo)準(zhǔn)要求，可以采用ISO 30500標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于腸道原蟲(chóng)替代指示微生物產(chǎn)氣莢膜梭菌/芽孢的相關(guān)規(guī)定。

六、結(jié)論與建議

（一）結(jié)論

一是通過(guò)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌、MS2大腸桿菌噬菌體、豬蛔蟲(chóng)卵以及活性產(chǎn)氣莢膜梭菌孢子作為指示微生物的優(yōu)勢(shì)為：（1）它們?cè)谛螒B(tài)特征、理化特性、抗性及試驗(yàn)操作等方面具有作為水體中腸道病原體指示物的基本條件；（2）它們對(duì)人類的感染性較低，或不對(duì)人類致?。唬?）它們?cè)趯?shí)際操作與應(yīng)用中更便捷，因此作為腸道細(xì)菌、腸道病毒、腸道蠕蟲(chóng)、腸道原蟲(chóng)的替代指示微生物技術(shù)上是可行的。

二是在國(guó)內(nèi)可以直接引用ISO 30500標(biāo)準(zhǔn)中的無(wú)下水道廁所微生物性能指標(biāo)體系的相關(guān)要求。

三是腸球菌及沙門(mén)氏菌亦可作為腸道細(xì)菌替代指示微生物，SC噬菌體亦可作為腸道病毒替代指示微生物。

四是豬蛔蟲(chóng)卵作為商業(yè)化樣本采購(gòu)經(jīng)調(diào)研缺乏專門(mén)的供應(yīng)商，后續(xù)實(shí)驗(yàn)室性能測(cè)試應(yīng)考慮適當(dāng)調(diào)整。

（二）建議

一是我國(guó)現(xiàn)階段仍較多采用糞大腸菌群作為糞便細(xì)菌指示物，建議在國(guó)內(nèi)開(kāi)展污泥及污水中大腸桿菌的相關(guān)研究。

二是國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)污水或糞便中關(guān)于SC噬菌體和F-RNA噬菌體的標(biāo)準(zhǔn)要求，建議在國(guó)內(nèi)開(kāi)展污泥及污水中SC噬菌體和F-RNA噬菌體的相關(guān)研究。

三是國(guó)內(nèi)目前僅對(duì)污水和污泥中的蛔蟲(chóng)卵死亡率做了相關(guān)要求，尚無(wú)污水或糞便中關(guān)于蛔蟲(chóng)卵活卵數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)要求，建議在國(guó)內(nèi)開(kāi)展污泥及污水中蛔蟲(chóng)卵活卵數(shù)量的相關(guān)研究。

四是國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)污水或糞便中關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌及其芽孢的標(biāo)準(zhǔn)要求，建議在國(guó)內(nèi)開(kāi)展污泥及污水中產(chǎn)氣莢膜梭菌及其芽孢的相關(guān)研究。

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（責(zé)任編輯：嚴(yán)陳玲）