高土玲 符天曉

（海南省食品藥品檢驗(yàn)所三亞分所 海南三亞 572000）

0 引言

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）簡稱單增李斯特氏菌，是一種食物傳播病原菌，特別是對免疫缺陷的人群具有潛在的致命性[1]。2002 年，WHO 已將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌列為重要的食源性致病菌之一[2]。 由該菌感染引起的人畜患胃腸炎、腦膜炎、敗血癥以及孕婦流產(chǎn)等疾病致死率高達(dá)30%～70%[3-4]。 隨著人們生活節(jié)奏的加快，速凍食品、即食食品的消費(fèi)量也迅速增加，但該類食品極易被單增李斯特氏菌污染[5]。 近年來，我國食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測人員調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 我國即食食品中的熟肉制品和涼拌菜污染該致病菌的概率較高[6-7]，因此，建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法是保障人民食品衛(wèi)生安全的重要手段。

目前， 我國食品藥品檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)主要采用國標(biāo)法GB 4789.30—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)檢》[8]檢測食品中單增生李斯特氏菌。 國標(biāo)法檢測的程序比較繁瑣，首先是對待測樣品進(jìn)行選擇性增菌培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接至顯色培養(yǎng)基平板上，根據(jù)顯色平板上的菌落特征進(jìn)行分離單增李斯特氏菌， 再經(jīng)過一系列生化試驗(yàn)進(jìn)行確證。 國標(biāo)法檢測周期長，大約需要5～7 d，不能滿足快速檢測的要求，且容易受到同屬其他李斯特菌的影響，對檢驗(yàn)人員的操作能力和工作經(jīng)驗(yàn)要求較高[9]。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 是Notomi 等建立的一種新的核酸擴(kuò)增方法[10]，原理是利用4 條特殊設(shè)計(jì)的引物及具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，在1 h 內(nèi)即可完成。 易敏英等[11]建立了恒溫實(shí)時(shí)熒光法檢測副溶血性弧菌， 該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏高等特點(diǎn)，符天曉等[12]在副溶血性弧菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證中，利用恒溫?zé)晒釶CR 法與國標(biāo)法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法檢測結(jié)果一致，利用恒溫?zé)晒釶CR 法可有效提高檢測效率。 黃小真[13]建立同時(shí)快速檢測6 種致病菌的恒溫?zé)晒釶CR 方法，發(fā)現(xiàn)恒溫?zé)晒釶CR 法和國標(biāo)培養(yǎng)法檢測的結(jié)果一致性為100%。

有文獻(xiàn)報(bào)道， 少數(shù)單增李斯特氏菌存在不溶血現(xiàn)象（ATCC15313）、少數(shù)英諾克李斯特氏菌能夠發(fā)酵木糖等[8]，因此，檢驗(yàn)人員不能單純通過溶血實(shí)驗(yàn)或某個(gè)生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確認(rèn)或排除某一種李斯特氏菌，有必要利用核酸擴(kuò)增（PCR）的手段，在分子水平上對單增李斯特氏菌進(jìn)行檢測， 這樣能夠避免漏檢或判斷錯(cuò)誤的發(fā)生。 本研究以中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院組織的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測能力驗(yàn)證為契機(jī)， 通過比較分析恒溫實(shí)時(shí)熒光核酸檢測技術(shù)與國標(biāo)GB 4789.30—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》 的結(jié)果， 以期豐富實(shí)驗(yàn)室人員對單增李斯特氏菌的檢測經(jīng)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測能力。 同時(shí)，利用恒溫?zé)晒釶CR 法快速檢測單增生李斯特氏菌的方法進(jìn)行確認(rèn)，為食品中致病菌的快速檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院發(fā)放的編號為20-E323、20-P712 的肉類凍干粉。

1.1.2 耗材和儀器

對照用菌株：單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（中國工業(yè)菌種保藏中心，編號：CICC23929）、英諾克李斯特氏菌（中國工業(yè)菌種保藏中心，編號：CICC10417）。

試劑：李氏增菌肉湯LB（LB1，LB2）、單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、PALCAM 瓊脂、 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉湯（TSB-YE）、血平板、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒（廣州環(huán)凱微生物科技有限公司）；VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、GP 卡（生物梅里埃公司）；DNA 快速提取試劑盒、 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌核酸檢測試劑盒包括LM 反應(yīng)液、Bst DNA 聚合酶、陰性對照、LM 陽性對照、密封液（廣州迪澳生物科技有限公司）。所有試劑經(jīng)過驗(yàn)證并在有效期內(nèi)。

儀器：MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌鍋（日本松下公司）；KB240 生化培養(yǎng)箱（德國BINDER 公司）；BHC-1300ⅡA2 生物安全柜（蘇州安泰空氣計(jì)數(shù)有限公司）；Deaou-308C 恒溫?zé)晒鈾z測儀（廣州迪澳生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 國標(biāo)檢驗(yàn)方法

參照GB 4789.30—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)第一法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)》進(jìn)行檢測。

增菌和分離：分別將20-E323、20-P712 的肉類凍干粉樣品，無菌操作打開凍干細(xì)菌混合物西林瓶，立即加入18 mL 生理鹽水復(fù)原，充分混勻，復(fù)原后樣品相當(dāng)于25 g 的新鮮肉糜樣品。 以無菌操作方式，將上述待測樣品放入盛有225 mL LB1增菌液的無菌均質(zhì)杯中，均質(zhì)，同時(shí)，接種本實(shí)驗(yàn)室保藏的單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌作為對照， 置于30℃生化培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24 h。 用移液槍分別吸取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi)，于30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 將LB2增菌液分別轉(zhuǎn)接至具有選擇性的平板上， 即接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM 瓊脂平板， 并于36℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。

生化鑒定：從選擇性平板上挑選5 個(gè)可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36℃培養(yǎng)24 h。 同時(shí)，在TSA-YE 平板上進(jìn)行純化，置于36℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用于生化試驗(yàn)。根據(jù)單增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒說明書進(jìn)行生化鑒定。同時(shí)，制備濁度為0.5 的菌懸液進(jìn)行VITEK 2 COMPACT 生化鑒定。

1.2.2 恒溫?zé)晒釶CR 檢驗(yàn)方法

參照廣州迪澳生物科技有限公司提供的DNA提取試劑盒的使用方法進(jìn)行模板制備； 參照試劑配制、添加模板、擴(kuò)增反應(yīng)。

（1）模板制備

吸取1 mL LB1培養(yǎng)液于1.5 mL EP 管內(nèi)，離心，去掉上清液，加入1 mL 無菌水混勻作為待測液，取待測菌液100 μL 至900 μL DNA 提取液，渦旋振蕩混勻，在金屬浴100℃條件下加熱10 min，1 000 r/min離心30 s， 所得上清液為待測樣品基因組DNA，作為PCR 擴(kuò)增模板。

（2）試劑配制

將試劑解凍、混勻，1 000 r/min 離心30 s，將LM反應(yīng)液（22 μL×N）和Bst 聚合酶（1.0 μL×N）置于1.5 mL EP 管中，渦旋混勻、離心30 s，分裝到N 個(gè)0.2 mL PCR 管中，每管加入23 μL 混合反應(yīng)液，最后分別向每管加入20 μL 密封液。

（3）添加模板

在步驟（2）中已含反應(yīng)液的PCR 管中加入2 μL模板， 順序?yàn)殛幮詫φ铡?待測樣品模板、 陽性對照（LM），1 000 r/min 離心30 s，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

（4）擴(kuò)增反應(yīng)

使用Deaou-308C 恒溫?zé)晒鈾z測儀進(jìn)行檢測，反應(yīng)程序?yàn)?3℃反應(yīng)45 min， 儀器自動(dòng)判定結(jié)果，如若有“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陽性，即檢出單增李斯特氏菌；如無“S”型擴(kuò)增曲線，則判為陰性，即未檢出單增李斯特氏菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 國標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 菌落形態(tài)

單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、20-E323和20-P712 的菌落在顯色平板上的菌落特征如圖1、圖2 所示。其中圖1 為菌落在PALCMA 平板上的培養(yǎng)結(jié)果， 結(jié)果顯示， 陽性對照菌株單增李斯特氏菌、 陰性對照菌株英諾克李斯特氏菌以及20-E323和20-P712 在PALCMA 平板上均有小的圓型灰綠色菌落、周圍有棕黑色水解圈的菌落生長。在單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上， 因單增李斯特氏菌生長代謝產(chǎn)生葡萄糖甘酶能夠與顯色培養(yǎng)基中的底物發(fā)生酶特異性反應(yīng)，產(chǎn)生特有的菌落形態(tài)：藍(lán)綠色光滑規(guī)則小菌落， 而英諾克李斯特氏菌菌落為無色光滑規(guī)則小菌落。 由圖2 可知， 陽性對照菌單增李斯特氏菌、20-E323 和20-P712 在單增李斯特氏菌顯色平板上均有規(guī)則藍(lán)綠色光滑小菌落， 完全符合單增李斯特氏菌在李斯特氏菌顯色平板上的形態(tài)特征。

圖1 單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、20-E323 和20-P712 在PALCMA 平板上的可疑菌落Fig.1 Suspected colonies of Listeria monocytogenes，Listeria inoculata，20-E323 and 20-P712 on PALCMA plates

圖2 單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、20-E323 和20-P712 在李斯特菌顯色培養(yǎng)基平板上的可疑菌落Fig.2 Suspected colonies of Listeria monocytogenes，Listeria inoculata，20-E323 and 20-P712 on Listeria chromogenic medium plates

2.1.2 生化鑒定結(jié)果

為了確證顯色平板所生長的菌落是否屬于單增李斯特氏菌，將平板上的可疑菌落進(jìn)行純化，采用廣州環(huán)凱單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒以及梅里埃VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定實(shí)驗(yàn)。 可疑菌落革蘭氏染色均為陽性短桿菌。 動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果顯示：在SIM 培養(yǎng)基上方呈傘狀生長。 生化試劑盒鑒定結(jié)果如表1 所示，20-E323 和20-P712 的可疑菌落糖發(fā)酵結(jié)果如下：七葉苷（+）陽性、木糖（-）陰性、鼠李糖（+）陽性、葡萄糖（+）陽性、麥芽糖（+）陽性、甘露醇（-）陰性，生化結(jié)果與陽性對照菌單增李斯特氏菌的結(jié)果一致，符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.30—2016 描述單增李斯特氏菌的生化特性。

表1 單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、20-E323 和20-P712 的可疑菌落生化反應(yīng)的結(jié)果Table1 Results of suspected colony biochemical reactions for Listeria monocytogenes，Listeria innock，20-E323，and 20-P712

VITEK 2 COMPACT 自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)常用于微生物的鑒定， 且符合我國食品微生物學(xué)檢驗(yàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。使用VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定，20-E323 和20-P712的可疑菌落鑒定結(jié)果見表2。 由表2 可知，2 組能力驗(yàn)證樣品的可疑菌落確定為單增李斯特氏菌。

表2 VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定的結(jié)果Table 2 The results of VITEK 2 COMPACT automatic microbial identification

2.2 恒溫?zé)晒釶CR 檢測結(jié)果

恒溫?zé)晒釶CR 檢測結(jié)果顯示，待檢樣品20-E323和20-P712 均檢出，如圖3 所示，20-E323、20-P712 與陽性對照單增李斯特氏菌的出峰時(shí)間在13～15 min之間，熒光吸收值峰值為23 000 左右，2 組樣品與陽性對照的結(jié)果基本一致。

圖3 20-E323 和20-P712 恒溫?zé)晒釶CR 檢測結(jié)果Fig.3 The results of two groups of samples were determined by isothermal fluorescence PCR

2.3 恒溫?zé)晒釶CR 法與國標(biāo)法對2 組樣品驗(yàn)證結(jié)果的比較

能力驗(yàn)證樣品的恒溫?zé)晒釶CR 法與國標(biāo)方法檢測結(jié)果一致。如表3 所示，2 組樣品均檢出單增李斯特氏菌。 為了能夠更加直觀的分析恒溫?zé)晒釶CR法的準(zhǔn)確率，以國家標(biāo)準(zhǔn)方法為參考方法，計(jì)算其靈敏度和準(zhǔn)確度，發(fā)現(xiàn)其靈敏度和準(zhǔn)確度均為100%。計(jì)算公式如下：

表3 恒溫?zé)晒夥ㄅc國標(biāo)方法檢測結(jié)果的比較Table 3 Comparison of detection results by isothermal fluorescence PCR and national standard method

式中：A——待確認(rèn)方法和參考方法均確認(rèn)為陽性的數(shù)量；B——參考方法為陽性，待確認(rèn)方法為陰性的數(shù)量；C——待確認(rèn)方法和參考方法均確認(rèn)為陰性的數(shù)量。 N=A+B+C。

3 結(jié)論與討論

本次能力驗(yàn)證采用恒溫?zé)晒釶CR 法和國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.30-2016 對2 組能力驗(yàn)證樣品的可疑菌落進(jìn)行單增李斯特氏菌鑒定，2 種方法的檢測結(jié)果為：20-E323 和20-P712 均檢出單增李斯特氏菌，此次能力驗(yàn)證獲得滿意評價(jià)， 表明本實(shí)驗(yàn)室完全具備檢測單增李斯特氏菌的能力， 采用2 種不同的檢驗(yàn)手段也驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)室人員具有基本素質(zhì)和職業(yè)素養(yǎng)。同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了，當(dāng)待測樣品經(jīng)過增菌富集后，采用恒溫?zé)晒釶CR 法檢測與國家標(biāo)準(zhǔn)法檢測具有同等的檢出率。

食品中單增李斯特氏菌的含量有可能較低，且經(jīng)過加工后會造成細(xì)胞損傷， 若利用常規(guī)的國標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，有可能會出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。本文通過對恒溫?zé)晒釶CR 法檢測結(jié)果與國標(biāo)方法檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩者的檢測結(jié)果一致，且與國家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，恒溫?zé)晒釶CR 法操作步驟簡單、耗時(shí)短、準(zhǔn)確率高，可以快速檢出陽性樣品，可為后續(xù)的國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)作為重要提示， 可以更好地排除人員操作對試驗(yàn)結(jié)果的影響，防止漏檢現(xiàn)象的發(fā)生。在今后的工作中，可將恒溫?zé)晒釶CR 篩選技術(shù)運(yùn)用到其他的食品中致病菌的初篩。同時(shí)，在重大活動(dòng)餐飲保障任務(wù)、 重點(diǎn)節(jié)假餐飲食品安全保障等需要快速出具檢測結(jié)果或者需要現(xiàn)場進(jìn)行檢測的工作中， 可以利用恒溫?zé)晒釶CR 法進(jìn)行檢測，能夠快速阻斷問題食品流向餐桌，確保廣大人民群眾的飲食安全。 并且，恒溫?zé)晒釶CR 檢測技術(shù)可操作性強(qiáng)，即使基礎(chǔ)條件相對薄弱的實(shí)驗(yàn)室也可以開展檢測工作。