摘要 為探究紫花苜蓿在石油污染下的耐受機(jī)理， 采用超聲碎促溶的方法， 將3種有機(jī)物（十二烷、十六烷和二十四烷）配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1％的混合溶液，模擬飽和烷烴污染對(duì)紫花苜蓿幼苗進(jìn)行處理， 分別對(duì)污染0，6，24 h的植株取樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，共獲得1 431個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）。 GO富集分析表明， 這些DEGs主要涉及蛋白結(jié)合、代謝途徑和催化活性等; KEGG富集分析表明， DEGs主要富集到植物病原體相互作用、MAPK信號(hào)通路和光合生物碳固定途徑等。 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果可靠。 研究結(jié)果為研究植物降解和耐受原油中飽和石油烴污染機(jī)制原理及后續(xù)篩選和培育耐石油污染植物提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 石油烴污染;紫花苜蓿;轉(zhuǎn)錄組;差異表達(dá)基因

中圖分類號(hào)：S541 DOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2024-05-011

Analysis of transcriptome data of Medicago sativatreated with saturated alkanes

LI Yan^1，2， LI Yunhao^1，2， LI Yaru^3，4， ZHAO Min^1，2， QIN Tianyu⁴， WANG Hongyue⁴， HUANG Xuan^3，4

（1.National Engineering Laboratory for Exploration and Development of Low Permeability Oil and Gas Fields，Xi’an 710018， China; 2.Changqing Oilfield Oil and Gas Technology Research Institute， Xi’an 710018， China;3.Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology， Xi’an 710069， China;4.School of Life Sciences， Northwest University， Xi’an 710069，China）

Abstract To explore the tolerance mechanism of Medicago sativa under oil pollution， this study adopted the method of ultrasonic crushing and solubilization to prepare a mixed solution of three organic compounds （Dodecane，n-Hexadecane， and n-Tetracosane） at a concentration of 1％ to simulate saturated alkanes and treat Medicago sativa seedlings. Samples were taken from plants exposed to pollution for 0h， 6h， and 24h for transcriptomic analysis. The results showed that a total of 1431 DEGs were obtained. GO enrichment analysis indicated that these DEGs were mainly involved in protein binding， metabolic pathways， and catalytic activity. KEGG enrichment analysis showed that DEGs were mainly enriched in plant pathogen interaction， MAPK signaling pathway and photosynthetic biological carbon fixation pathway. qRT-PCR was further used to verify the reliability of the results. This study provides theoretical basis for exploring the mechanism of plant degradation and tolerance of saturated petroleum hydrocarbon in crude oil pollution， as well as subsequent screening and cultivation of petroleum-tolerant plants through transcriptome analysis of Medicago sativa treated with saturated alkanes.

Keywords petroleum hydrocarbon pollutants; Medicago sativa; transcriptome; differentially expressed genes

石油由氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)的烴類組成的混合物，通常貯藏在地殼上層部分^［1］，主要包含各種烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴等化合物，被稱為“工業(yè)的血液”^［2］。近年來，隨著中國(guó)工業(yè)的蓬勃發(fā)展和人們環(huán)保意識(shí)的日益增強(qiáng)，石油污染問題日益凸顯，成為社會(huì)各界關(guān)注的焦點(diǎn)。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，學(xué)者紛紛致力于研究如何有效降解和修復(fù)進(jìn)入環(huán)境中的石油烴類污染物，以保障生態(tài)環(huán)境的持續(xù)健康發(fā)展。相較于傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法，植物修復(fù)技術(shù)是一種潛在的環(huán)保高效且成本相對(duì)低廉的修復(fù)方式^［3-4］。植物修復(fù)首先要保證植物對(duì)某種特定污染具有一定的耐受能力，進(jìn)而可以吸附降解代謝污染物^［5］。前人學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿（Richardia scabra）^［6］、高羊茅（Festuca arundinacea）^［7］、高丹草（Sorghum hybrid sudangrass）^［8］和黑麥草（Lolium perenne）^［9］等非鹽生植物在石油烴污染土壤修復(fù)方面具有很大的作用。

紫花苜蓿（Medicago sativa）屬于豆科苜蓿屬，為多年生草本植物，主要種植在中國(guó)北方干旱、半干旱地區(qū)^［10-11］，具有品質(zhì)好、蛋白質(zhì)含量高、易生長(zhǎng)和繁殖等優(yōu)點(diǎn)^［12-13］，被稱為“牧草之王”。紫花苜蓿常栽培作禽畜的青綠飼料，也可作蔬菜食用。紫花苜蓿在環(huán)境保護(hù)和土壤修復(fù)方面也具有顯著效果，它能有效地減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，防止農(nóng)藥對(duì)土壤和水體的污染^［14-15］。紫花苜蓿的深根系能防止水土流失^［16］，且根系的分泌物含有能夠降解石油烴的酶。因此，紫花苜蓿在石油污染土壤的修復(fù)方面表現(xiàn)出色，對(duì)不同地區(qū)、不同濃度的石油污染土壤都具有較好的修復(fù)效果。

紫花苜蓿作為一種重要的牧草，其研究已經(jīng)越來越深入。王天楚等將紫花苜蓿的種子在不同濃度的鎘溶液中處理后繼續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)，并對(duì)其幼苗進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿對(duì)于鎘具有一定的富集作用^［17］。熊軍波等將紫花苜蓿幼苗用NaCl處理9 d后對(duì)根部組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，揭示了紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制^［18］。Gao等將紫花苜蓿幼苗在250 mmol/L NaCl處理后生長(zhǎng)0，12，24 h進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)苜蓿中過表達(dá)MsHPCA₁可提高其耐鹽性^［19］。但是，目前關(guān)于紫花苜蓿在響應(yīng)石油污染、在污染土壤進(jìn)行原位修復(fù)的分子機(jī)制了解還較少。本研究以紫花苜蓿幼苗為材料，利用十二烷、十六烷和二十四烷3種烷烴的混合物模擬飽和烷烴污染，對(duì)其幼苗脅迫處理后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，探究受石油污染脅迫后引起的基因差異表達(dá)模式，為篩選抗性基因并闡明其耐受修復(fù)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究對(duì)于土壤修復(fù)和環(huán)境保護(hù)也具有重要理論意義。

1 結(jié)果

1.1 紫花苜蓿RNA測(cè)序質(zhì)量

對(duì)飽和烷烴脅迫處理前（0 h）和處理后6 h和24 h的紫花苜蓿植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序。各個(gè)樣品的GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過42％，且Q20gt;96％，Q30gt;94％（見表1）。以紫花苜蓿中苜一號(hào)（Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1）基因組為參考，分別將各樣品的過濾數(shù)據(jù)（Clean Reads）與參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)率超過77％，且唯一比對(duì)率在73％以上，說明測(cè)序結(jié)果可信，能滿足基因功能注釋和分析的需求，可進(jìn)行下一步分析。

1.2 主成分（Principal Component Analysis）分析

為了降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜性，評(píng)估各個(gè)樣品間的重復(fù)性，對(duì)9個(gè)測(cè)序樣品進(jìn)行了主成分分析。結(jié)果顯示，對(duì)照組和處理組之間存在差異，且對(duì)照組CK-1、CK-2和CK-3之間重復(fù)性較好，模擬石油污染脅迫6 h的WR-6h-1、WR-6h-2和WR-6h-3較為集中，模擬石油污染脅迫24 h的WR-24h-1、WR-24h-2和WR-24h-3的距離較近，樣品間重復(fù)性合理（見圖1）。

1.3 差異表達(dá)基因分析

使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2軟件對(duì)Raw Counts進(jìn)行分析，并將Padjustlt;0.05和|log₂FC|≥1作為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，與對(duì)照（CK）組相比，在模擬石油污染脅迫6 h后，共檢測(cè)到783個(gè)差異表達(dá)基因，其中480個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，而303個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。當(dāng)模擬石油污染脅迫時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，差異表達(dá)基因的數(shù)量變?yōu)?82個(gè)，其中434個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，148個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（見圖2）。

Venn圖展示了各個(gè)基因集中基因的個(gè)數(shù)及它們間的重疊關(guān)系。將3組CKvsWR-6h、CKvsWR-24h和WR-6hvsWR-24h的DEGs進(jìn)行比較得到圖3。與對(duì)照組（CK）相比，模擬石油污染6 h與24 h共有的DEGs 260個(gè)，特有的DEGs分別為523和322個(gè)，隨著污染時(shí)間的延長(zhǎng)，DEGs會(huì)有所不同。

1.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析

GO數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Ontology）是由基因本體聯(lián)合會(huì)（Gene Ontology Consortium）所建立的，是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，可以對(duì)基因和蛋白的功能進(jìn)行限定和描述。分別將CKvsWR-6h、CKvsWR-24h和WR-6hvsWR-24h的DCGs進(jìn)行GO功能富集分析。

結(jié)果顯示，在CKvsWR-6h組〔見圖4（a）〕中，差異表達(dá)基因顯著富集在生物過程（Biological Process，BP）中的水楊酸生物合成過程、水楊酸的代謝過程和氧化還原過程等，細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）中的細(xì)胞膜、質(zhì)膜、細(xì)胞膜固有成分等，以及分子功能（Molecular Function，MF）中的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶活性、血紅素結(jié)合和己轉(zhuǎn)糖移酶活性等。

在CKvsWR-24h組〔見圖4（b）〕中，差異表達(dá)基因顯著富集在生物過程（Biological Process，BP）中的次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成、次級(jí)代謝過程和谷胱甘肽代謝過程等，細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）中的胞外區(qū)、淀粉體、細(xì)胞膜等，以及分子功能（Molecular Function，MF）中的2-烯醛還原酶（NADP+）活性、硫氧還蛋白二硫化物還原酶活性和蛋白質(zhì)二硫化物還原酶活性等。

在WR-6hvsWR-24h組〔見圖4（c）〕中，差異表達(dá)基因顯著富集在生物過程（Biological Process，BP）中的細(xì)胞大分子生物合成過程、氧化還原過程和翻譯等，細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）中的核糖體、細(xì)胞內(nèi)解剖結(jié)構(gòu)、小核糖體亞基等，以及分子功能（Molecular Function，MF）中的氧化還原酶活性、抗氧化活性和過氧化物酶活性等。

以上結(jié)果表明，各類膜結(jié)構(gòu)在響應(yīng)烷烴脅迫時(shí)發(fā)揮重要的作用，水楊酸、谷胱甘肽代謝過程在模擬石油污染下紫花苜蓿的響應(yīng)方面產(chǎn)生一定影響，通過調(diào)節(jié)氧化還原系統(tǒng)及抗性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)幫助其緩解烷烴污染脅迫給機(jī)體帶來的損傷。

1.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)，包含了基因、蛋白質(zhì)、代謝物和信號(hào)通路等生物分子的綜合信息。將CKvsWR-6h、CKvsWR-24h和 WR-6hvsWR-24h的差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG富集分析。

結(jié)果顯示，在CKvsWR-6h組〔見圖5（a）〕中，差異表達(dá)基因主要富集在植物與病原體的相互作用信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝信號(hào)通路、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路和有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路等。在CKvsWR-24h〔見圖5（b）〕組中，差異基因主要富集在己糖基轉(zhuǎn)移酶活性信號(hào)通路、光合作用信號(hào)通路、光合作用天線蛋白和次級(jí)代謝物的生物合成等。在WR-6hvsWR-24h〔見圖5（c）〕組中，差異表達(dá)基因主要富集在氧化還原過程信號(hào)通路、生物合成過程信號(hào)通路、光合過程中碳固定和光合作用天線蛋白等。由以上結(jié)果推測(cè)，紫花苜蓿可能通過生物合成途徑、非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和各種氧化還原代謝途徑來響應(yīng)烷烴污染的脅迫。

1.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得了1 431個(gè)差異表達(dá)基因，選取在抗氧化相關(guān)信號(hào)通路、非生物脅迫相關(guān)的信號(hào)通路和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路中共10個(gè)最顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，與抗氧化有關(guān)的基因（P7、抗壞血酸氧化酶基因、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶基因、REDOX2、P450、WRKY7）均上調(diào)，非生物脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（NAC和MYB1）也均上調(diào)，與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因GA20ox1上調(diào)、花發(fā)育相關(guān)基因FT下調(diào)，這10個(gè)基因的表達(dá)模式與高通量測(cè)序的結(jié)果一致，從而證明了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

2 討論與結(jié)論

紫花苜蓿作為一種重要的牧草，其生長(zhǎng)和發(fā)育過程中常會(huì)受到各種環(huán)境脅迫的影響，這些脅迫可能來自干旱^［20］、土壤鹽堿度^［21］、重金屬污染^［22-23］等多種因素。紫花苜蓿在面臨脅迫時(shí)，會(huì)通過一系列的生理反應(yīng)來應(yīng)對(duì)并維持其生長(zhǎng)和代謝活性。先前，趙穎對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)無論是施加外源NO供體還是NO清除劑，在分子和生理層面均能有效調(diào)控紫花苜蓿的抗旱性能^［24］;Dong等通過比較轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合過氧化氫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽酶和脯氨酸含量的生理變化，揭示了紫花苜蓿在鹽脅迫下的響應(yīng)機(jī)制^［25］。但是，目前學(xué)者對(duì)紫花苜蓿應(yīng)對(duì)石油污染脅迫的分子機(jī)制研究較少。

本研究對(duì)模擬石油污染處理不同時(shí)間的紫花苜蓿植株的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而研究紫花苜蓿應(yīng)對(duì)模擬石油污染脅迫的深層機(jī)制，對(duì)于土壤修復(fù)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。本研究從CK vsWR-6h和CK vsWR-24 h中分別獲得783個(gè)和582個(gè)差異表達(dá)基因〔見圖2（a）、（b）〕，表明模擬石油污染脅迫時(shí)可以激活紫花苜蓿的多種修復(fù)機(jī)制來應(yīng)對(duì)不良環(huán)境。

RT-qPCR具有高靈敏度、高特異性、高通量、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)且不受物種限制^［26-27］等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定。紫花苜蓿在經(jīng)過飽和烷烴污染脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)與抗氧化相關(guān)的基因WRKY7（MsG0180000525.01）上調(diào)來響應(yīng)非生物脅迫，這與魏春梅等通過外施低濃度鈦離子發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子WRKY基因家族表達(dá)上調(diào)研究結(jié)果一致^［28］。NAC基因家族是一類在植物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用^［29-30］。本研究中，紫花苜蓿在飽和烷烴脅迫處理后，NAC家族轉(zhuǎn)錄因子（MsG0580024680.01）表達(dá)量顯著上調(diào)，與李曉宇等在研究中遼1號(hào)楊的NAC2基因在面臨鎘脅迫時(shí)，其表達(dá)水平顯著上調(diào)研究結(jié)果一致^［31］。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在植物感知和適應(yīng)外界環(huán)境脅迫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用^［32］。這一機(jī)制使得植物能夠敏銳地察覺外界環(huán)境的變化，并通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝等生理過程，有效應(yīng)對(duì)各種環(huán)境壓力，從而確保植物在多變的環(huán)境條件下能夠生存和繁衍。紫花苜蓿經(jīng)烷烴脅迫處理后，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路顯著富集，與陸程張研究Na₂CO₃脅迫下玉米苗根部轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致^［33］。本研究為進(jìn)一步探索紫花苜蓿響應(yīng)烷烴脅迫提供了有意的借鑒。

3 材料與方法

3.1 植物材料

以紫花苜蓿作為研究材料，用dH₂O浸泡過夜后播種到營(yíng)養(yǎng)土和蛭石1∶1配比的混合土中，在人工氣候室（光照強(qiáng)度為100 μmol·m^-2;溫度25 ℃;光周期為16 h光照/8 h黑暗;空氣濕度 65％）內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

3.2 模擬石油污染下的脅迫處理

待播種一周之后，將紫花苜蓿幼苗從土壤里移出，用清水洗干凈其根部并移栽到水培箱中進(jìn)行水培，加入適量的Hoagland培養(yǎng)液^［34］。待水培生長(zhǎng)20 d后，將紫花苜蓿的幼苗移栽至濃度為1％的模擬飽和烷烴污染混合溶液的水培箱中進(jìn)行脅迫處理。

1％的模擬飽和烷烴污染混合溶液的配置方法如下：分別稱取1 g的十二烷、十六烷和二十四烷于97 mL的ddH₂O中，使用超聲儀頻率為45 kHZ超聲30 min直至形成乳濁液。

分別收集脅迫6 h和24 h后的紫花苜蓿植株，以脅迫前（0 h）的紫花苜蓿植株作為對(duì)照，采集的紫花苜蓿植株經(jīng)液氮研磨成粉末后立即放入-80 ℃冰箱中保存。每個(gè)處理組重復(fù)3次，每個(gè)樣品共收集1 g材料。

3.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

所有紫花苜蓿樣本基于Illumina Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)完成轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序，測(cè)序采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。

為保證后續(xù)生物信息分析的準(zhǔn)確性，使用fastp軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，從而得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)（clean data），以保證后續(xù)分析的順利進(jìn)行。使用HISAT2^［35］軟件將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)與參考基因組（參考基因來源：Medicago_-sativa; 參考基因組版本：ZhongmuNo.1）進(jìn)行比對(duì)，獲得用于后續(xù)分析的mapped reads（可比對(duì)上序列比例），同時(shí)對(duì)本次測(cè)序的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。采用Cufflinks^［36］軟件將mapped reads（可比對(duì)上序列比例）進(jìn)行組裝拼接，與已知轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較，獲得沒有注釋信息的轉(zhuǎn)錄本，并對(duì)其中潛在的新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋。

3.4 差異表達(dá)基因DEGs的富集分析

使用軟件RSEM^［37］分別對(duì)轉(zhuǎn)錄本的整體表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，基因的相對(duì)表達(dá)量用PTM值衡量。使用BH（fdr correction with Benjamini/Hochberg）方法進(jìn)行p值的多重檢驗(yàn)校正。使用DESeq2^［38］軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，基于一定的標(biāo)準(zhǔn)化處理和篩選條件獲得比較組間表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄本；默認(rèn)參數(shù)為：Padjustlt;0.05及|log₂FC|≥1;在GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋分析^［39］。

3.5 基因的qRT-PCR驗(yàn)證

將選取的10個(gè)顯著差異基因進(jìn)行qRT-PCR分析以驗(yàn)證數(shù)據(jù)的可靠性。使用Trizol法提取對(duì)照組和處理組樣品的總RNA，cDNA按照PrimeScript 1st Strand cDNA試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成。以GAPDH作為內(nèi)參基因，各基因序列引物設(shè)計(jì)在附錄中（見表2），采用2^-△△Ct方法^［40］計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

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（編 輯 雷雁林）