高土玲 符天曉

（海南省食品藥品檢驗所三亞分所 海南三亞 572000）

0 引言

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）簡稱單增李斯特氏菌，是一種食物傳播病原菌，特別是對免疫缺陷的人群具有潛在的致命性[1]。2002 年，WHO 已將單核細胞增生李斯特氏菌列為重要的食源性致病菌之一[2]。 由該菌感染引起的人畜患胃腸炎、腦膜炎、敗血癥以及孕婦流產(chǎn)等疾病致死率高達30%～70%[3-4]。 隨著人們生活節(jié)奏的加快，速凍食品、即食食品的消費量也迅速增加，但該類食品極易被單增李斯特氏菌污染[5]。 近年來，我國食品安全風險監(jiān)測人員調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 我國即食食品中的熟肉制品和涼拌菜污染該致病菌的概率較高[6-7]，因此，建立快速、準確的檢測方法是保障人民食品衛(wèi)生安全的重要手段。

目前， 我國食品藥品檢驗檢測機構(gòu)主要采用國標法GB 4789.30—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗檢》[8]檢測食品中單增生李斯特氏菌。 國標法檢測的程序比較繁瑣，首先是對待測樣品進行選擇性增菌培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接至顯色培養(yǎng)基平板上，根據(jù)顯色平板上的菌落特征進行分離單增李斯特氏菌， 再經(jīng)過一系列生化試驗進行確證。 國標法檢測周期長，大約需要5～7 d，不能滿足快速檢測的要求，且容易受到同屬其他李斯特菌的影響，對檢驗人員的操作能力和工作經(jīng)驗要求較高[9]。 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 是Notomi 等建立的一種新的核酸擴增方法[10]，原理是利用4 條特殊設(shè)計的引物及具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶，在恒溫條件下高效擴增核酸，在1 h 內(nèi)即可完成。 易敏英等[11]建立了恒溫實時熒光法檢測副溶血性弧菌， 該方法具有特異性強、靈敏高等特點，符天曉等[12]在副溶血性弧菌檢驗能力驗證中，利用恒溫熒光PCR 法與國標法進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法檢測結(jié)果一致，利用恒溫熒光PCR 法可有效提高檢測效率。 黃小真[13]建立同時快速檢測6 種致病菌的恒溫熒光PCR 方法，發(fā)現(xiàn)恒溫熒光PCR 法和國標培養(yǎng)法檢測的結(jié)果一致性為100%。

有文獻報道， 少數(shù)單增李斯特氏菌存在不溶血現(xiàn)象（ATCC15313）、少數(shù)英諾克李斯特氏菌能夠發(fā)酵木糖等[8]，因此，檢驗人員不能單純通過溶血實驗或某個生化實驗結(jié)果來確認或排除某一種李斯特氏菌，有必要利用核酸擴增（PCR）的手段，在分子水平上對單增李斯特氏菌進行檢測， 這樣能夠避免漏檢或判斷錯誤的發(fā)生。 本研究以中國檢驗檢疫科學研究院組織的單核細胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證為契機， 通過比較分析恒溫實時熒光核酸檢測技術(shù)與國標GB 4789.30—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》 的結(jié)果， 以期豐富實驗室人員對單增李斯特氏菌的檢測經(jīng)驗，提高實驗室檢驗檢測能力。 同時，利用恒溫熒光PCR 法快速檢測單增生李斯特氏菌的方法進行確認，為食品中致病菌的快速檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

中國檢驗檢疫科學研究院發(fā)放的編號為20-E323、20-P712 的肉類凍干粉。

1.1.2 耗材和儀器

對照用菌株：單核細胞增生李斯特氏菌（中國工業(yè)菌種保藏中心，編號：CICC23929）、英諾克李斯特氏菌（中國工業(yè)菌種保藏中心，編號：CICC10417）。

試劑：李氏增菌肉湯LB（LB1，LB2）、單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、PALCAM 瓊脂、 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉湯（TSB-YE）、血平板、單核細胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒（廣州環(huán)凱微生物科技有限公司）；VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統(tǒng)、GP 卡（生物梅里埃公司）；DNA 快速提取試劑盒、 單核細胞增生李斯特氏菌核酸檢測試劑盒包括LM 反應(yīng)液、Bst DNA 聚合酶、陰性對照、LM 陽性對照、密封液（廣州迪澳生物科技有限公司）。所有試劑經(jīng)過驗證并在有效期內(nèi)。

儀器：MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌鍋（日本松下公司）；KB240 生化培養(yǎng)箱（德國BINDER 公司）；BHC-1300ⅡA2 生物安全柜（蘇州安泰空氣計數(shù)有限公司）；Deaou-308C 恒溫熒光檢測儀（廣州迪澳生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 國標檢驗方法

參照GB 4789.30—2016 《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗第一法單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗》進行檢測。

增菌和分離：分別將20-E323、20-P712 的肉類凍干粉樣品，無菌操作打開凍干細菌混合物西林瓶，立即加入18 mL 生理鹽水復原，充分混勻，復原后樣品相當于25 g 的新鮮肉糜樣品。 以無菌操作方式，將上述待測樣品放入盛有225 mL LB1增菌液的無菌均質(zhì)杯中，均質(zhì)，同時，接種本實驗室保藏的單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌作為對照， 置于30℃生化培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)24 h。 用移液槍分別吸取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi)，于30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 將LB2增菌液分別轉(zhuǎn)接至具有選擇性的平板上， 即接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM 瓊脂平板， 并于36℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。

生化鑒定：從選擇性平板上挑選5 個可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36℃培養(yǎng)24 h。 同時，在TSA-YE 平板上進行純化，置于36℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用于生化試驗。根據(jù)單增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒說明書進行生化鑒定。同時，制備濁度為0.5 的菌懸液進行VITEK 2 COMPACT 生化鑒定。

1.2.2 恒溫熒光PCR 檢驗方法

參照廣州迪澳生物科技有限公司提供的DNA提取試劑盒的使用方法進行模板制備； 參照試劑配制、添加模板、擴增反應(yīng)。

（1）模板制備

吸取1 mL LB1培養(yǎng)液于1.5 mL EP 管內(nèi)，離心，去掉上清液，加入1 mL 無菌水混勻作為待測液，取待測菌液100 μL 至900 μL DNA 提取液，渦旋振蕩混勻，在金屬浴100℃條件下加熱10 min，1 000 r/min離心30 s， 所得上清液為待測樣品基因組DNA，作為PCR 擴增模板。

（2）試劑配制

將試劑解凍、混勻，1 000 r/min 離心30 s，將LM反應(yīng)液（22 μL×N）和Bst 聚合酶（1.0 μL×N）置于1.5 mL EP 管中，渦旋混勻、離心30 s，分裝到N 個0.2 mL PCR 管中，每管加入23 μL 混合反應(yīng)液，最后分別向每管加入20 μL 密封液。

（3）添加模板

在步驟（2）中已含反應(yīng)液的PCR 管中加入2 μL模板， 順序為陰性對照、 待測樣品模板、 陽性對照（LM），1 000 r/min 離心30 s，立即進行擴增反應(yīng)。

（4）擴增反應(yīng)

使用Deaou-308C 恒溫熒光檢測儀進行檢測，反應(yīng)程序為63℃反應(yīng)45 min， 儀器自動判定結(jié)果，如若有“S”型擴增曲線，則判斷為陽性，即檢出單增李斯特氏菌；如無“S”型擴增曲線，則判為陰性，即未檢出單增李斯特氏菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 國標檢驗結(jié)果

2.1.1 菌落形態(tài)

單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、20-E323和20-P712 的菌落在顯色平板上的菌落特征如圖1、圖2 所示。其中圖1 為菌落在PALCMA 平板上的培養(yǎng)結(jié)果， 結(jié)果顯示， 陽性對照菌株單增李斯特氏菌、 陰性對照菌株英諾克李斯特氏菌以及20-E323和20-P712 在PALCMA 平板上均有小的圓型灰綠色菌落、周圍有棕黑色水解圈的菌落生長。在單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上， 因單增李斯特氏菌生長代謝產(chǎn)生葡萄糖甘酶能夠與顯色培養(yǎng)基中的底物發(fā)生酶特異性反應(yīng)，產(chǎn)生特有的菌落形態(tài)：藍綠色光滑規(guī)則小菌落， 而英諾克李斯特氏菌菌落為無色光滑規(guī)則小菌落。 由圖2 可知， 陽性對照菌單增李斯特氏菌、20-E323 和20-P712 在單增李斯特氏菌顯色平板上均有規(guī)則藍綠色光滑小菌落， 完全符合單增李斯特氏菌在李斯特氏菌顯色平板上的形態(tài)特征。

圖1 單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、20-E323 和20-P712 在PALCMA 平板上的可疑菌落Fig.1 Suspected colonies of Listeria monocytogenes，Listeria inoculata，20-E323 and 20-P712 on PALCMA plates

圖2 單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、20-E323 和20-P712 在李斯特菌顯色培養(yǎng)基平板上的可疑菌落Fig.2 Suspected colonies of Listeria monocytogenes，Listeria inoculata，20-E323 and 20-P712 on Listeria chromogenic medium plates

2.1.2 生化鑒定結(jié)果

為了確證顯色平板所生長的菌落是否屬于單增李斯特氏菌，將平板上的可疑菌落進行純化，采用廣州環(huán)凱單核細胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒以及梅里埃VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行生化鑒定實驗。 可疑菌落革蘭氏染色均為陽性短桿菌。 動力試驗結(jié)果顯示：在SIM 培養(yǎng)基上方呈傘狀生長。 生化試劑盒鑒定結(jié)果如表1 所示，20-E323 和20-P712 的可疑菌落糖發(fā)酵結(jié)果如下：七葉苷（+）陽性、木糖（-）陰性、鼠李糖（+）陽性、葡萄糖（+）陽性、麥芽糖（+）陽性、甘露醇（-）陰性，生化結(jié)果與陽性對照菌單增李斯特氏菌的結(jié)果一致，符合國家標準GB 4789.30—2016 描述單增李斯特氏菌的生化特性。

表1 單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、20-E323 和20-P712 的可疑菌落生化反應(yīng)的結(jié)果Table1 Results of suspected colony biochemical reactions for Listeria monocytogenes，Listeria innock，20-E323，and 20-P712

VITEK 2 COMPACT 自動微生物鑒定系統(tǒng)常用于微生物的鑒定， 且符合我國食品微生物學檢驗相關(guān)標準的要求。使用VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行生化鑒定，20-E323 和20-P712的可疑菌落鑒定結(jié)果見表2。 由表2 可知，2 組能力驗證樣品的可疑菌落確定為單增李斯特氏菌。

表2 VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定的結(jié)果Table 2 The results of VITEK 2 COMPACT automatic microbial identification

2.2 恒溫熒光PCR 檢測結(jié)果

恒溫熒光PCR 檢測結(jié)果顯示，待檢樣品20-E323和20-P712 均檢出，如圖3 所示，20-E323、20-P712 與陽性對照單增李斯特氏菌的出峰時間在13～15 min之間，熒光吸收值峰值為23 000 左右，2 組樣品與陽性對照的結(jié)果基本一致。

圖3 20-E323 和20-P712 恒溫熒光PCR 檢測結(jié)果Fig.3 The results of two groups of samples were determined by isothermal fluorescence PCR

2.3 恒溫熒光PCR 法與國標法對2 組樣品驗證結(jié)果的比較

能力驗證樣品的恒溫熒光PCR 法與國標方法檢測結(jié)果一致。如表3 所示，2 組樣品均檢出單增李斯特氏菌。 為了能夠更加直觀的分析恒溫熒光PCR法的準確率，以國家標準方法為參考方法，計算其靈敏度和準確度，發(fā)現(xiàn)其靈敏度和準確度均為100%。計算公式如下：

表3 恒溫熒光法與國標方法檢測結(jié)果的比較Table 3 Comparison of detection results by isothermal fluorescence PCR and national standard method

式中：A——待確認方法和參考方法均確認為陽性的數(shù)量；B——參考方法為陽性，待確認方法為陰性的數(shù)量；C——待確認方法和參考方法均確認為陰性的數(shù)量。 N=A+B+C。

3 結(jié)論與討論

本次能力驗證采用恒溫熒光PCR 法和國家標準GB 4789.30-2016 對2 組能力驗證樣品的可疑菌落進行單增李斯特氏菌鑒定，2 種方法的檢測結(jié)果為：20-E323 和20-P712 均檢出單增李斯特氏菌，此次能力驗證獲得滿意評價， 表明本實驗室完全具備檢測單增李斯特氏菌的能力， 采用2 種不同的檢驗手段也驗證了實驗室人員具有基本素質(zhì)和職業(yè)素養(yǎng)。同時也進一步證實了，當待測樣品經(jīng)過增菌富集后，采用恒溫熒光PCR 法檢測與國家標準法檢測具有同等的檢出率。

食品中單增李斯特氏菌的含量有可能較低，且經(jīng)過加工后會造成細胞損傷， 若利用常規(guī)的國標準進行檢測，有可能會出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。本文通過對恒溫熒光PCR 法檢測結(jié)果與國標方法檢測結(jié)果進行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩者的檢測結(jié)果一致，且與國家標準方法相比，恒溫熒光PCR 法操作步驟簡單、耗時短、準確率高，可以快速檢出陽性樣品，可為后續(xù)的國家標準方法檢驗作為重要提示， 可以更好地排除人員操作對試驗結(jié)果的影響，防止漏檢現(xiàn)象的發(fā)生。在今后的工作中，可將恒溫熒光PCR 篩選技術(shù)運用到其他的食品中致病菌的初篩。同時，在重大活動餐飲保障任務(wù)、 重點節(jié)假餐飲食品安全保障等需要快速出具檢測結(jié)果或者需要現(xiàn)場進行檢測的工作中， 可以利用恒溫熒光PCR 法進行檢測，能夠快速阻斷問題食品流向餐桌，確保廣大人民群眾的飲食安全。 并且，恒溫熒光PCR 檢測技術(shù)可操作性強，即使基礎(chǔ)條件相對薄弱的實驗室也可以開展檢測工作。