關鍵詞：環(huán)境DNA;物種組成;魚類多樣性;資源調(diào)查

中圖分類號：S932.4;P74 文獻標志碼：A 文章編號：1005-9857（2024）03-0114-07

0 引言

魚類多樣性是水生生物多樣性的重要組成部分，保護魚類多樣性、掌握魚類組成和種群結(jié)構(gòu)特征，有利于保護水生態(tài)系統(tǒng)[1]。當前，對魚類多樣性的調(diào)查方法主要利用傳統(tǒng)網(wǎng)具進行捕撈，通過形態(tài)學鑒定區(qū)別魚類物種組成，對生物量計數(shù)稱重來統(tǒng)計魚類資源量并評定優(yōu)勢種[2]。此方法耗時久，對生物體和海洋環(huán)境的破壞性強，并且對形態(tài)分類學專業(yè)知識要求嚴格[3]。環(huán)境DNA 技術(shù)高效靈敏，通過DNA 序列識別生物體并描述生態(tài)系統(tǒng)特征，調(diào)查效率高于傳統(tǒng)調(diào)查方法，目前已廣泛應用于水生生物資源調(diào)查領域和瀕危物種的分布監(jiān)測[4-7]，對于了解水生物種的時空分布和生態(tài)保護具有巨大的潛力[8]。

近年來，環(huán)境DNA 技術(shù)已成為評估水生群落結(jié)構(gòu)的有力工具，為魚類資源調(diào)查提供新的思路。Yamamoto等[9]利用環(huán)境DNA 技術(shù)對日本海域47個站點的魚類群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行評估，揭示了環(huán)境DNA 檢測局部生境中的魚類群落更省時。Spear等[10]通過大眼獅鱸（Sandervitreus）在環(huán)境DNA 中的豐度證明了種群的生物量與環(huán)境DNA濃度之間呈顯著正相關，強調(diào)了環(huán)境DNA 作為種群監(jiān)測工具的效用。Czeglédi等[11]將環(huán)境DNA 技術(shù)與傳統(tǒng)方法進行比較，表明環(huán)境DNA 技術(shù)是檢測魚類群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境關系最佳的取樣方法。

舟山南部海域漁業(yè)資源豐富，近年來由于過度捕撈和環(huán)境污染等因素影響，該海域漁業(yè)資源呈衰退趨勢。為評估舟山南部海域魚類資源現(xiàn)狀，研究人員對該海域魚類資源進行調(diào)查[12]，但整體上舟山南部海域魚類物種組成和多樣性分析較為薄弱。本研究通過環(huán)境DNA 技術(shù)，闡述了舟山南部海域魚類物種組成及多樣性，討論了環(huán)境DNA 技術(shù)在舟山南部海域漁業(yè)資源調(diào)查的適用性，為舟山南部海域魚類物種組成季節(jié)性變化提供理論依據(jù)[13]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗所用海水樣品于2022年9月采集于舟山南部海域附近10個站位，以真空泵將水樣過濾到0.45μm的親水性尼龍膜上，濾膜裝入50mL 的離心管中，于-80℃保存。采樣點水深小于20m 時采集表層水（或底層水），大于20m 時則共同采集表層水和底層水，在10個站位中有6個站位（A、B、C、D、I、J）的8瓶水樣提取到了環(huán)境DNA。具體水樣所屬站位名稱、經(jīng)緯度及水深如表1所示。

1.2 DNA 提取及高通量測序

采用E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取濾膜上水樣環(huán)境DNA，采用QubitdsDNA HS分析試劑盒擴增12SrDNA 基因，引物序列使用FISHeDNA 通用引物[14]。聚合酶鏈式反應（PCR）擴增體系為30μL：包括15μL 混合液，1μLBar-PCRprimerF，1μLPrimerR，9～12μL去離子水和DNA 模板10～20ng。反應程序為：95℃預變性3min;94 ℃變性20s，55 ℃退火20s，72 ℃延伸20s，進行5次循環(huán);72 ℃延伸5min，10 ℃保存。通過2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，使用Qubit3.0熒光定量儀進行文庫濃度測定，所有樣本按照1∶1等量混合，在IlluminaMiseq測序平臺上進行二代高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有樣本去冗余序列合并后去除沒有重復的單序列，對各樣本優(yōu)化序列提取非重復序列，按照97%相似性進行操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，將所有優(yōu)化序列比對至OTU 代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚類物種組成

環(huán)境DNA 宏條形碼檢測共得到有效拼接序列45127條， 圖1為本次測序所得的魚類物種OTU稀疏曲線，由圖可見測序量足以反映樣本多樣性，可以用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

環(huán)境DNA 檢測出的魚類物種組成如表2 所示，在8個環(huán)境DNA 樣品中共檢測出9種魚類，隸屬于2綱6目6科9屬。在目級水平比較中，鱸形目（Perciformes）種類最多，總計4種，約占檢測魚類總數(shù)的44.44%;鲼形目（Myliobatiformes）、仙女魚目（Aulopiformes）、鯡形目（Clupeiformes）、鰻鱺目（Anguilliformes）、鰈形目（Pleuronectiformes）檢測到的種類最少，均為1種，約占11.11%。

圖2為魚類物種分布氣泡圖，展示了魚類物種在各樣本中的相對豐度值，橫軸為各站位點，不同氣泡大小表示不同物種在不同站位點的相對豐度比例。其中8個水樣中有7個均檢測到龍頭魚，龍頭魚豐度最高，其次為刀鱭、鮸、棘頭梅童魚、大黃魚，皮氏叫姑魚和赤魟豐度較低，海鰻和半滑舌鰨豐度最低，僅出現(xiàn)一次。

2.2 魚類多樣性分析

魚類群落相對豐度的Alpha多樣性指數(shù)如表3所示，生態(tài)學家常用Chao1和Ace算法估計群落中含OTU 數(shù)目的指數(shù)用來估計物種總數(shù)，香農(nóng)指數(shù)（Shannon）和辛普森指數(shù)（Simpson）用來估算樣品中生物多樣性指數(shù)。其中，Chao1指數(shù)范圍為1～8，Ace指數(shù)均為0，Shannon指數(shù)范圍為0～1.63939，Simpson指數(shù)范圍為0.218767～0.580185，各個站位所得的魚類物種Alpha多樣性指數(shù)存在顯著差異，且8 個環(huán)境DNA 樣本在魚類物種組成和序列豐度上皆存在一定差異（圖3）。如圖所示，不同水樣的魚類物種組成和序列豐度的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCOA）分析揭示了不同水樣間魚類組成相似情況，不同樣本有明顯的分散情況，兩樣本點越接近表明兩樣本物種組成越接近，其中D1、D2、C2魚類多樣性相似度最高，J1、B2較高，C1、I1、A1差異較大。利用R軟件繪制魚類豐度的物種組成熱圖，如圖4 所示，龍頭魚相對豐度和分布頻率最高，刀鱭、鮸較高，海鰻、半滑舌鰨最低。

3 討論

3.1 基于環(huán)境DNA 技術(shù)的舟山南部海域魚類物種組成

本研究采用環(huán)境DNA 技術(shù)分析舟山南部海域魚類物種組成，用于補充該海域魚類組成和多樣性，結(jié)合底拖網(wǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)（表4）進行分析討論。底拖網(wǎng)共檢測到32種魚，隸屬于2綱9目14科28屬，與環(huán)境DNA 監(jiān)測結(jié)果差異較大，但在兩種檢測結(jié)果中龍頭魚均為優(yōu)勢種，這與張玉榮等[12]對舟山南部附近海域漁業(yè)資源進行調(diào)查研究的結(jié)果相似。環(huán)境DNA 檢測到但底拖網(wǎng)未檢測到的有赤魟、海鰻、半滑舌鰨，二者共同檢測到的魚類為6種，其中豐度較高的魚類如龍頭魚、鮸、棘頭梅童魚均為底拖網(wǎng)數(shù)據(jù)中檢測到的優(yōu)勢種，證明了環(huán)境DNA技術(shù)對生物量和豐度較高的魚類檢測具有準確性。

環(huán)境DNA檢測結(jié)果與底拖網(wǎng)數(shù)據(jù)差異較大可能與DNA的濃度情況、取樣方法、環(huán)境條件、pH 值、溫度等因素相關[15]，許多研究表明，環(huán)境DNA 技術(shù)和形態(tài)學的檢測數(shù)據(jù)之間在物種存在和豐度方面存在差異，提出最多的原因是分子參考數(shù)據(jù)庫的不完整性和缺乏準確性[16]。與許多傳統(tǒng)調(diào)查方法相比，雖然環(huán)境DNA具有更低的成本和更高的效率等優(yōu)勢，但是環(huán)境DNA技術(shù)的可靠性和準確性仍在改進中，不應將其完全視為傳統(tǒng)調(diào)查方法的替代[17]。

3.2 基于環(huán)境DNA 技術(shù)的舟山南部海域魚類多樣性初步探討

各站點之間魚類多樣性存在顯著性差異，表3列舉了反映魚類群落多樣性的Alpha多樣性指數(shù)。其中，Chao1 指數(shù)平均值為3.5（變幅為1.00～8.00），Ace指數(shù)均為0，兩個指數(shù)分布趨勢差異較大。使用Ace算法估計物種總數(shù)結(jié)果為0，可能與群落中含OTU 數(shù)目較少相關。若基于Chao1指數(shù)進行分析，D站位表層和底層兩者指數(shù)值最高，表明該站點魚類群落豐富度最高，A 站點表層數(shù)值最低，表明該站點魚類群落豐富度最低[18]。

以Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分析群落多樣性水平，Simpson指數(shù)平均值為0.46105（變幅為0.21877～1），Shannon指數(shù)平均值為0.95787（變幅為0～1.63939），兩者分布趨勢基本一致。Simpson指數(shù)對于富集種更加敏感，而Shannon指數(shù)對于稀疏種更為敏感[19]，D站位表層和底層Simpson指數(shù)最低，Shannon指數(shù)最高，表明D 站位群落多樣性水平最高;A 站位Simpson指數(shù)最高，Shannon指數(shù)最低，表明群落多樣性水平最低，與Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)分析多樣性結(jié)果相同。

魚類多樣性在不同站點間存在差異，在同一站位不同深度也存在差異。從魚類物種組成和序列豐度相似性來看，C2、D1、D2站點最先聚在一起，C站位和D 站位兩個采樣點生境條件較為相似，而D1、D2采樣點為D 站位不同水深，魚類多樣性相似;A 站位物種組成與其他站位差異最大，僅有龍頭魚一種。從物種上看，龍頭魚相對豐度和分布頻率最高。赤魟、海鰻、半滑舌鰨均出現(xiàn)在D 站位，在其余站點的相對豐度為0。此外，在同一站位不同深度魚類豐度有所不同，C站位表層底層差異較大，表層魚類組成為大黃魚、棘頭梅童魚、皮氏叫姑魚，底層魚類組成為龍頭魚、鮸、刀鱭;D 站位表層底層檢測結(jié)果相似，以龍頭魚和鮸豐度最高，由此可見，環(huán)境DNA 針對不同深度魚類多樣性研究具有可取性。

近幾年來，環(huán)境DNA技術(shù)在魚類種類組成及多樣性分析、資源狀況和種群分布[20-22]等方面都有一定的發(fā)展和應用。隨著分子生物學的發(fā)展，環(huán)境DNA技術(shù)與傳統(tǒng)調(diào)查方法相結(jié)合的方式將成為魚類資源調(diào)查和生物多樣性研究的新發(fā)展趨勢[23]。本文對環(huán)境DNA 技術(shù)在舟山南部海域秋季魚類資源狀況上的應用進行分析，其結(jié)果與底拖網(wǎng)調(diào)查結(jié)果相似，環(huán)境DNA 技術(shù)對豐度較高的魚類適用性較強，在確定優(yōu)勢種方面具有優(yōu)勢。將環(huán)境DNA與底拖網(wǎng)結(jié)合，對舟山南部海域魚類物種多樣性、資源量估算和種群分布等研究具有巨大潛力。