【摘 要】目的：篩選基于雙硫死亡的心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）相關風險基因及探索其可能的作用途徑。方法：用R語言limma分析并篩選MIRI相關風險基因24 h組與Control組之間的差異表達基因?；贕O和KEGG數(shù)據(jù)庫利用 R語言cluterProfiler包對其進行功能富集分析。根據(jù)雙硫死亡基因集以及GSE160516的表達數(shù)據(jù)，利用R語言GSVA包中的ssgsea法對其進行富集分析，并利用Venn圖獲得心肌缺血再灌注中雙硫死亡相關基因的表達。用R語言psych包中的corr.test計算雙硫死亡相關基因與凋亡因子、線粒體、鐵死亡及炎癥等相關基因的相關性，并繪制熱圖。利用R語言Mfuzz包來進行不同時間點心肌缺血再灌注轉錄組數(shù)據(jù)的表達模式聚類分析并利用Venn圖獲取時序性差異表達的雙硫死亡基因。結果：本研究共篩選出17個差異表達雙硫死亡相關基因，經(jīng)過雙硫死亡相關基因與炎癥、凋亡、鐵死亡、線粒體基因相關性分析，以及雙硫死亡相關基因與心肌缺血再灌注時序性分析的差異表達基因篩選，最終得到雙硫死亡相關基因Flna、Myl6、Tln1 在MIRI不同時間的特異性表達。結論：Flna、Myl6、Tln1 在MIRI中可能起著關鍵作用，其基于雙硫死亡同時與線粒體相關基因密切相關，可作為MIRI患者風險因素的篩選指標。

【關鍵詞】心肌缺血再灌注；雙硫死亡；生信分析；風險因素篩選指標

【中圖分類號】D919.1；DF795.1 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2023-12-06

心肌梗死（myocardial infarct，MI）是心源性猝死的主要類型，心肌急性缺血缺氧是其重要的發(fā)生機制。急性心肌梗死得到及時治療后，血管損傷反而呈現(xiàn)短暫加重的現(xiàn)象，被稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。

目前，關于心肌缺血再灌注的病理生理學機制方面的研究已有不少。有研究表明，當心肌血管梗阻再通時，可以通過加重血管炎癥導致這種現(xiàn)象的發(fā)生[1]。線粒體動力學被認為在MIRI扮演著中心環(huán)節(jié)的作用，線粒體功能障礙可能是導致梗阻血管再通后血管損傷加重的潛在機制[2]。線粒體在心肌梗死后促進炎癥消退和心肌組織修復，當其出現(xiàn)功能障礙時，梗死組織炎癥加重并抑制其修復[3]。此外，氧化應激也被認為參與心肌缺血再灌注的病理過程[4]。雖然已經(jīng)明確了心肌缺血后血管再通會導致更嚴重的心肌及血管損傷，但是其具體的機制仍然有待研究。

低血糖是心血管疾病的危險因素之一，常常導致心律失常、心肌梗死甚至死亡[5]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖缺乏的條件下，SLC7A11的高表達會導致細胞的雙硫死亡[6]。雙硫死亡（disulfidptosis）是一種新的細胞死亡方式，它是由細胞葡萄糖缺乏誘導的SLC7A11高表達的細胞內(nèi)二硫化物的異常積累導致的細胞死亡[6]。心肌梗死后，常常因為胰島素分泌不足而導致低血糖。在葡萄糖缺乏的情況下引起細胞雙硫死亡導致心肌細胞進一步損傷，這可能是MIRI的機制之一，目前很少相關研究。因此，篩選雙硫死亡相關基因（disulfidptosis-relatedgenes，DRG）的表達對于診斷和治療MIRI 非常重要。本文旨在篩選MIRI特征基因并分析其生物學功能，探索DRG與心肌梗死后不同時間的特征基因的關聯(lián)性，提供潛在的MIRI風險因素篩選指標，為MIRI的臨床防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取及差異表達分析

從GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）下載小鼠MIRI數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集GSE160516。根據(jù)文獻中最佳灌注時間，使用R包limma分析并篩選IR24h組與Control組之間的差異表達基因，篩選標準為：FCgt;1.5，Plt;0.05[7]。

1.2 功能分析

根據(jù)得到的差異基因，利用cluterProfiler包進行功能富集分析?；贕ene Ontology數(shù)據(jù)庫，以及KEGG PATHWAYDATABASE生物化學通路的數(shù)據(jù)庫，對候選基因進行了功能富集分析[8-9]。利用統(tǒng)計學算法（Fisher’s exact test）尋找出一組基因和哪些具體的功能條目聯(lián)系最大，分析結果中每個條目都對應一個統(tǒng)計值P 來表示顯著性。

1.3 ssGSEA分析。

根據(jù)雙硫死亡基因集以及GSE160516的表達數(shù)據(jù)，利用GSVA包中的ssgsea法進行富集分析，最終得到各樣本對應各基因集的ssgsea得分[10]。利用wilcox.test計算組間各基因集得分差異情況，多組間差異則利用kruskal.test計算各基因集得分差異情況。

1.4 雙硫死亡相關基因的相關性分析

根據(jù)雙硫死亡相關基因在GSE160516中的表達量，用psych中的corr.test計算雙硫死亡相關基因與凋亡因子、線粒體、鐵死亡及炎癥等相關基因的相關性，并繪制熱圖[11]。凋亡因子、線粒體、鐵死亡及炎癥等相關基因篩選條件：|logFC|gt;1。

1.5 雙硫死亡相關基因時序分析

對心肌缺血再灌注樣本的表達矩陣以6、24、72 h的時間順序研究表達差異。利用Mfuzz包來進行不同時間點轉錄組數(shù)據(jù)的表達模式聚類分析。參數(shù)選擇α=0.5，基因篩選的標準偏差為0.3。

1.6 統(tǒng)計學方法

本研究數(shù)據(jù)處理和分析均使用R 語言進行。不同的分析用相應的R包進行。功能富集分析用Fisher’s exact test對對應條目進行注釋。在ssGSEA 分析中，利用R 包中的wilcox.test和kruskal.test比較組間差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 差異分析

從GSE160516數(shù)據(jù)集中篩選Control與IR 24 h之間的差異表達基因，結果表明有2 291個基因表達上調(diào)，2 251個基因表達下調(diào)（圖1A）。其中，F(xiàn)n1、Chil3、ll1rn、serpina3n、Ccr2、Ccl12 等20個基因上調(diào)最明顯；Ciart、Pkd212、Dusp18、Kcnip2、Lgals4、lgi1 等20 個基因表達水平下降幅度最大（圖1B）。

2.2 功能富集分析

為了確定差異表達基因的生物學功能，對差異表達基因（不分上調(diào)與下調(diào)）進行了GO/KEGG 功能富集分析。在生物學過程層面主要包括Cellular macromolecule metabolic pro?cess、Multicellular organismdevelopment、Organelle organiza?tion、Positive regulation of cellular metab...、Protein metabolicprocess 5類功能變化，并且展示其功能變化對應的基因名稱（圖2A）。在分子功能的分析中，發(fā)現(xiàn)其主要富集于purinenucleotide binding、purine ribonucleotide binding、ribonucleo?tide binding、adenyl nucleotide binding、adenyl ribonucleotidebinding以及ATP binding處（圖2B）。在細胞組成的分析中，分析出Intracellular membrane ? bounded organelle、Nucleo?plasm、Nucleus等細胞定位功能變化（圖2C）。表明MIRI后，Biological Process（BP）、Molecular Function（MF）、CellularComponent（CC）3類基因功能均發(fā)生變化。為了探索這些功能變化所屬Gene Ontology數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)集，將所有表達上、下調(diào)的基因進行了富集分析，發(fā)現(xiàn)富集數(shù)量最多的是GO：0043231、GO：0005829基因注釋條目，其代表的細胞組成分別是Intracellular membrane?bounded organelle、Cytosol。功能變化程度最明顯的是GO：0005634（nucleus）、GO：0031981（nuclear_lumen）、GO：0046872（metal_ion_binding） 3 個條目（圖2D）。

為了確定差異表達基因?qū)纳飳W通路，利用cluter?Profiler包基于KEGG PATHWAY DATABASE數(shù)據(jù)庫分析這些基因的生物學通路。分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要集中在Proteoglycans in cancer、Chemokine signaling pathway通路，而上調(diào)最顯著的基因Spp1、Thc 對應Focal adhesion 通路（圖3A），還分析MAPK signaling pathway、Metabolic pathways、Pathways in cancer、PI3K ? Akt signaling pathway、Proteogly?cans in cancer 5個條目對應得的上、下調(diào)表達基因（圖3B）。與上面的分析顯示出類似的結果，MIRI后差異表達基因?qū)纳飳W通路條目熱圖顯示，上調(diào)程度最明顯的Spp1、Thc基因都對應PI3K?Akt信號通路、Focal adhesion通路，下調(diào)程度最顯著的Zbtb16 基因?qū)猅ranscriptional misregulation incancer、Pathways in cancer通路（圖3C）。

2.3 ssGSEA分析及雙硫死亡基因篩選

為了確定雙硫死亡基因與心肌缺血再灌注之間的內(nèi)在聯(lián)系，再根據(jù)雙硫死亡基因集以及GSE160516的表達數(shù)據(jù)，利用GSVA 包中的ssgsea 法對每個樣本進行打分，確定在MIRI不同時間后雙硫死亡相關基因的表達活性。隨著血管恢復灌流的時間推移，雙硫死亡相關基因的活性也逐步下降（圖4A）。隨后，將差異表達基因與雙硫死亡基因集取交集，得到17個基因（圖4B）。

2.4 雙硫死亡基因表達相關性分析

為了探索雙硫死亡導致?lián)p傷的可能機制，根據(jù)雙硫死亡相關基因在GSE160516中的表達量，用psych中的corr.test計算雙硫死亡相關基因與凋亡因子、線粒體、鐵死亡及炎癥等相關基因的相關性并繪制熱圖。篩選出的17個雙硫死亡基因均與差異表達的凋亡因子存在不同程度的相關性，其中jam3 基因與凋亡因子相關性均較弱（圖5A）。另外，除Myh10 基因與大部分鐵死亡基因相關性較弱外，其余雙硫死亡相關基因與鐵死亡基因相關性較強（圖5B）。在炎癥相關基因中，雙硫死亡基因與ccl 基因家族呈顯著的正相關或負相關關系，少量雙硫死亡基因與其他炎癥相關基因相關，例如：Gys1、Myh9、Oxsm、Slc3a2（圖5C）。隨后分析了雙硫死亡相關基因與線粒體相關基因的相關性，jam3、Slc7a11 與大部分線粒體相關基因無相關性，其他基因與線粒體相關基因相關性較強（圖5D）。與凋亡因子、鐵死亡及炎癥等相關基因相比，線粒體相關基因與雙硫死亡相關基因的相關性明顯更強。

2.5 雙硫死亡基因時序分析

為了確定在MIRI后不同時間段均有表達的雙硫死亡基因，利用Mfuzz包對心肌缺血再灌注樣本的表達矩陣以6 h、24 h、72 h的時間順序研究基因表達差異（圖6A）。將聚類得到的基因與差異表達雙硫死亡基因取交集，篩選出3個基因（Flna、Myl6、Tln1）（圖6B）。

3 討論

心肌梗死發(fā)病率高，常引起嚴重后果。有研究表明，心肌梗死再通后血液再灌注會造成更嚴重的細胞損傷，被稱為MIRI。研究MIRI的致病機制，可為患者的治療及預后提供參考依據(jù)和治療靶點。鑒于心肌缺血常因胰島素分泌不足而導致低血糖、葡萄糖獲取不足，葡萄糖代謝障礙，此種情況下引起的細胞雙硫死亡可能進一步導致心肌細胞損傷。因此，本研究設計本生信分析實驗，旨在篩選基于雙硫死亡的MIRI的相關風險基因，為MIRI的預防和治療提供參考。

本研究基于Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫的功能分析顯示，心肌缺血再灌注后，細胞大分子代謝過程、多細胞生物的發(fā)育、細胞器組織、 細胞代謝的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)代謝過程等生物學過程變化明顯，包括分子功能以及細胞定位均發(fā)生明顯的變化，可能是導致血液再通后更嚴重損傷的原因之一?；贙EGG PATHWAY DATABASE 數(shù)據(jù)庫分析差異表達基因的生物學通路，發(fā)現(xiàn)高度上調(diào)差異表達基因可以激活對應的Focal adhesion通路，抑制該通路可減輕心肌纖維化并保護心肌功能[12]。MAPK信號通路的激活也可能是雙硫死亡導致MIRI的原因，有研究表明抑制該信號通路可以預防MIRI[13]。然而，也有研究表明MAPK家族成員MAPK3的上調(diào)會減輕心肌缺血再灌注導致的細胞凋亡，換句話說，MAPK3 在MIRI 后起保護心肌的作用[14]。因此，雙硫死亡在MIRI中的作用及其機制仍有待深入研究。

趨化因子信號通路在癌癥等多種疾病中發(fā)揮作用已得到驗證，研究也發(fā)現(xiàn)，CXCL16的激活會導致更嚴重的缺血再灌注損傷[15]。同時，趨化因子通常通過加重機體的炎癥而導致病情進一步加重。此外，富集在PI3K?Akt 信號通路上的差異表達基因也可以在MIRI 后起到保護心肌的作用，Maciel等[16]的研究也驗證這點。在缺氧/復氧的細胞模型中，抑制PI3K?Akt信號通路降低中藥對心肌細胞的保護作用[17]。除此之外，MIRI 還上調(diào)癌癥發(fā)病途徑、癌癥蛋白聚糖信號通路的表達，這可能導致患者癌癥的風險增高，但其在心肌損傷中的作用機制如何仍有待深入研究。

有研究表明，可通過PI3K?Akt 信號通路和MAPK信號通路抑制GSK3表達水平[18]，GSK3在多種細胞和組織中發(fā)揮作用，包括心臟。GSK3的抑制通過增加糖原合成和減少糖酵解在心肌組織中起保護作用[19]。GSK3是一種高度保守的細胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過磷酸化抑制糖原合成酶并調(diào)節(jié)葡萄糖代謝[20]。另外，PI3K?Akt 信號通路過度激活導致糖酵解顯著加速，阻止丙酮酸進入線粒體，抑制線粒體生物發(fā)生和功能，導致能量代謝紊亂[21]。因此在本研究的分析中，PI3K?Akt 信號通路和MAPK信號通路的富集可能是心肌缺血再灌注后導致葡萄糖代謝紊亂進一步引起心肌細胞雙硫死亡的機制之一。

隨后，本研究在差異表達基因中篩選出17個雙硫死亡相關基因，表明MIRI過程中存在引起細胞雙硫死亡基因激活，從而導致MIRI。為了探索MIRI基于雙硫死亡可能的機制，本研究分析了雙硫死亡相關基因與凋亡因子、鐵死亡相關基因、炎癥因子以及線粒體相關基因之間的相關性。有研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥中Jam3 基因的抑制可以促進腎癌細胞的遷移并抑制其凋亡[22]。但本研究表明，Jam3 基因與大部分凋亡因子及線粒體相關基因無明顯相關性，提示Jam3 基因表達通過細胞凋亡及改變線粒體功能導致MIRI可能性小。文獻表明，Myh10 基因與大部分鐵死亡及炎癥相關基因無明顯相關性，相關研究寥寥無幾。最新的研究表明，Myh10 基因參與受損線粒體自噬的誘導[23]；Myh10 基因在MIRI中的具體機制，仍有待深入研究闡明。

綜上，差異表達雙硫死亡相關基因與凋亡因子、鐵死亡相關基因、炎癥因子以及線粒體相關基因之間的相關性強，但其囊括范圍較大，難以精確定位MIRI風險因素篩選指標。因此，分析MIRI后6 h、24 h、72 h 3個時段均顯著表達的基因，將它們與差異表達雙硫死亡基因取交集，得到Flna，Myl6，Tln13個基因。Tln是細胞骨架蛋白，可以將整合素和肌節(jié)聯(lián)系起來[24]。整合素的活化在內(nèi)皮細胞表型轉化中起重要作用，整合素親和力的調(diào)節(jié)在體內(nèi)和體外導致動脈粥樣硬化內(nèi)皮活化[25]。此外，Tln在心臟成纖維細胞中的流失引起心肌壓力超負荷導致心肌細胞肥大[26]。Tln1 還能調(diào)節(jié)局灶性黏附動力學、細胞遷移和侵襲，因此，Tln1在腫瘤中表達并促進腫瘤進展[27]。同樣，F(xiàn)lna是一種肌動蛋白結合蛋白，參與細胞骨架的形成，將多種蛋白質(zhì)錨定在細胞骨架中并調(diào)節(jié)細胞黏附和遷移[28]，因此在腫瘤和心血管疾病中發(fā)揮作用。Flna 基因的突變導致先天的心血管、腦和肺的疾病[29]，在MIRI中的作用有待研究闡明。

本研究僅對基于雙硫死亡的MIRI相關風險基因在生信分析水平上進行探索，其具體的臨床實用價值還需要動物實驗以及臨床試驗予以驗證和確認。

總之，本研究篩選出了3個在MIRI表達明顯的基因，它們與細胞雙硫死亡密切相關。時序性分析提示，雙硫死亡可能貫穿MIRI的全程，其特異表達的基因可能成為MIRI 的風險因素篩選指標，為MIRI的臨床防治提供新的參考和借鑒。

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（責任編輯：周一青）

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