摘""""" 要： 由于生物硫醇的熒光探針能夠更好地理解與生物硫醇種類有關(guān)的各種生理和病理過程，因此引起了人們越來越多的興趣。氟硼二吡咯（BODIPY）熒光團顯示出出色的光學(xué)性能，可以通過在BODIPY核心的各個位置引入各種功能單元來輕松定制這些熒光團。系統(tǒng)地總結(jié)了基于BODIPY的熒光探針用于生物硫醇檢測的開發(fā)，重點是優(yōu)先檢測單個生物硫醇。

關(guān) "鍵" 詞：氟硼二吡咯；生物硫醇；熒光探針

中圖分類號：O657.3"" """"文獻標識碼： A"""" "文章編號： 1004-0935（2023）08-1197-04

生物硫醇包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、還原性谷胱甘肽（GSH）和硫化氫（H₂S），在生物系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用^[1]。硫化氫作為最簡單的生物硫醇，是通過酶過程和非酶過程內(nèi)源性產(chǎn)生的^[2]。硫化氫水平異?？赡軐?dǎo)致各種問題，如亨廷頓氏病、帕金森氏病和阿爾茨海默氏病^[3]。異常水平的Cys對肝損傷、皮膚損傷、毛發(fā)脫色、生長緩慢、癌癥等均有影響^[4]。Hcy一直被認為是心血管疾病和阿爾茨海默病的危險因素^[5]。GSH是細胞內(nèi)最豐富的生物硫醇（1～10 mmol·L^-1），由于其獨特的氧化還原特性和親核性，在人類健康和疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用^[6]。因此，檢測和監(jiān)測生物硫醇的水平對于理解生物硫醇在生理和病理過程和診斷中的功能非常重要。

熒光成像是監(jiān)測生物環(huán)境中的目標和生物過程的強大技術(shù)，特別是由于其高靈敏度、優(yōu)秀的時空分辨率和活細胞中分析物的傳感和相當簡單的技術(shù)實現(xiàn)^[7-8]。確保對復(fù)雜的細胞內(nèi)感興趣的分析物的高度選擇性和敏感的反應(yīng)，發(fā)生不同類型反應(yīng)的介質(zhì)是熒光探針設(shè)計的關(guān)鍵要求。在過去幾年里，基于反應(yīng)的探針（被稱為“化學(xué)劑量計”）已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物成像研究中，具有代表性的化學(xué)劑量計由熒光團組成，與官能團連接，官能團作為分析物的特定反應(yīng)位點。在基于反應(yīng)的生物正交反應(yīng)中，分析物特異性生物正交反應(yīng)的可見光信號大多是不可逆的^[9-12]。

氟硼二吡咯（BODIPY）染料（圖1）具有許多獨特且令人滿意的性質(zhì)，如高摩爾吸收系數(shù)、良好的熒光量子產(chǎn)率、優(yōu)秀的化學(xué)和光穩(wěn)定性、低溶劑的敏感性以及pH不敏感，此外它們的熒光性能可以很容易地通過對其結(jié)構(gòu)的輕微修飾來調(diào)節(jié)^[13-17]。

1" 基于BODIPY的生物硫醇探針

1.1" 硫化氫的選擇性探針

基于熒光分子探針的熒光成像因其良好的選擇性、高靈敏度、小生物樣品損傷和實時原位檢"""" 測^[18-19]，為檢測硫化氫等小生物分子提供了一種有吸引力的方法。有機小分子探針的反應(yīng)模式與硫化氫主要來自以下方面：硝基、羥胺或疊氮化物的還原^[20]；親核加成反應(yīng)^[21]；金屬硫化物的沉淀反應(yīng)^[22]；間-二硝基苯醚的硫解反應(yīng)^[23]；二硝基苯磺?；鶊F的裂解^[24]。

以硝基和二硝基苯醚為反應(yīng)基團的光子誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）探針由于其設(shè)計、合成和實際應(yīng)用簡單，表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。ZHU^[25]等設(shè)計合成了兩種不同的探針，包括以硝基為活性基團的DMONPB和以m-二硝基苯醚為活性基團的DMOEPB。DMONPB和DMOEPB分別獲得了51 nm和49 nm的斯托克斯位移。DMONPB可以與H₂S反應(yīng)形成衍生物（圖2），其熒光量子產(chǎn)率為0.13。在H₂S濃度為0～800 μmol·L^-1的范圍內(nèi)觀察到極好的線性關(guān)系，檢出限為1.3μmol·L^-1。此外，它可以成功地應(yīng)用于細胞和組織中H₂S的成像。對于DMOEPB，由于m-二硝基苯醚沒有與BODIPY熒光團相連，且硝基熒光團的吸電子效應(yīng)不能有效地影響B(tài)ODIPY熒光團的熒光強度，因此DMOEPB不能應(yīng)用于硫化氫的生物成像。當兩個苯環(huán)在8位分開且不與熒光團共軛時，硝基的強吸電子性能明顯" 減弱。

保羅^[26]等報道了一種用于選擇性檢測硫化氫的探針，該探針通過疊氮化物轉(zhuǎn)化為胺的化學(xué)反應(yīng)檢測硫化氫。探針1的檢測限為0.17 μmol·L^-1。當在pH值為7.4時加入NaSH時，探針的熒光強度降低了9倍。當探針在檢測外源性硫化氫時，對裝載探針1的正常人口腔成纖維細胞靈敏度高、特異性高、毒性最小。該探針可用于硅板條上，以檢測生銹水管中的硫化氫或存在其他分析物的廢水中的硫化氫，也可檢測NHOF細胞中的外源性硫化氫。

GONG^[27]等報道了一種基于苯基硒取代基的BODIPY熒光關(guān)閉傳感器BOD-PhSe，其目的是基于在3位的苯基硒化物基團與H₂S的取代反應(yīng)，以實現(xiàn)出色的H₂S檢測選擇性和靈敏度。過量添加硫化氫促進了探針5位上苯硒化物基團的進一步取代，并伴隨著熒光發(fā)射強度的進一步降低。傳感器表現(xiàn)出非凡的性能，在更長的激發(fā)波長下，紅色熒光強度降低了49倍，檢測限比較低，為""""""""" 0.002 5 μmol·L^-1，并且對H₂S的特異性熒光響應(yīng)在中性介質(zhì)中超過陰離子、生物硫醇和其他氨基酸。它無明顯的細胞毒性，有良好的膜通透性，已被廣泛用于細胞內(nèi)H₂S檢測和熒光顯微鏡成像。

1.2" 半胱氨酸的選擇性探針

熒光探針因其簡單性、靈敏度、實時性、無損成像特性而引起了人們的極大關(guān)注，用醛或丙烯酸酯環(huán)化、天然化學(xué)結(jié)扎（NCL）和芳香族取代-重排檢測Cys。GAO^[28]等設(shè)計并開發(fā)了1，7-二甲基，3，"" 5-二芳基取代的BODIPY及其構(gòu)象限制性物種，其中含有中芳基巰基部分（DM-BDP-SAr）和（DM-BDP-R-SAr）作為Cys的選擇性熒光探針。此外，還開發(fā)了基于DM-BDP-SAr的溶酶體靶標探針Lyso-S和Lyso-D，分別攜帶1個或2個嗎啉乙氧基部分。他們能夠在體外選擇性地檢測Cys，且檢測限較低。Lyso-S和Lyso-D都能很好地定位于活的HeLa細胞的溶酶體中，并顯示出Cys的紅色熒光。此外，該課題組通過密度泛函理論（DFT）的計算，提出了一種新穎的熒光猝滅機理。探針可以通過系統(tǒng)間的交叉（從單線態(tài)激發(fā)態(tài)到三線態(tài)激發(fā)態(tài)）來導(dǎo)致熒光猝滅。

LI^[29]等設(shè)計了一種名為NIR-BODIPY-Ac的NIR熒光探針。在探針中，將引入BODIPY核心形成NIR BODIPY熒光團，以丙烯酸酯基團作為識別位點（圖3）。探針的發(fā)射波長為708 nm，屬于NIR區(qū)域，適用于體內(nèi)生物成像。此外，該探針在添加Cys后表現(xiàn)出高熒光量子產(chǎn)率（Φ = 0.51），并對Cys具有高靈敏度，熒光增強81倍。Cys探針的線性范圍為0.2～30 μmol·L^-1，檢測限為0.05 μmol·L^-1。此外，由于探針與Cys之間的反應(yīng)速度比Hcy更快，因此探針對Cys顯示出高選擇性。尤其是將近紅外熒光探針應(yīng)用于細胞、組織、小鼠等生物樣品中外源性和內(nèi)源性Cys的檢測，取得了令人滿意的結(jié)果。

1.3" 谷胱甘肽的選擇性探針

GSH響應(yīng)熒光傳感器主要基于親核芳香取" 代-重排反應(yīng)，具有不穩(wěn)定取代基的探針與生物硫醇通過親核芳香取代物反應(yīng)形成硫醚。HUANG^[30]等設(shè)計并合成了一種用于谷胱甘肽特異性檢測的近紅外開啟雙光子熒光探針ST-BODIPY，通過Knoevenagel縮合將三苯胺連接到BODIPY骨架上，延長NIR區(qū)域的最大發(fā)射波長。2，4-二硝基苯磺?；―NBS）作為熒光猝滅劑和硫醇識別部分，在BODIPY的8位進行修飾。在GSH存在的情況下，探針提供了“開關(guān)”信號響應(yīng)，在719 nm中心的NIR熒光增強，量子產(chǎn)率增加到0.44，這歸因于谷胱甘肽誘導(dǎo)的芳香族親核取代反應(yīng)（芳香取代）反應(yīng)。此外，ST-BODIPY探針已成功用于監(jiān)測MCF-7細胞中外源性和內(nèi)源性的GSH。

WANG^[31]等報道了一種新型的近紅外（NIR）熒光探針BODIPY-ONs，可用于靈敏和選擇性地檢測谷胱甘肽（GSH）。以2，4-二硝基苯磺?；鶊F（DNBS）為猝滅基團的探針無熒光活性。加入谷胱甘肽后，在656 nm為中心的NIR熒光恢復(fù)明顯，量子產(chǎn)率增加到0.48，而其他缺乏硫醇的氨基酸沒有產(chǎn)生任何變化。與Cys和Hcy相比，BODIPY-ONs對GSH的反應(yīng)最高。通過滴定實驗計算出GSH的檢測限（LOD）為131 nmol·L^-1。提出了GSH誘導(dǎo)的含膦酸鹽的裂解方法，并得到了質(zhì)譜分析和HPLC分析的支持。進一步的理論計算表明，BODIPY-ONs能夠從Cys和Hcy中區(qū)分GSH的原因是一個分子間氫鍵輔助的硫解過程。此外，探針BODIPY-ONs也可用于活細胞中內(nèi)源性和外源性GSH的檢測。

1.4" 同型半胱氨酸的選擇性探針

HAN^[32]等開發(fā)了一個BODIPY熒光探針DCB，其中β位的吸電醛基作為活化基，α和α′位置的""" 2個氯原子分別作為反應(yīng)位點。DCB探針容易通過芳香族親核取代反應(yīng)機制被一側(cè)的氯原子或兩個巰基取代，這也能夠進行氨基重排反應(yīng)，這取決于""" 3種生物硫醇的不同反應(yīng)性和反應(yīng)結(jié)構(gòu)。利用這種雙位點結(jié)合特征和獨特的反應(yīng)動力學(xué)和序列，該探針能夠通過比值熒光響應(yīng)模式有效地區(qū)分Hcy、Cys和GSH。特別值得一提的是，Hcy的高選擇性和定量檢測可以在50 s內(nèi)實現(xiàn)，這是迄今為止報道的Hcy探針中反應(yīng)最快的。此外，由于其細胞毒性低，細胞通透性好，抗干擾后，探針能夠?qū)崟r成像和定量分析活神經(jīng)元的細胞內(nèi)Hcy。

2" 結(jié) 論

BODIPY熒光團具有優(yōu)異的光學(xué)特性，可以通過在BODIPY核心的不同位置引入不同的功能單元來很容易的定制。本文系統(tǒng)綜述了基于BODIPY的檢測生物硫醇的熒光探針的研究進展。BIDOPY部分的平面結(jié)構(gòu)可能通過在極性環(huán)境中的π-π堆積引起聚集，并導(dǎo)致聚集引起的猝滅（ACQ）。為了提高BODIPY探針的溶解度，經(jīng)常使用有機溶劑，這些有機溶劑會干擾生物樣品和亞細胞微環(huán)境。因此，開發(fā)具有更好溶解度和避免ACQ的BODIPY探針是未來非常需要的。事實上，在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中，設(shè)計針對生物硫醇的分化的探針仍然存在挑戰(zhàn)，特別是對于Hcy。探針檢測實際生物樣本中的生物硫醇可能會受到不同類型細胞中不同水平表達的單個生物硫醇的干擾。需要探索新的識別機制和具有更高特異性和敏感性的新探針。

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Research Progress of Thiol Fluorescent Probes based on BODIPY Dyes

LEI Yuan

（Yunnan Normal University， Kunming Yunnan 650500， China）

Abstract： Because fluorescent probes of biological thiols can better understand various physiological and pathological processes related to biological thiols， they have attracted more and more interest. Fluoroboron dipyrrole （BODIPY） fluorophores show excellent optical properties. These fluorophores can be easily customized by introducing various functional units at various positions of BODIPY core. In this paper， the development of BODIPY based fluorescent probes for the detection of biological thiols was systematically summarized， with emphasis on the priority detection of individual biological thiols.

Key words： Bipyrrometheneborn difluoride （BODIPY）; Biological thiol; Fluorescent probe