【摘 要】目的：探討DNA提取方法優(yōu)化后對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型結(jié)果的影響，并比較分析與業(yè)內(nèi)常用試劑盒基因型鑒定結(jié)果的差異。方法：在團(tuán)隊(duì)前期專(zhuān)利基礎(chǔ)上，改進(jìn)了DNA裂解液的配方和實(shí)驗(yàn)流程，并以新型轉(zhuǎn)錄因子Musculin和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）轉(zhuǎn)基因小鼠為例，對(duì)基因分型結(jié)果進(jìn)行了比較研究和驗(yàn)證。結(jié)果：DNA提取時(shí)現(xiàn)配裂解液配方為100 μL 0.025 N NaOH工作液、160 μL 0.5 M EDTA工作液和40 mL超純水；每個(gè)樣本加入180 μL裂解液，100 ℃ 30 min。與相關(guān)領(lǐng)域常用的基因分型試劑盒相比，該DNA提取優(yōu)化方案能夠在確保鑒定準(zhǔn)確的前提下有效縮短基因分型時(shí)間，而且裂解液配置方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)次數(shù)多，步驟更簡(jiǎn)便，可大幅降低試劑成本和工作量。結(jié)論：本研究提供1種適用于轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型的經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、可靠的DNA提取技術(shù)，具有較好的應(yīng)用和推廣價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)基因小鼠；DNA提??；基因分型；優(yōu)化

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-332 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-10-12

作為分子機(jī)制探討和研究水平提升的重要工具，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究領(lǐng)域[1-2]。由于轉(zhuǎn)基因小鼠研發(fā)周期相對(duì)較長(zhǎng)，價(jià)格昂貴，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室選擇自行繁育的方式維護(hù)種群（特別是條件性敲除基因小鼠），這使得轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定即基因分型成為長(zhǎng)期、大量并頻繁的常態(tài)化工作。因此，采用經(jīng)濟(jì)可靠、快速便捷、操作簡(jiǎn)便的基因分型技術(shù)將有效降低工作負(fù)荷，提升工作效率，是業(yè)內(nèi)實(shí)驗(yàn)人員面臨的重要應(yīng)用課題，實(shí)用價(jià)值明顯[3-5]。

轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型的實(shí)驗(yàn)流程由DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（poly-enzyme chain reaction，PCR）和瓊脂糖凝膠電泳等3個(gè)步驟組成[6]。由于PCR參數(shù)和時(shí)間基本固定，相對(duì)而言，DNA提取方法的優(yōu)化可能是降低基因分型成本和時(shí)長(zhǎng)的關(guān)鍵途徑。目前常用的DNA提取方法包括苯酚-氯仿提取、醇沉法、以前2種方法為基礎(chǔ)的試劑盒法和煮沸法。前3種方法雖然能夠得到較高純度的樣本DNA，但步驟繁瑣，試劑過(guò)多，成本偏高，不適于長(zhǎng)期、大量、高頻的基因分型工作；煮沸法雖然簡(jiǎn)單，但針對(duì)裂解液配方改進(jìn)并獲得有效結(jié)果的研究還少有報(bào)道[7-8]。

本研究立足前期獲得的授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利[9]，通過(guò)10年不同類(lèi)型轉(zhuǎn)基因小鼠的基因分型實(shí)踐，進(jìn)一步對(duì)裂解液的配置和實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行了優(yōu)化，并以新型轉(zhuǎn)錄因子Musculin敲除（knock out，KO，-/-）和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）敲入（knock in，KI，+/+）小鼠為例，采用相關(guān)領(lǐng)域常用的2種試劑盒法為對(duì)照，對(duì)基因分型結(jié)果進(jìn)行比較研究，旨在為轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型提供1種更經(jīng)濟(jì)、便捷、準(zhǔn)確的實(shí)用方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

所用轉(zhuǎn)基因小鼠皆為C57BL/6背景：Mus?culin 雜合子（heterozygote，+/-）小鼠由美國(guó)Antagen Phama?ceuticals 高聞達(dá)教授設(shè)計(jì)，委托北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司研發(fā)；EGFP+/+小鼠購(gòu)自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司。所有小鼠均在無(wú)特定病原（specific pathogen free，SPF）級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。室內(nèi)溫度控制在20～26 ℃，濕度在50%～60%，照明采取12 h晝夜交替方式。將成年Musculin+/-小鼠雌雄同籠交配（雄雌比例為1∶1或1∶2），正常繁育獲得Mus?culin野生型（wild type，WT，+/+）、Musculin+/-和Musculin-/-小鼠；EGFP+/+成年小鼠同樣雌雄配對(duì)，正常繁育。所有仔鼠出生21 d后離乳，種鼠繼續(xù)交配繁殖。另外，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中作為對(duì)照的C57BL/6小鼠購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究獲陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理審批編號(hào)：AMUWEC20237369。

1.1.2 主要試劑

本研究所用DNA提取試劑來(lái)自上海生物工程公司，比較用DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司和南京諾唯贊公司，PCR 試劑盒系美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，PCR引物由重慶柯柏公司合成，Musculin一抗來(lái)自美國(guó)Novus公司，蛋白質(zhì)印跡法（western blot，WB）相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別采集Musculin+/+ 、Musculin+/- 、Mus?culin-/-、EGFP+/+和EGFP-/-基因型小鼠各5 只腳趾，長(zhǎng)度約3 mm，置于1.5 mL干凈EP管內(nèi)作為檢測(cè)樣本。利用本研究?jī)?yōu)化方案獲得總DNA，最終通過(guò)PCR驗(yàn)證樣本對(duì)應(yīng)基因型。將上述小鼠樣本分別用北京天根公司和南京諾唯贊公司相關(guān)試劑盒進(jìn)行基因分型，比較本研究?jī)?yōu)化方案與常用試劑盒法的異同；選擇基因分型獲得的Musculin+/+和-/-小鼠，常規(guī)取脾臟和肌肉組織，采用WB 驗(yàn)證Musculin-/-小鼠中Musculin 的表達(dá)；選擇EGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠和作為對(duì)照的C57BL/6野生型小鼠，常規(guī)取脾臟，采用熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）法（即流式細(xì)胞分析）驗(yàn)證EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠中的熒光信號(hào)，最終確定本研究?jī)?yōu)化方案是否具有準(zhǔn)確性和便捷性。

1.2.2 DNA提取優(yōu)化方案

預(yù)先配制10 N NaOH儲(chǔ)存液和0.5 M EDTA（2 mmol/L）工作液，4 ℃保存；DNA提取時(shí)現(xiàn)配裂解液（工作液），配方為100 μL 0.025 N NaOH 工作液、160 μL 0.5 M EDTA工作液和40 mL超純水；每個(gè)樣本加入180 μL裂解液，100 ℃ 30 min。降至室溫后，置于4 ℃保存。

1.2.3 北京天根公司試劑盒DNA提取方法

將離心管內(nèi)小鼠腳趾剪碎制成細(xì)胞懸液，10 000 r/min 離心1 min，棄上清，加入200 μL 緩沖液GA，振蕩至徹底懸?。患尤?0 μLProteinase K溶液，混勻，56 ℃水浴振蕩放置過(guò)夜，直至組織溶解；加入200 μL緩沖液GB，顛倒混勻，70 ℃放置10 min，溶液變澄清，短暫離心去除管蓋內(nèi)壁水珠；加入200 μL無(wú)水乙醇，充分震蕩15 s，可能出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心去除管壁水珠；將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入1個(gè)吸附柱CB3（吸附柱放置收集管內(nèi)），12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管；向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，倒廢液，吸附柱放回收集管；向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒廢液，吸附柱放回收集管；重復(fù)上一步操作，離心2 min，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以晾干殘余漂洗液；將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200 μL 洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集至離心管中；棄掉吸附柱，將DNA保存于4 ℃。

1.2.4 南京諾唯贊公司試劑盒DNA提取方法

該公司試劑盒DNA提取步驟與北京天根公司類(lèi)似，只是所用溶劑與劑量有所區(qū)別：剪碎1.5 mL離心管內(nèi)的小鼠腳趾，加入230 μLBuffer GA和20 μL Proteinase K，混勻置55 ℃水浴過(guò)夜至組織完全酶解；加入250 μL Buffer GB，渦旋混勻，70 ℃水浴10 min；加入180 μL無(wú)水乙醇吹打混勻；轉(zhuǎn)移混合液至吸附柱內(nèi)，12 000 r/min離心1 min；棄廢液，加入500 μL WashingBuffer A 至吸附柱，12 000 r/min 離心1 min；棄廢液，加入650 μL Washing Buffer B至吸附柱，12 000 r/min離心1 min；重復(fù)上一步操作；棄廢液，空管離心12 000 r/min，2 min；將吸附柱置于新的EP管，加入預(yù)熱的30～100 μL的Elution Buffer至吸附柱的膜中央，室溫放置3 min，12 000 r/min離心1 min；棄掉吸附柱，將DNA保存于4 ℃。

1.2.5 PCR引物和目的條帶

本研究根據(jù)前期工作基礎(chǔ)[10]，采用野生型引物P1、普通型引物P2和突變型引物P3鑒定Musculin+/-親本后代，P1、P2置于同一PCR反應(yīng)體系，P2、P3置于另一PCR反應(yīng)體系，以獲得更為清晰的基因分型結(jié)果。雖然EGFP+/+親本后代只有1種基因型（帶綠色熒光），但穩(wěn)妥起見(jiàn)，本研究仍采用EGFP野生型正向引物、EGFP野生型反向引物、EGFP突變型正向引物和EGFP突變型反向引物用于研究，前2種引物置于同一PCR反應(yīng)體系，后兩種引物置于另一PCR反應(yīng)體系。待測(cè)基因引物序列及目的條帶，見(jiàn)表1。

1.2.6 PCR反應(yīng)體系及參數(shù)

Musculin轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型所用PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：樣本DNA模板1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，P2 0.5 μL，P1（或P3）0.5 μL。其中，P1和P2用于鑒定Musculin野生型條帶，P2和P3用于鑒定Musculin突變型條帶。

EGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型所用PCR 反應(yīng)體系也為20 μL，包括：樣本DNA模板1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，EGFP 野生型（或突變型）正向引物0.5 μL，EGFP野生型（或突變型）反向引物0.5 μL。其中EGFP野生型正、反向引物檢測(cè)無(wú)熒光條帶，EGFP突變型正、反向引物檢測(cè)有熒光條帶。

采用美國(guó)Bio-Rad 公司C1 000TM Thermal Cycler 型PCR儀完成PCR反應(yīng)，相關(guān)參數(shù)，見(jiàn)表2。

1.2.7 瓊脂糖凝膠電泳

制備2%瓊脂糖凝膠，置于電泳緩沖液中，以Super Gel Red為顯影劑，吸取各品系轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)不同方法獲得的PCR 產(chǎn)物9 μL 加入電泳孔中，DNAmarker為BM 2 000，電泳儀系北京六一產(chǎn)品，參數(shù)為180 V、20 min。電泳結(jié)束后，觀(guān)察各品系轉(zhuǎn)基因小鼠待測(cè)基因目的條帶。

1.2.8 WB驗(yàn)證Musculin-/-小鼠Musculin表達(dá)

選取通過(guò)本研究DNA 提取優(yōu)化方案獲得的Musculin+/+和Musculin-/-小鼠，常規(guī)處死后取適量脾臟和肌肉組織，按WB試劑盒要求制備蛋白樣品，完成十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、Musculin一抗孵育、二抗孵育、顯影等步驟。明確本研究?jī)?yōu)化方案獲得的基因分型結(jié)果能否得到WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.9 FACS驗(yàn)證EGFP+/+小鼠熒光信號(hào)

選取通過(guò)本研究DNA提取優(yōu)化方案獲得的EGFP突變型小鼠和作為對(duì)照的C57BL/6野生型小鼠，常規(guī)處死后取適量脾臟組織，磨碎制備細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞后離心去上清，PBS清洗1～2次，離心，重懸，最后通過(guò)美國(guó)ACEA NovoCyte 流式細(xì)胞儀（選擇FITC通道）檢測(cè)樣本是否帶有EGFP信號(hào)，以此驗(yàn)證本研究?jī)?yōu)化方案獲得的基因分型結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 Musculin轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型

結(jié)果顯示，DNA樣本上樣量相同的條件下，針對(duì)Musculin轉(zhuǎn)基因小鼠+/+、+/-和-/-基因分型的各種方法得到的結(jié)果一致，而且條帶清晰，易于分辨（圖1）。圖1A：上兩排1～15號(hào)使用北京天根公司試劑盒，下兩排1～5號(hào)使用南京諾唯贊試劑盒；圖1B：16-30 號(hào)使用本研究?jī)?yōu)化方案；Musculin+/+：11～15號(hào)、26～30號(hào)，Musculin+/-：1～5號(hào)、16～20號(hào)，Musculin-/-：6～10號(hào)、21～25號(hào)。其中，作為陽(yáng)性對(duì)照的各公司試劑盒方法獲得的目的條帶（圖1A）都比本研究?jī)?yōu)化方案（圖1B）略亮，雜帶也相對(duì)較多。

2.2 EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型

與Musculin轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型結(jié)果相似，各種方法獲得的目的條帶清晰可辨，基因型鑒定準(zhǔn)確（圖2）。圖2A：1～5號(hào)使用北京天根公司試劑盒，6～10號(hào)使用南京諾唯贊試劑盒；圖2B：11-15號(hào)使用本研究?jī)?yōu)化方案。其中，各公司試劑盒方法獲得的2條目的條帶都比較寬亮，突變型均有雜帶（圖2A）；本研究?jī)?yōu)化方案獲得的2條目的條帶清晰且無(wú)雜帶，突變型條帶亮度略弱于野生型（圖2B）。

2.3 Musculin蛋白水平在Musculin轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)

WB 結(jié)果顯示，Musculin-/- 小鼠脾臟和肌肉組織中無(wú)Musculin 蛋白表達(dá)，而Musculin+/+ 小鼠表達(dá)Musculin 正常（圖3）。GAPDH在上述基因型小鼠中均有表達(dá)，說(shuō)明WB實(shí)驗(yàn)體系穩(wěn)定。

2.4 EGFP信號(hào)在EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠中的檢測(cè)

FACS結(jié)果顯示，同等條件（主要為脾臟淋巴細(xì)胞）圈取目標(biāo)細(xì)胞并設(shè)門(mén)，EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟細(xì)胞中帶有EGFP信號(hào)細(xì)胞比例為94.01%，而作為對(duì)照的C57BL/6小鼠相應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞僅為0.01%（圖4）。

3 討 論

隨著醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究的深入，轉(zhuǎn)基因小鼠在探討分子機(jī)制、提升研究水平中的作用日益凸顯，已成為高等院校、科研院所和研究型醫(yī)院不可或缺的研究工具。例如，Musculin轉(zhuǎn)基因小鼠能夠探討新型轉(zhuǎn)錄因子Musculin 在創(chuàng)傷和疾病中的作用[11-13]，尤其是與炎癥和免疫的關(guān)系[14-15]，Musculin敲除或條件性敲除研究研究能夠直觀(guān)展示Musculin在上述生命活動(dòng)和醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的作用機(jī)制，科學(xué)性強(qiáng)，EGFP小鼠則為細(xì)胞追蹤提供可能，促進(jìn)組織發(fā)育過(guò)程和細(xì)胞治療機(jī)制的探討[16-17]?？梢?jiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠品系不斷增加、種群日益擴(kuò)大的發(fā)展趨勢(shì)已經(jīng)形成。

隨之而來(lái)的工作就是長(zhǎng)期、大量、頻繁地轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型，這是順利開(kāi)展后續(xù)科研工作的前提。基于轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型的科研需求將長(zhǎng)期存在，操作簡(jiǎn)便、成本低廉、結(jié)果可靠的基因型鑒定方法將有效提升工作效率，勢(shì)必受到廣大科研人員的認(rèn)可，并在科研市場(chǎng)占據(jù)明顯優(yōu)勢(shì)。另一方面，由于基因分型實(shí)驗(yàn)涉及的PCR和瓊脂糖凝膠電泳時(shí)長(zhǎng)和參數(shù)與設(shè)備相關(guān)，相對(duì)固定，因此，基因分型的另一流程-DNA提取方案的優(yōu)化則成為實(shí)驗(yàn)室提升基因型鑒定效率的主要手段。

傳統(tǒng)DNA提取法包括前述苯酚-氯仿提取、醇沉法等，步驟多、試劑雜、不安全，對(duì)于需長(zhǎng)期大量的轉(zhuǎn)基因小鼠基因型的鑒定工作而言，耗時(shí)耗力[18-19]。科研市場(chǎng)上常用的基因分型試劑盒雖然使用方便，但流程偏長(zhǎng)、價(jià)格偏高，對(duì)于經(jīng)費(fèi)有限且有轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)需求的實(shí)驗(yàn)室而言仍有改進(jìn)空間?？紤]到基因分型對(duì)DNA純度要求相對(duì)不高，結(jié)合本團(tuán)隊(duì)前期工作和煮沸法相關(guān)報(bào)道[9，20-21]，本研究對(duì)DNA提取法的優(yōu)先方案重點(diǎn)考慮配置合適的DNA裂解液和簡(jiǎn)化處理時(shí)間。

本研究以Musculin 和EGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠為例，并選取業(yè)內(nèi)普遍使用、來(lái)自2家公司的基因分型試劑盒作為陽(yáng)性對(duì)照[22-23]，開(kāi)展基因分型效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種方法都能得到可靠結(jié)果：采用2種試劑盒的目的條帶都比較亮但易有雜帶，采用本研究?jī)?yōu)化方案的目的條帶亮度略弱，但無(wú)雜帶。前者出現(xiàn)雜帶的原因可能是提取DNA的過(guò)程中沒(méi)有加入RNase溶液以去除RNA干擾，后者條帶暗可能是由于煮沸法本身提取的純度低和DNA量少的緣故[24]，但并不影響最終結(jié)果。另外，在上樣量一致的條件下，圖1中1～2泳道條帶（試劑盒法）相對(duì)弱于16～17泳道（本研究?jī)?yōu)化方案），排除系統(tǒng)誤差，可能與試劑盒法和本研究?jī)?yōu)化方案在總DNA獲取中采取不同的處理方法有關(guān)，但不會(huì)影響基因分型結(jié)果判讀。這主要是因?yàn)橛糜诨蚍中偷某Ｒ?guī)PCR本身屬于定性結(jié)果，有條帶即可證明陽(yáng)性，而且該結(jié)果還反證本研究?jī)?yōu)化方案更精準(zhǔn)、更易判讀。圖2中11～15泳道多余明帶可能與其樣本是EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠有關(guān)。該品系改造過(guò)程中，可能存在基因敲入和修飾等操作，有可能發(fā)生其他基因錯(cuò)配，而鑒定該品系的陽(yáng)性條帶是圖2中下排泳道，即代表有熒光條帶的565Kb條帶，因此部分樣本上排多余明帶不會(huì)影響基因型鑒定結(jié)果。3種方法中，采用本研究?jī)?yōu)化方案的DNA 提取時(shí)間最短，僅僅需30min，而采用2種試劑盒均需消化過(guò)夜。而且，本研究?jī)?yōu)化方案針對(duì)裂解液的配置方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)次數(shù)（檢測(cè)樣本數(shù)量）遠(yuǎn)多于2種試劑盒，從而大幅度降低了試劑成本。但是，運(yùn)用本研究?jī)?yōu)化方案時(shí)要注意試劑配置時(shí)間，若長(zhǎng)時(shí)間未使用（3個(gè)月以上）需重新配置，否則會(huì)影響基因分型的準(zhǔn)確性。需要說(shuō)明的是，本研究?jī)?yōu)化方案在定性鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型方面優(yōu)勢(shì)明顯，但對(duì)于樣本目的基因豐度有特別要求（例如目的基因豐度特別低的樣本）的檢測(cè)，仍建議采用更精確的定量檢測(cè)方法，例如實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）。

本研究涉及的DNA提取優(yōu)化方案是經(jīng)過(guò)十余年實(shí)踐、立足前期工作基礎(chǔ)并加以改進(jìn)而獲得，可為轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型提供1種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、可靠的DNA 提取技術(shù)，具有較好的應(yīng)用和推廣價(jià)值。但是，該研究還需在樣本例數(shù)、轉(zhuǎn)基因品系和動(dòng)物種類(lèi)方面加以拓展，以進(jìn)一步證實(shí)其廣泛性和實(shí)用性。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：周一青）

基金項(xiàng)目：重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：CSTB2023NSCQMSX0014）。