【摘要】 目的：本課題旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，對“生肌愈瘡膏”外敷治療壓力性潰瘍的機制進(jìn)行探討。方法：采用現(xiàn)代中醫(yī)藥理論與技術(shù)，以中藥為研究對象，采用DisGeNET、GeneCards、Human孟德爾基因編輯技術(shù)等技術(shù)，對其進(jìn)行深入研究，尋找其可能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用靶標(biāo)。采用Cytoscape 3.9.1軟件，建立“藥效-成分-靶點-病變”的藥效關(guān)系，利用STRING數(shù)據(jù)庫，建立“靶蛋白-效應(yīng)關(guān)系”的效應(yīng)關(guān)系，并利用DAVID數(shù)據(jù)，對“藥效關(guān)系”的信號途徑進(jìn)行富集分析。結(jié)果：經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，木犀草素（MOL000006）、毒扁豆次堿（MOL013287）、山奈酚（MOL000422）、槲皮素（MOL000098）、黃芩素（MOL002714）、漢黃芩素（MOL000173）是生肌愈瘍膏干預(yù)壓力性潰瘍的主要有效成分。生肌愈瘍膏外用可能通過調(diào)控PTGS1、PTGS2、SCN5A、AR等基因，介導(dǎo)糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、動脈粥樣硬化通路和癌癥通路等通路干預(yù)壓力性潰瘍。結(jié)論：生肌愈瘍膏可通過調(diào)控多靶點、多通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、促進(jìn)血管新生等方面促進(jìn)壓力性潰瘍創(chuàng)面的愈合。

【關(guān)鍵詞】 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) 生肌愈瘍膏 壓力性潰瘍 信號通路 作用靶點

A Network Pharmacological Study on the Mechanism of Topical Intervention of Pressure Ulcers with Shengji Yuyang Ointment/XUE Tianyin， SHAO Yufang， SUN Qing. //Medical Innovation of China， 2023， 20（26）： -174

[Abstract] Objective： The aim of this project was to investigate the mechanism of the Shengji Yuyang Ointment topical treatment of pressure ulcers by means of network pharmacology. Method： Using modern Chinese medicine theories and techniques， DisGeNET， GeneCards， and Human Mendelian gene editing techniques were used to investigate the possible pharmacological bases and targets of the Chinese medicine. Cytoscape 3.9.1 software was used to establish the pharmacodynamic relationship of \"pharmacodynam-ic-component-target-lesion\"， STRING database was used to establish the effect relationship of \"target protein-effect relationship\"， and DAVID data was used to enrich the signal pathways of \"pharmacodynamic relationship\". Result： By network topology analysis， Lignan （MOL000006）， Poisonous Lentil Hypocretin （MOL013287）， Kaempferol （MOL000422）， Quercetin （MOL000098）， and Baicalein （MOL002714）， Wogonin （MOL000173） were the main active ingredients of the Shengji Yuyang Ointment to intervene in pressure ulcers. The topical application of Shengji Yuyang Ointment may interfere with pressure ulcers by regulating PTGS1， PTGS2， SCN5A， AR and other genes and mediating AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications， atherosclerotic pathway and cancer pathway. Conclusion： Shengji Yuyang Ointment can promote the healing of pressure ulcer wounds by modulating multiple targets and pathways， such as an-ti-inflammation， antioxidation and promotion of vascular renewal.

[Key words] Network pharmacology Shengji Yuyang Ointment Pressure ulcer Signaling pathway Target of action

First-author's address： The First Clinical School of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.26.040

臥床患者由于身體長期處于平臥位且長時間無法活動，導(dǎo)致局部皮膚和/或皮下組織因受壓而持續(xù)性缺血缺氧形成的局部損傷，即壓力性潰瘍（pressure ulcer，PU）[1]。不同程度的壓力性潰瘍有不同的特點，壓力性潰瘍部位及周圍組織易出現(xiàn)缺血再灌注損傷、細(xì)菌感染，治療難度極大[2]。

壓力性潰瘍在醫(yī)院中高發(fā)。壓力性潰瘍會給患者帶來痛苦，并降低生活質(zhì)量，甚至出現(xiàn)感染從而危及生命。壓力性潰瘍采用外治為主，配合內(nèi)治，積極治療全身疾病的治則治法對不同壓力性潰瘍的證型進(jìn)行治療，均取得了明顯效果，說明中醫(yī)藥在壓力性潰瘍的治療上有著悠久的歷史和獨特的優(yōu)勢[3-4]。

生肌愈瘍膏是濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院自制外用劑[5-8]，由紫草、大黃、當(dāng)歸、地榆、側(cè)柏葉、黃芩、虎杖組成，壓力性潰瘍治療的效果已經(jīng)確定，但其作用機制尚未完全明了，本研究目的是通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測生肌愈瘍膏干預(yù)壓力性潰瘍的有效活性成分及關(guān)鍵靶點，并分析其潛在作用機制，為中醫(yī)藥治療壓力性潰瘍的領(lǐng)域提供新方向。

1 資料與方法

1.1 生肌愈瘍膏活性藥物成分篩選

運用TCMSP數(shù)據(jù)庫，對紫草、大黃、當(dāng)歸、地榆、側(cè)柏葉、黃芩、虎杖的所有成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行挖掘。以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，對收集到的成分進(jìn)行藥動力信息檢索。

1.2 生肌愈瘍膏活性化學(xué)成分靶點與壓力性潰瘍潛在靶點的獲取及收集

登陸UniProt Knowledgebase（UniProt KB），將初步得到的蛋白質(zhì)靶點轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的基因名稱。在OMIM數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫中查找數(shù)據(jù)，搜集壓力性潰瘍的潛在靶點。使用Venny 2.1.0繪制生肌愈瘍膏和壓力性潰瘍的交集靶點。

1.3 生肌愈瘍膏-壓力性潰瘍靶點核心網(wǎng)絡(luò)的篩選

使用Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值（degree）和中介中心度（betweenness centrality）為篩選條件，獲得生肌愈瘍膏干預(yù)壓力性潰瘍的關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點。

1.4 生肌愈瘍膏-壓力性潰瘍蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將1.3獲得的關(guān)鍵靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)定“物種”為人類（homo sapiens），評分分值gt;0.9進(jìn)行篩選，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將1.3獲得的關(guān)鍵靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號通路富集分析，并進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 生肌愈瘍膏活性成分分析

根據(jù)OB≥30%且DL≥0.18為條件對復(fù)方成分進(jìn)行篩選，最終確定生肌愈瘍膏中所含藥物的活性有效成分67個，結(jié)果見表1。

2.2 生肌愈瘍膏干預(yù)壓力性潰瘍的潛在作用靶點預(yù)測

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫、UniProt數(shù)據(jù)庫及靶點模型預(yù)測，匯總并去重后，共得到226個得到核心藥物的作用靶點。從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得PU靶點5 894個，利用中位數(shù)進(jìn)行篩選，結(jié)合OMIM數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索獲得的相關(guān)靶點，匯總?cè)ブ刈罱K得到2 954個壓力性潰瘍相關(guān)靶點。將生肌愈瘍膏有效成分相關(guān)的靶點和壓力性潰瘍疾病靶點取交集，獲得交集基因153個（圖1）。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.9.1軟件對生肌愈瘍膏干預(yù)壓力性潰瘍的作用靶點進(jìn)行分析，得到網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見圖2。

2.4 藥物-疾病靶點PPI

把交集靶點上傳STRING數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。導(dǎo)入Cytoscape軟件并運用cyto Hubba插件，以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值為基準(zhǔn)，獲得度值排名前10的核心靶點，并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4，篩選后木犀草素（MOL000006）、槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、毒扁豆次堿（MOL013287）、漢黃芩素（MOL000173）、黃芩素（MOL002714）、前列腺素G/H合成酶1（PTGS1）、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、雄激素受體（AR）、心臟鈉通道基因（SCN5A）等靶點度值較高。

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將獲得的交集靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析。GO注釋結(jié)果的前5個生物學(xué)功能主要為氧含量反應(yīng)、氮化合物反應(yīng)、外來事物刺激反應(yīng)、有機刺激反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)（圖5）。KEGG通路富集結(jié)果癌癥通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路與糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路等通路是主要信號通路，見圖6。

3 討論

3.1 生肌愈瘍膏治療壓力性潰瘍的主要有效成分

經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霰砻?，生肌愈瘍膏干預(yù)壓力性潰瘍的主要有效成分可能是木犀草素（MOL000006）、槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）等成分。槲皮素（Quercetin）是一種具有多種生物學(xué)活性，且藥理學(xué)作用廣泛的黃酮類化合物，它不僅能夠抗氧化及清除自由基，且在抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及免疫調(diào)節(jié)等方面起重要作用[9]。研究顯示，槲皮素可抑制LPS誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞分泌炎癥因子，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管的修復(fù)[10]。另有研究表明，槲皮素通過清除氧自由基、鰲合金屬離子、抑制ox-LDL引起的氧化損傷及提高抗氧化酶活性來維持氧化平衡表達(dá)，改善細(xì)胞膜的過氧化損傷，維持胞內(nèi)氧化平衡，促進(jìn)細(xì)胞的存活[11]。體內(nèi)過氧化物的聚集會加快細(xì)胞凋亡，損傷機體微血管發(fā)，加重創(chuàng)面[12]。因此槲皮素抗氧化作用可以為肉芽組織生長和創(chuàng)面恢復(fù)提供良好的環(huán)境。山奈酚（Kaempferol）是一種黃酮類化合物，抗炎、抗氧化作用顯著[13]。研究發(fā)現(xiàn)，核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，而山奈酚能使Nrf2的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，提高對氧化損傷的保護(hù)作用[14]?；钚匝蹩梢杂绊懴嚓P(guān)功能蛋白的合成從而加速細(xì)胞凋亡。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，山奈酚可以降低活性氧水平，對抗活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，降低細(xì)胞凋亡率，恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的活力，有助于血管的生成[15]。木犀草素（Luteolin）是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[16]。木犀草素能夠?qū)D(zhuǎn)錄激活因子3、核轉(zhuǎn)錄因子-κB和激活蛋白-1等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗炎作用，并改變炎癥中涉及的各種信號通路[17]，并且木犀草素可通過調(diào)節(jié)炎癥因子的活性，從而降低炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[18]，壓力性潰瘍的創(chuàng)面經(jīng)久不愈，可能是產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)會破壞組織完整性相關(guān)的酶，使創(chuàng)面細(xì)胞基質(zhì)和纖維連接蛋白降解[19]，證實木犀草素能夠降低炎性因子，促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織新生而加速創(chuàng)面組織修復(fù)。

3.2 生肌愈瘍膏治療壓力性潰瘍的主要作用靶點

經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，PTGS1、PTGS2、SCN5A等可能生肌愈瘍膏有效成分作用于壓力性潰瘍的核心靶點。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶（PTGS），又稱環(huán)氧合酶（COX）。COX存在兩種同工酶，即結(jié)構(gòu)型（COX-1）和誘導(dǎo)型（COX-2）[20]。COX-1為結(jié)構(gòu)型同工酶，主要表達(dá)于大多數(shù)組織和器官，如血小板、內(nèi)皮細(xì)胞，能夠調(diào)節(jié)血管張力、維持血小板正常生理功能；COX-2為可誘導(dǎo)同工酶，高表達(dá)于炎癥組織，特別是單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等一些與炎癥有密切關(guān)系的細(xì)胞上[21]。COX-1和COX-2的聯(lián)合表達(dá)在血小板活性增強、抗血小板過程中具有關(guān)鍵作用[22]。創(chuàng)面愈合與血小板的激活和生長因子的釋放具有密切的聯(lián)系，血小板能持續(xù)釋放大量創(chuàng)面需要的多種因子，可以有效刺激創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞生長增殖，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，并可以釋放一定量抗炎因子，發(fā)揮更明顯抗感染作用[23]。蔡信濤[24]通過研究發(fā)現(xiàn)，心臟鈉通道基因（SCN5A）在垂體瘤細(xì)胞（GH3）中與和血管內(nèi)皮生長因子A（vascularendothelial growth factor A，VEGFA）的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)。VEGFA參與血管生成的整個過程，在血管生成過程中，VEGFA能加速血管新生，從而為創(chuàng)面肉芽組織、細(xì)胞提供營養(yǎng)與氧氣，加快創(chuàng)面修復(fù)進(jìn)程[25]。

3.3 生肌愈瘍膏治療壓力性潰瘍的主要信號通路

KEGG通路富集結(jié)果表明，糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路為主要通路。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路與創(chuàng)面愈合過程中關(guān)鍵的炎癥反應(yīng)、干細(xì)胞、新血管生成、毛囊再生、成纖維細(xì)胞增殖有關(guān)，糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）與其受體（RAGE）結(jié)合表達(dá)能抑制Wnt/β-catenin通路，成纖維細(xì)胞和新生血管少，炎性細(xì)胞多，從而影響創(chuàng)面愈合進(jìn)程[26]。另有臨床研究證實，降低創(chuàng)面組織中AGEs及RAGE的表達(dá)水平后，創(chuàng)面組織中血管內(nèi)皮生長因子增多，中性粒細(xì)胞數(shù)目減少，創(chuàng)面愈合速度加快[27]。

本研究以生肌愈瘍膏為研究對象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對生肌愈瘍膏干預(yù)壓力性潰瘍的潛在作用靶點及作用機制進(jìn)行分析，推測生肌愈瘍膏通過木犀草素、槲皮素、山奈酚等成分發(fā)揮作用，通過前列腺素G/H合成酶1、前列腺素G/H合成酶2、心臟鈉通道基因等靶點影響糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE等信號通路進(jìn)而抗炎、抗氧化、促進(jìn)新生以促進(jìn)壓力性潰瘍的創(chuàng)面愈合。上述結(jié)果可為中醫(yī)藥治療壓力性潰瘍提供新思路，但本研究結(jié)果尚有局限，治療機制有待進(jìn)一步驗證。

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