【關(guān)鍵詞】骨質(zhì)疏松；人參皂苷Rg3；腸鈣吸收；骨密度；維生素D膜相關(guān)快速反應(yīng)結(jié)合蛋白

骨質(zhì)疏松癥（radiation proctitis，OP）屬于臨床常見的慢性進展性疾病之一，OP患者后期發(fā)生骨折風險居高且難以自愈。近年OP 發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，對患者的生存質(zhì)量造成威脅。在中醫(yī)學中將OP歸屬于“骨痿”“骨痹”等，病機屬肝腎虧虛，髓失所養(yǎng)導(dǎo)致骨痿[1]。鈣是人體重要的骨礦物質(zhì)元素，其減少和丟失能夠引起骨密度下降并最終導(dǎo)致OP的發(fā)生[2]。人參皂苷Rg3提取自五加科植物人參，既往研究顯示，人參皂苷Rg3能夠有效抑制炎癥介質(zhì)釋放，保護腸道黏膜，調(diào)控骨重塑及骨代謝[3-4]，但其是否通過干預(yù)Notch信號通路來影響OP發(fā)病機制尚不清楚。本研究建立OP大鼠模型并通過人參皂苷Rg3進行干預(yù)治療，探究人參皂苷Rg3調(diào)控Notch信號通路對OP大鼠骨代謝及腸鈣吸收的影響機制。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

人參皂苷Rg3（英文名：20（R）Ginsenoside Rg3，分子式：C42H72O13，分子量：785.013，規(guī)格：50 mg，純度：98%，批號：20200210，維克奇生物），分子結(jié)構(gòu)圖見圖1。阿侖膦酸鈉維D3片（固邦佳，70 mg：2800IU*1片 ，國藥準字H20110079，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司），雙能 X 線骨密度儀（DXA-800E，徐州品源），熒光顯微鏡（DM1000，日本OLYMPAS），超凈工作臺（蘇州凈化），熒光定量PCR儀（ABI公司，型號：STEPONE PLUS）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIO-RAD）；TUNEL（KGA7071，江蘇凱基）；Masson 三色染試劑盒（GP1038，武漢谷歌生物）；OPG、PINP、TRACP 及CTX-IELISA試劑盒均購自上海聯(lián)碩；1，25-D3-MARRS及Jagged1、Notch1、Hes1相關(guān)抗體均購自北京百奧萊博。

1.2 實驗動物

3 個月齡SPF 級雌性Wistar 大鼠60 只，體質(zhì)量（250±20） g，購自甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（甘）2020-0001。所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始實驗造模。本實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核批準。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與造模 按照隨機數(shù)字法將大鼠分為4組，分別為空白組、模型組、陽性組及實驗組，每組大鼠各15只。除空白組外，其他3組大鼠均采用去勢（OVX法）法制備OP大鼠模型。本次實驗大鼠均OP造模成功。

1.3.2 干預(yù) 按照實驗動物與人用藥量的新?lián)Q算方法[5]計算大鼠給藥量，空白組及模型組生理鹽水灌胃[10 mL（/ kg·d）]，陽性組給予阿侖膦酸鈉維D3灌服（每周6.25 mg/kg），實驗組給予人參皂苷Rg3[80 mg（/ kg·d）]灌胃治療，連續(xù)干預(yù)治療12周。

1.4 指標檢測

1.4.1 骨密度檢測 大鼠處死后，取各組大鼠部分股骨、脛骨組織，使用雙能X線骨密度儀進行骨密度檢測并對數(shù)據(jù)進行分析，計算骨密度值。

1.4.2 ELISA法檢測 大鼠麻醉后，腹主動脈取血2 mL，置于離心機中，轉(zhuǎn)速2 500 r/min，離心半徑10 cm，離心20 min，取上清液，ELISA法檢測OP大鼠血清中OPG、PINP、TRACP及CTX-I含量水平變化。

1.4.3 Masson 染色 大鼠處死后，取部分小腸黏膜組織切片常規(guī)脫蠟，蘇木素染色10 min，酸性乙醇分化后水洗，Masson藍化液返藍，蒸餾水洗后弱酸工作液洗滌，脫水，二甲苯透明后樹膠封固。

1.4.4 TUNEL法檢測細胞凋亡變化 取各組大鼠小腸黏膜部分組織，置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)浸泡24 h，不同濃度乙醇按順序脫水后，切片，脫蠟后將標本置于蘇木精中進行染色15 min，最后脫水透明10 min，TUNEL試劑盒檢測各組腸黏膜組織切片標本中細胞凋亡情況，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4.5 免疫組化檢測1，25-D3-MARRS 蛋白表達 取各組部分腸黏膜組織切片，脫蠟水化后，3％過氧化氫溶液浸泡10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶處理，然后將切片煮沸以進行抗原修復(fù)，5% 山羊血清孵育分別加入一抗、二抗處理，用PBS洗5次后加入DAB顯色，蘇木精復(fù)染藍化后，顯微鏡下觀察捕獲圖像。

1.4.6 Western blot法檢測Jagged1、Notch1、Hes1蛋白量表達變化 RIPA裂解緩沖液加入黏膜組織中，冰上固定30 min，提取組織中的總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定各組黏膜組織中蛋白質(zhì)的濃度。SDS-PAGE對蛋白進行等量分離后移至PDVF膜上，4 ℃下添加一抗與β-actin（1∶500）孵育過夜。洗滌后添加二抗（1∶500）放置在常溫下孵育2 h。ECL試劑進行顯影并對蛋白相對表達水平進行分析。

1.4.7 RT-PCR 法檢測Jagged1、Notch1、Hes1mRNA 表達變化 液氮研磨凍存的大鼠腸黏膜組織，按照試劑盒說明提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄及擴增目的基因，實時熒光定量PCR法檢測腸黏膜組織Jagged1、Notch1、Hes1 mRNA的表達情況。DNA擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，PCR循環(huán)后再變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個循環(huán)。引物：Jagged1上游：GGACTTTCTGAGGGAGGT，下游：CAGTCAGGGCGTTAGATCT；Notch1上游：CAGGGCCTAGAAGCAGGCT，下游：CCGTAACGATCCGATGT；Hes1上游：CGAGAAGTTCAGGCTAG，下游：TCAGCATCTAAGAACGGT；β-actin上游：TGGTGGATATGCATCCCG，下游：GTTAGTTCGCCGTAT。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，2組間比較分別實施LSD-t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 股骨、脛骨骨密度比較

與空白組比較，造模后各組大鼠股骨、脛骨骨密度明顯降低（Plt;0.05）；與模型組比較，陽性組及實驗組大鼠股骨、脛骨骨密度明顯升高（Plt;0.05），見表1。

2.2 血清OPG、PINP、TRACP及CTX-I含量比較

與空白組比較，模型組大鼠血清中OPG、PINP 明顯降低，TRACP、CTX-I 含量明顯升高（Plt;0.05）；干預(yù)治療6 周后，與模型組比較，陽性組及實驗組大鼠OPG、PINP明顯升高，TRACP、CTX-I含量明顯降低（Plt;0.05）；其中實驗組與陽性組對比，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），見表2。

2.3 腸黏膜組織膠原纖維變化比較

Masson染結(jié)果顯示，正常組大鼠腸黏膜組織正常，無明顯膠原增生；造模后，模型組大鼠黏膜下層出現(xiàn)明顯膠原纖維增生；與模型組比較，干預(yù)治療后，大鼠腸黏膜組織膠原纖維增生程度明顯降低（圖2）。

2.4 腸黏膜組織細胞凋亡情況比較

TUNEL染色提示藍色熒光為正常細胞核，綠色熒光為凋亡細胞的分布。結(jié)果顯示，空白組大鼠腸黏膜組織中細胞正常表達，綠色熒光極少；模型組大鼠造模后綠色熒光增多，提示免疫應(yīng)答發(fā)生，細胞凋亡增加；干預(yù)治療后，大鼠腸黏膜組織中細胞凋亡情況明顯減少（圖3）。

2.5 腸黏膜組織中1，25-D3-MARRS蛋白表達比較

與空白組比較，大鼠造模后腸黏膜組織中1，25-D3-MARRS蛋白表達量明顯下降（Plt;0.05）；與模型組比較，干預(yù)治療后，大鼠腸黏膜組織中1，25-D3-MARRS蛋白表達量明顯升高（Plt;0.05）（表3、圖4）。

2.6 腸黏膜組織中Jagged1、Notch1、Hes1蛋白表達

與空白組比較，造模后模型組大鼠腸黏膜組織中Jagged1、Notch1蛋白表達量明顯下降，Hes1蛋白表達量明顯上升（Plt;0.05）；與模型組比較，干預(yù)治療后，陽性組及實驗組Jagged1、Notch1蛋白表達量明顯上升，Hes1蛋白表達量明顯下降（Plt;0.05）（表4、圖5）。

2.7 腸黏膜組織中Jagged1、Notch1、Hes1 mRNA 表達水平比較

與空白組比較，造模后模型組大鼠腸黏膜組織中Jagged1、Notch1mRNA表達量明顯下降，Hes1 mRNA表達量明顯上升（Plt;0.05）；與模型組比較，干預(yù)治療后，陽性組及實驗組Jagged1、Notch1mRNA表達量明顯上升，Hes1mRNA表達量明顯下降（Plt;0.05）（表5）。

3 討論

骨代謝及腸鈣吸收異常是OP的重要特征，OP腸鈣吸收異常早期會出現(xiàn)組織間氧自由基損傷，生物膜脂質(zhì)逐步發(fā)生過氧化導(dǎo)致細胞損傷加劇，多種炎性信號通路被激活，產(chǎn)生大量炎癥細胞因子并引發(fā)細胞凋亡進程[5-6]。目前西醫(yī)學治療OP導(dǎo)致的骨代謝及腸鈣吸收異常主要以營養(yǎng)支持輔助腸黏膜保護措施為主，患者常出現(xiàn)不良反應(yīng)，且易復(fù)發(fā)。

人參皂苷Rg3提取自五加科植物人參，是人參的主要藥效成分之一。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，人參皂苷可以明顯增加骨代謝，參與多種骨細胞的凋亡與自噬過程。人參皂苷Rg3能夠有效調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，控制炎癥介質(zhì)，調(diào)控骨重塑及骨代謝，有效保護腸道黏膜，促進腸鈣吸收[9-10]。

鈣作為細胞代謝中重要的骨礦物質(zhì)元素，其減少及丟失是引起骨密度下降及OP發(fā)生的主要原因之一，而機體內(nèi)鈣的吸收與1，25-D3-MARRS 蛋白存在密切關(guān)系。1，25-D3-MARRS是體內(nèi)維生素D的活性形式，可在小腸、骨等多種器官組織中表達，對人體鈣磷代謝及骨細胞分化及骨的吸收有重要作用[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，1，25-D3-MARRS在小腸內(nèi)與受體蛋白結(jié)合后，激活磷脂酶A2及磷脂酶C，從而促進鈣磷在小腸內(nèi)迅速吸收[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)，OP大鼠造模后，1，25-D3-MARRS含量下降，骨密度明顯降低，這說明大鼠腸道鈣的吸收下降，促進骨質(zhì)疏松的發(fā)生，而經(jīng)過治療后，1，25-D3-MARRS含量及骨密度均發(fā)生改善，說明人參皂苷Rg3促進了大鼠腸道內(nèi)1，25-D3-MARRS的增加，改善了OP大鼠的骨密度。

Notch 通路是一類高保守的細胞表面受體通路，影響多種細胞正常形態(tài)的發(fā)生，包括多能祖細胞的分化、凋亡、增殖及細胞邊界的形成等過程，研究指出[14]，Notch通路能夠調(diào)節(jié)組織中骨代謝及骨重建，調(diào)控骨吸收及骨形成過程。而OPG、PINP、TRACP及CTX-I等是破骨細胞形成、分化和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子[15-16]。Canalis E 等[17]研究表明，骨細胞中Notch通路表達能促進小鼠血清OPG含量增加，從而抑制骨吸收過程。Jagged1 是Notch 的主要配體之一，Notch1 是Notch 信號分子的主要受體之一，Hes1是主要的靶分子；相鄰細胞之間Jagged1及Jagged1分子在靶分子Hes1作用下通過受體與配體的結(jié)合傳遞Notch信號，從而擴大并固化細胞間的分子差異，影響細胞形態(tài)發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，OP大鼠造模后血清中OPG、PINP、TRACP及CTX-I含量發(fā)生明顯變化，細胞凋亡程度增加，腸纖維化及炎癥水平均發(fā)生變化，這表明OP大鼠造模后體內(nèi)細胞凋亡程度增加，骨的形成和吸收發(fā)生改變，這與OP的病理表現(xiàn)一致。大鼠在人參皂苷 Rg3 干預(yù)治療后，OPG、PINP、TRACP及CTX-I等標志物水平均明顯改善，細胞凋亡減輕，腸纖維化改善，這與以往學者[18]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，大鼠造模后Notch 通路相關(guān)蛋白Jagged1、Notch1、Hes1 表達明顯變化，但經(jīng)人參皂苷Rg3干預(yù)治療后，相關(guān)蛋白表達趨向好轉(zhuǎn)，這說明人參皂苷Rg3干預(yù)了OP大鼠Notch通路的表達，影響OP大鼠腸黏膜組織細胞凋亡，改善組織纖維化，促進鈣吸收，改善腸黏膜功能。

綜上所述，人參皂苷Rg3能夠有效改善OP大鼠骨代謝水平及腸吸收功能，改善腸黏膜組織纖維化及細胞凋亡過程，促進腸道鈣吸收。