摘要：NAC基因是僅存于植物中的一類特殊的轉錄因子，在植物響應生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究基于轉錄組測序數(shù)據(jù)分析，在海馬齒（Sesuvium portulacastrum）中共鑒定出10個NAC家族成員，對其蛋白質結構及其理化性質進行分析，結果表明：10個SpNACs的氨基酸數(shù)量在164～651之間，分子量大小在18 400.34 Da～68 678.02 Da之間，等電點分布在4.34～8.52之間，均為定位于細胞核的親水性蛋白，其中SpNAC02和SpNAC08具有跨膜結構。保守基序預測發(fā)現(xiàn)多數(shù)SpNACs中存在三個motif，但SpNAC05不含motif，SpNAC09只含motif2，SpNAC07只含motif2和motif3。聚類分析結果10個SpNACs聚類在6個亞家族。利用qRT-PCR分析表明在鹽脅迫下除SpNAC03在莖、葉不表達以外，其它9個基因均在根、莖和葉中表達。鹽生環(huán)境下（40‰ NaCl）10個NACs基因的表達均受到不同程度的抑制。以上研究豐富了植物NAC基因家族成員信息，為篩選和鑒定海馬齒抗逆基因提供參考。

關鍵詞：海馬齒；NAC；家族分析；鹽脅迫；qRT-PCR

中圖分類號：Q945.78 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）08-2305-09

Identification and Salt Stress Response Analysis on NAC Gene in

Sesuvium portulacastrum

WEI Xian-ya1， LI Wei-jin2，3， HE Yi-ming4， ZHANG Ying2，3*

（1. Chengdu Agricultural College， School of Agronomy and Horticulture， Chengdu， Sichuan Province 610000， China; 2. Lingnan

Normal University， Mangrove Rare and Endangered Species Protection and Utilization Engineering Technology Research Center，

Zhanjiang， Guangdong Province 524048， China; 3. Lingnan Normal University， Zhanjiang Key Laboratory of Mangrove Ecosystem

Protection and Restoration， Zhanjiang， Guangdong Province 524048， China; 4. Lingnan Normal University， School of Life Science

and Technology， Zhanjiang， Guangdong Province 524048， China）

Abstract：NACs belonging to plant specific transcription factor gene family，and play an important role in the response of plant to biotic and abiotic stress. In this study，a total number of 10 NAC family genes were identified based on the transcriptome sequencing data of Sesuvium portulacastrum. Protein structure and physicochemical properties analysis showed that in the 10 SpNACs，the number of amino acids ranged from 164 to 651，the molecular weight from 18400.34 Da to 68678.02 Da，and the isoelectric point from 4.34 to 8.52. All SpNACs were hydrophilic proteins localized in the nucleus;among the 10 SpNACs，only SpNAC02 and SpNAC08 had the transmembrane structures. Conservative motif prediction found out that most of SpNACs contained three motifs，but SpNAC05 contained no motif，SpNAC09 only contained the motif2，and SPNAC07 only contained the motif2 and the motif3. Phylogenetic analysis showed that all SpNACs were clustered into six subfamilies. qRT-PCR was used to analyze the expression of SpNACs under different salt stresses. The results showed that 9 genes did express in root，stem and leaf except for SpNAC03 which did not express in stem and leaf. The expression of 10 SpNACs genes was inhibited in a degree of salinity （40‰ NaCl）. These studies enriched the information of NAC gene family members in plants，and provided a reference for screening and identifying the stress-resistant genes of S. portulacastrum.

Key words：Sesuvium portulacastrum;NAC;Family analysis;Salt stress;qRT-PCR

紅樹林伴生植物海馬齒（Sesuvium portulacastrum），番杏科，海馬齒屬，多年生草本植物。在我國主要分布在福建、廣東、廣西、香港和臺灣沿海地區(qū)，具有極強的耐鹽、干旱、重金屬和其他非生物脅迫能力［1］。近年來，海馬齒研究主要集中在環(huán)境治理和生態(tài)修復方面，同時海馬齒耐鹽機制研究也受到廣泛重視。海馬齒能在鹽度600 mmol·L-1的環(huán)境下生存［2］，形成了一套較為有效的鹽適生機制。通過葉片組織的肉質化，利用葉片中的鹽收集器降低高鹽對植物造成的直接損傷［3］。同時，在一定鹽度范圍內海馬齒能通過增強超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），過氧化物酶（Peroxidase，POD），抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）酶活力，提高滲透性調節(jié)物質如可溶性糖和脯氨酸含量，來減輕鹽環(huán)境對植物機體的損傷［4］，分子研究表明海馬齒參與調控脯氨酸積累代謝中的ProC基因，ROS代謝中的APX基因以及過氧化氫代謝中的SOS1基因在較高鹽濃度環(huán)境下高表達［5-6］。近來隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，越來越多與耐鹽相關的轉錄因子被廣泛發(fā)掘，如NAC，WRKY，MYB基因家族［7］。

NAC轉錄因子是近二十年來發(fā)現(xiàn)的，植物特異存在的一類轉錄因子家族，通常NAC蛋白在其N-端含有高度同源且能夠與DNA結合的NAC結構域，包含5個保守的亞結構域，其C-端具有轉錄激活功能［8］。NAC轉錄因子廣泛響應植物非生物脅迫并參與植物的根、莖、葉、花等器官的生長發(fā)育［9］。前期研究表明，NAC轉錄因子會受到高鹽環(huán)境的誘導［10］，能夠提高轉基因植物抵抗高鹽的能力［11］。在煙草（Nicotiana tabacum）中過表達百合（Lilium pumilum）LpNAC13基因能顯著增強其耐鹽能力［12］。過表達馬鈴薯（Solanum tuberosum）StNAC1基因的煙草苗，在鹽脅迫條件下，可通過積累更少的ROS和更多的脯氨酸來提高轉基因植株的耐鹽性［13］。水稻（Oryza sativa）OsNAC3基因敲除可以降低水稻對ABA的敏感性，但鹽脅迫敏感性提高，而OsNAC3基因過表達則表現(xiàn)出相反的效果［14］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）膜結合轉錄因子ANAC40突變導致其鹽脅迫下種子萌發(fā)率升高［15］。AmNAC100和AmNAC102-2在蒙古冰草（Agropyron mongolicum）干旱脅迫中起正調控作用［16］。白羊草（Bothriochloa ischaemum）在鹽脅迫下BiNAC的表達量增加［17］。

基于已發(fā)表的鹽脅迫下海馬齒轉錄組數(shù)據(jù)［18］，本研究采用生物信息學分析方法對10個海馬齒NAC家族基因進行鑒定和理化性質分析。同時，對不同鹽濃度脅迫處理下SpNAC家族基因成員在根、莖、葉片中的表達量進行分析，旨在挖掘鹽脅迫響應的關鍵SpNAC基因為深入開展海馬齒鹽生境適應基因工程研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 SpNACs蛋白理化性質分析

基于海馬齒轉錄組信息篩選SpNAC轉錄因子信息，轉錄組詳細信息見NCBI數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）序列號為PRJNA859253。通過ExPASy ProtParam（網(wǎng)址：https：//web.expasy.org/protparam/）和Plant-mPLoc（網(wǎng)址：http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）在線軟件對SpNACs蛋白質家族的理化性質和亞細胞定位進行分析。

1.2 SpNACs蛋白結構分析

蛋白質二級結構分析通過在線軟件SOPMA（網(wǎng)址：https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html），SpNACs蛋白跨膜結構通過在線軟件TMHMM（網(wǎng)址：https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進行分析，其保守motif分析則通過MEME（網(wǎng)址：https：//meme-suite.org）在線軟件進行。

1.3 SpNACs蛋白系統(tǒng)進化樹構建

利用MEGA軟件對海馬齒和擬南芥NACs蛋白進行序列比對，擬南芥NACs蛋白數(shù)據(jù)來源于TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www. arabidopsis.org/）。

1.4 不同鹽脅迫下SpNACs基因表達分析

1.4.1 材料處理 供試材料海馬齒采自廣東省湛江市霞山區(qū)觀海長廊（110.43°E，21.22°N）。選取生長趨勢大致相同的莖段，每個莖段保留3個節(jié)4片葉，并用改良的1/2 Hoagland營養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)于方形育苗盒內（尺寸：長×寬×高為38.5 cm×28.5 cm×11.5 cm），每盒培養(yǎng)10株經(jīng)過扦插培養(yǎng)生根（每10天更換一次營養(yǎng)液），30天后用NaCl濃度為0，10‰，20‰，40‰的培養(yǎng)液連續(xù)處理4周，每個處理重復3次。

1.4.2 總RNA提取及cDNA合成 總RNA提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒，RNA完整度檢測采用瓊脂糖凝膠電泳法，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit （Perfect Real Time）的方法進行cDNA第一鏈的合成，于-20℃保存，備用。

1.4.3 SpNACs基因在根、莖、葉中的表達分析 以第一鏈cDNA為模板，利用SYBR GREEN法對10個SpNAC基因和海馬齒actin基因進行實時熒光定量PCR實驗，各設3個重復，分析SpNAC基因在海馬齒根、莖、葉中的表達變化，相對表達定量的計算方法按2-ΔΔCT法進行，引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1 SpNACs蛋白理化性質和結構分析

ExPASy ProtParam分析表明，10個SpNACs蛋白的氨基酸序列在164（SpNAC09）至621（SpNAC02）之間，分子量在18 400.34 Da（SpNAC09）至68 678.02 Da（SpNAC02）之間，等電點分布在4.34～8.52之間，其中SpNAC10的等電點最大，為8.52，SpNAC05等電點最小為4.34，且10個海馬齒NAC家族蛋白親水性均為負值，表明這10個蛋白均為親水性蛋白。通過Plant-mPLoc在線網(wǎng)站預測亞細胞定位發(fā)現(xiàn)這10個NAC均定位在細胞核上。對10個SpNACs的跨膜結構進行預測發(fā)現(xiàn)只有SpNAC02和SpNAC08具有跨膜結構，其跨膜區(qū)域分別位于氨基酸序列的589～611和531～553之間，均位于C端殘基，均包含23個氨基酸殘基。其余均沒有跨膜結構（圖1）。

2.2 SpNACs二級結構預測

利用在線軟件SOPMA對10個SpNACs蛋白進行二級結構的預測（如圖2），SpNACs二級結構包括α-螺旋，β-轉角，延伸鏈和無規(guī)卷曲（如表3），SpNACs中無規(guī)卷曲所占比例最大在53.32%（SpNAC07）～68.39%（SpNAC04）之間，β-轉角所占比例最小在2.97%（SpNAC03）～5.91%（SpNAC10）之間。

2.4 SpNACs蛋白保守基序

通過MEME在線軟件對SpNACs蛋白進行保守基序的預測，結果顯示SpNACs蛋白中存在三個的motif，其序列分別為1.GDKEWYFFSpRDRKYPNGSRTNRATRSGYWKATGKDRPI-VR，2.MKKTLVFYRGRAPKGERTBWVMHE-YRL和3.LPPGFRFHPTDEELVVHYLKRKVC-G。在海馬齒10個NAC蛋白含motif的數(shù)量不一樣，SpNAC05不含motif，SpNAC09只含motif2，SpNAC07含motif2和motif3，其余SpNACs均含三個motif。

2.3 SpNACs進化樹分析

以擬南芥NAC蛋白序列做參照，參考Hisako等人［11］的分類方法將NACs分為18個亞族，本研究中10個SpNACs分布于其中的6個亞族中。其中SpNAC01和SpNAC06屬于NAM亞族；SpNAC02和SpNAC08屬于NAC2亞族；SpNAC03屬于ATAF亞族；SpNAC04屬于ANAC011亞族；SpNAC05和SpNAC07屬于ONC003亞族；SpNAC09和SpNAC10屬于SEUN5亞族。

2.4 SpNACs基因表達分析

qRT-PCR檢測結果（圖5）表明，在鹽脅迫下10個SpNACs基因除SpNAC03在莖、葉不表達以外，其它9個基因均在根、莖和葉中表達。SpNAC03只在非鹽環(huán)境下的葉片中高表達，鹽脅迫下的根、莖、葉低表達或不表達。同時在非鹽環(huán)境下只有SpNAC03在莖中不表達，其它基因則在根、莖、葉都表達。在10‰～20‰ NaCl濃度脅迫下，海馬齒根中的基因除SpNAC03外，9個SpNACs基因均顯著上調，且為先上升后下降的趨勢。同時在葉中，SpNAC01表達量隨鹽濃度的上升顯著增加。當40‰ NaCl濃度脅迫下，10個NACs基因在根、莖、葉中的表達均下調表達。表明本研究中的SpNACs基因在較高鹽環(huán)境下可能通過抑制基因一定程度的表達來參與海馬齒的鹽脅迫響應，且需要后續(xù)進一步的驗證。

3 討論

NAC家族是以矮牽牛（Petunia hybrida）NAM（No Apical Meristem）基因［19］，擬南芥的ATAF1/2（Arabidopsis transcription activation factor ATAF）基因和CUC2（Cup-shaped cotyledon）基因的首字母縮寫命名。在擬南芥中NACs家族分為I和Ⅱ兩個類型，其中類型I包含14個亞家族，類型Ⅱ包含4個亞家族［9］。本研究中通過前期轉錄組數(shù)據(jù)共鑒定10個NACs基因，SpNAC05和SpNAC03屬于類型Ⅱ，其余8個基因屬于類型I，分屬于6個亞類。后期可以通過多組織轉錄組分析或整個基因組序列分析來豐富海馬齒NACs家簇的數(shù)量。NACs廣泛參與到植物生長發(fā)育的各階段中，但也同樣存在組織特異性，如ChNAC07基因僅在歐李（Cerasus humilis）果實中表達［20］，AsNAC2基因主要在健康白木香（Aquilaria sinensis）的根和莖中表達［21］。本研究10個海馬齒SpNACs基因中，未能發(fā)現(xiàn)特異組織表達的基因。基因SpNAC03在海馬齒莖中無論是清水對照還是鹽脅迫下幾乎都不表達。其它9個基因在海馬齒根、莖和葉中均有表達。但在葉中顯著表達的是SpNAC01和SpNAC03（CK），在根中顯著表達的是SpNAC02，SpNAC06，SpNAC07，SpNAC08，SpNAC09，SpNAC10。以上基因有偏重地參與特異組織的耐鹽分子響應中，同時根據(jù)響應基因的數(shù)量也反應出根器官在海馬齒適應鹽生境過程中的重要作用。

前期研究表明，同一亞群中的NAC基因可能有相似的功能，如抗脅迫特異性或植物特異性［22］?；騍pNAC03屬于ATAF亞家族，在擬南芥中ATAF1和ANAC055協(xié)同作用負調控其對高溫的脅迫，辣椒（Capsicum annuum）CaNAC46屬于ATAF亞家族其表達受鹽脅迫的調控［23］，在玉米（Zea mays）中ZmNAC33與ATAF1/2有較近的親緣關系，它與多種非生物脅迫相關［19］。SpNAC03在鹽脅迫下葉中的表達量下調表達，在根的表達量只有當鹽度達40‰顯著下調，說明該基因參與了海馬齒耐鹽調控，且主要是在葉中參與調控。SpNAC02和SpNAC08屬于NAC2亞家族，在低鹽環(huán)境下海馬齒的根中這兩個基因的表達顯著提高，當鹽度超過20‰的時候，表達量均受到抑制且隨著鹽度的增加呈下降趨勢。前期研究表明AtNAC2能夠有效提升落花生（Arachis hypogaea）的抗鹽能力［24］，同屬該亞家族的GmNAC06被證明在大豆（Glycine max）鹽脅迫下的一個正應激反應轉錄因子，過表達GmNAC06能減輕毛狀根中細胞膜在鹽脅迫下的損傷從而增強轉基因植株毛狀根在鹽脅迫下的生長能力［25］?；騍pNAC05和SpNAC07屬于ONAC003亞家族，在水稻中ONAC003基因過表達株系在高溫、干旱和氧脅迫下的抗性增加［26］，啟動元件分析其受高鹽調控，但鹽脅迫下的功能有待進一步驗證。海馬齒SpNAC09和SpNAC10基因同屬于SENU5亞家族，在鹽環(huán)境下，海馬齒的根、莖和葉中這兩個基因的表達量均不同程度下調。同屬SENU5亞家族的ClNAC9在過表達的轉基因擬南芥中增強了RD29A，RD26，MYB2和MYB96的表達，同時通過提高超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性，減少丙二醛積累從而提高植株的耐鹽能力［27］。

4 結論

本研究鑒定并分析了10個海馬齒NAC基因家族成員，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下SpNAC03只在葉中高表達，且在鹽脅迫下受到抑制的表達量變化幅度顯著高于其他基因。后期可對SpNAC03基因進行轉基因驗證以進一步挖掘功能。

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（責任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-02-02；修回日期：2023-03-10

基金項目：國家自然基金，荒漠植物紅砂根際促生細菌篩選及其調控紅砂抗逆性的研究（32160407）資助

作者簡介：韋獻雅（1980-），女，漢族，廣西南寧人，博士研究生，主要從事作物脫毒及種苗繁育研究，E-mail：442891531@qq.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：zhangyingred@lingnan.edu.cn