摘要：草種是草坪業(yè)的基礎(chǔ)，但我國(guó)缺乏自己培育的草坪草品種，所用草坪草種主要依賴于進(jìn)口，因此草坪草育種工作亟待加強(qiáng)。常規(guī)育種周期長(zhǎng)、效率低且難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)靶向育種，而現(xiàn)代生物技術(shù)為草坪草育種提供了新的有效途徑，其中構(gòu)建草坪草高效再生體系，加快繁殖速度，對(duì)擁有再生體系的草坪草種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化是其關(guān)鍵。本文主要綜述了近年來對(duì)部分冷季型和暖季型草坪草的再生體系研究，總結(jié)了影響再生過程的關(guān)鍵因素、存在問題等，同時(shí)對(duì)未來草坪草再生領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)行了展望，以期對(duì)今后草坪草新品種的研發(fā)、推廣和應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：草坪草；組織培養(yǎng)；再生體系；愈傷組織

中圖分類號(hào)：S688.4;Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2023）08-2241-12

Research Progress on Regeneration System of Turfgrass

MA Cheng-ze， CUI Hui-ting， HU Qian-nan， WANG Lu-yu， JIA Fang， WANG Chu，

QIAO Jia-yue， LI Yue*， SUN Yan*

（College of Grassland Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract：Grass seeds are the foundation of lawn industry，but we lack our own turfgrass varieties and the turfgrass seeds used in practice mainly rely on importation from abroad. Therefore，turfgrass breeding needs to be strengthened urgently. The conventional breeding cost a long period of time，low efficiency and is difficult to achieve precise targeted breeding. However，modern biotechnologies provide a new and effective way for turfgrass breeding，in which the key is a construction of an efficient regeneration system for turfgrass to accelerate the propagation speed，and be carried out its genetic transformation with regeneration system. This review mainly summarized the researches on the regeneration systems of some cold season and warm season turfgrasses in recent years，and focused on the key factors and existing problems affecting the regeneration process，and prospected the future development of turfgrass regeneration，with a view to provide a reference for the research，development，promotion，and application of new turfgrass varieties in the coming days.

Key words：Turfgrass;Tissue culture;Regeneration system;Callus

草坪建植是城市綠地的基礎(chǔ)，其對(duì)綠化城市、保護(hù)環(huán)境、維持生態(tài)平衡起著重要作用［1］。目前，常用的草坪草主要是禾本科（Gramineae）植物，如草地早熟禾（Poa pratensis L.）、高羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）、多年生黑麥草（Lolium perenne L.）、匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera L.）、結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）、狗牙根（Cynodon dactylon （L.） Pers.）等［2］。據(jù)了解，目前我國(guó)高質(zhì)量草地和草坪草用種主要依賴于進(jìn)口，統(tǒng)計(jì)顯示牧草種子進(jìn)口量占需求量 60% 以上，草坪草種子進(jìn)口量占需求量 90% 以上，這種情況大大制約了我國(guó)草坪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［3］。因此，選育開發(fā)我國(guó)特有的優(yōu)良草坪草品種至關(guān)重要。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，以生物技術(shù)為核心的植物品種改良方法的應(yīng)用也越來越廣。無論采用基因工程還是細(xì)胞工程創(chuàng)制作物新品種，其前提都是要建立起高效的組織培養(yǎng)再生體系，這樣才能夠大大縮短育種周期，提高育種效率，同時(shí)也能夠?yàn)榻窈蟮倪z傳轉(zhuǎn)化工作奠定基礎(chǔ)。

植物組織培養(yǎng)是指對(duì)離體的植物器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等在無菌條件下接種在含有各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及植物激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行人工培育以獲得再生的完整植株的過程，該技術(shù)能夠較好的保存植物體原本的遺傳特性［4］。植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)是來源于1902年德國(guó)植物學(xué)家Haberlandt［5］提出的植物細(xì)胞具有全能性的概念，其指的是植物的每個(gè)細(xì)胞都包含著該物種的全部遺傳信息，從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力。我國(guó)對(duì)植物組織培養(yǎng)的研究起步于20世紀(jì)50年代［6］。到目前為止，我國(guó)已經(jīng)對(duì)農(nóng)作物、園藝作物、觀賞植物等多種類型植物開展了大量組織培養(yǎng)研究并且取得了較為豐碩的成果。

植物再生是指植物組織或器官在受到傷害或脅迫后，進(jìn)行自我修復(fù)和替換（再生出各種器官）的過程［7］。廣義上講，植物再生體系也屬于植物組織培養(yǎng)，區(qū)別在于植物組織培養(yǎng)的側(cè)重點(diǎn)在于提高植物的增殖系數(shù)和繁殖效率，而植物再生體系的建立通常是為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定基礎(chǔ)。國(guó)外早在 20 世紀(jì)初就開始致力于草坪草的轉(zhuǎn)基因及育種方面的工作，最先開始是在1988年，Horn等［8］通過原生質(zhì)體再生方式首先獲得了轉(zhuǎn)基因鴨茅（Dactylis glomerata L.）植株。而我國(guó)在這方面的研究起步相對(duì)較晚，且到目前為止成熟的草坪草再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系仍屈指可數(shù)，為了加快我國(guó)草坪草育種進(jìn)程，突破我國(guó)草坪草現(xiàn)代育種工作中的技術(shù)瓶頸，并最終提升我國(guó)草坪草種自給能力，草坪草再生體系相關(guān)研究工作亟待開展。

我國(guó)草坪草組織培養(yǎng)的研究工作較農(nóng)作物稍晚，始見于20世紀(jì)末，至21世紀(jì)初相關(guān)研究工作逐漸增多。相較于其他植物而言，草坪草多為低矮的根莖型、匍匐型或叢生型植物，具有旺盛的生命力和繁殖能力，除具備種子繁殖力外，還具備極強(qiáng)的無性繁殖能力。絕大多數(shù)的草坪草為草本植物，質(zhì)地柔軟，與木本植物相比，草本植物外植體的木質(zhì)化程度相對(duì)較低，在組織培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象相對(duì)不易出現(xiàn)［9］。但在具體研究中，褐化和玻璃化現(xiàn)象仍然普遍存在。另外，由于草坪草種子等器官相對(duì)較小，且一般具有較強(qiáng)的表面張力，在進(jìn)行組織培養(yǎng)過程中，對(duì)于外植體的取材和消毒工作往往較為繁瑣。草坪草的這些特點(diǎn)對(duì)其再生體系的建立更增加了不確定性。

本文綜述了近年來幾種常見草坪草的組培再生體系研究，并對(duì)其外植體類型及再生方式等進(jìn)行了整合歸類，同時(shí)對(duì)再生過程中的影響因素、存在問題等進(jìn)行了總結(jié)，并對(duì)草坪草再生體系的構(gòu)建提出了建議和展望，以期為后續(xù)草坪草的再生及遺傳轉(zhuǎn)化工作提供理論參考依據(jù)。

1 再生體系建立的途徑

20世紀(jì)70年代以來，科研工作者對(duì)植物再生體系的研究做了大量的工作。1975年，Ahloowalia［10］建立了冷季型草坪草多年生黑麥草的再生體系，是草坪草再生體系構(gòu)建的早期研究。1980年，Dale［11］用一年生黑麥草（Lolium multiflorum Lam.）的未成熟胚建立植株再生體系。自此以后，許多研究者對(duì)草坪草進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，對(duì)早熟禾屬（Poa L.）、黑麥草屬（Lolium L.）、結(jié)縷草屬（Zoysia Willd.）和翦股穎屬（Agrostis L.）等的一些種建立了較為完善的植株再生體系。之后許多研究工作者對(duì)草坪草組織培養(yǎng)進(jìn)行不斷研究，相繼建立了一系列草坪草的植株再生體系。本文表1對(duì)部分常見已建立再生體系草坪草的外植體種類與再生方式進(jìn)行了比較。植物組織培養(yǎng)方式主要包括胚性愈傷組織培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)以及花藥離體培養(yǎng)等［12］。不同再生途徑的優(yōu)缺點(diǎn)及影響因素等不同，表2對(duì)不同再生方式在這些方面的特點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)。

1.1 胚性愈傷組織培養(yǎng)

胚性愈傷組織培養(yǎng)是指將母體植物上某一部分切下形成外植體，接種到無菌培養(yǎng)基上進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、生長(zhǎng)與發(fā)育，是最為常見的草坪草再生方法。通常植物組織均能被誘導(dǎo)形成愈傷組織，由外植體形成愈傷組織也就標(biāo)志著植物組織培養(yǎng)的開始。對(duì)于草坪草這種絕大多數(shù)為單子葉的植物而言，選用胚性愈傷組織培養(yǎng)的途徑是最為理想的，因?yàn)閱巫尤~植物懸浮系的建立以及原生質(zhì)體的再生都較為困難，而由器官直接分化再生植株的難度更大，且草坪草的穎花微小，在穗上進(jìn)行花粉管導(dǎo)入和微注射幾乎難以實(shí)現(xiàn)［67］。對(duì)于胚性愈傷組織培養(yǎng)還有一個(gè)重要的環(huán)節(jié)就是繼代培養(yǎng)，待外植體長(zhǎng)出突起狀愈傷組織后，將其剝下轉(zhuǎn)移到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，由于愈傷組織在生長(zhǎng)過程中會(huì)不斷消耗誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并積累代謝產(chǎn)物，因此每隔一定時(shí)間就要更換新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷組織通常培養(yǎng)約2周左右就需要繼代一次，繼代次數(shù)一般不超過三次。較早的關(guān)于草坪草胚性愈傷組織培養(yǎng)的研究報(bào)道是在1984年Ahn等［68-69］對(duì)狗牙根的研究，并于1987年以未成熟花序?yàn)橥庵搀w，成功誘導(dǎo)出愈傷組織并再生出新的植株。

1.2 原生質(zhì)體培養(yǎng)

原生質(zhì)體是指脫去細(xì)胞壁的“裸露細(xì)胞”，具有細(xì)胞全能性，將其在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，最終會(huì)得到新的再生植株［70-71］。對(duì)于禾本科植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)，首次報(bào)道是在上世紀(jì)80年代。1980年，Vasil等［72］探索出了雜交狼尾草（Pennisetum americanum × Pennisetum purpureum）懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體的植株再生體系。對(duì)于草坪草而言，早期的研究是在1993年，Nielsen等［73］建立了草地早熟禾的原生質(zhì)體培養(yǎng)體系。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于草坪草的原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究還相對(duì)較少。

對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)而言，原生質(zhì)體分離的材料及其生長(zhǎng)狀態(tài)是至關(guān)重要的影響因素。植物的根、莖、葉、下胚軸、愈傷組織以及懸浮細(xì)胞等都可以作為原生質(zhì)體的分離材料，并且只有處在較高分化水平狀態(tài)下的組織或器官才能夠獲得高活力和高產(chǎn)的原生質(zhì)體［74］。其中，最早應(yīng)用的原生質(zhì)體分離材料是懸浮細(xì)胞，之后隨著原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善，愈傷組織也逐漸成為較常用的分離材料，1996年，Inokuma等［75］以成熟種子誘導(dǎo)出結(jié)縷草胚性愈傷組織，之后將分離出的原生質(zhì)體放到培養(yǎng)基中培養(yǎng)從而獲得再生植株。對(duì)于愈傷組織而言，應(yīng)選擇淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織，并且選用胚性愈傷組織作為原生質(zhì)體分離材料，具有材料易獲取，培養(yǎng)時(shí)間較短，胚性愈傷組織分裂和分化能力旺盛等優(yōu)點(diǎn)。另外，由于葉肉細(xì)胞較易制備并且其遺傳背景相對(duì)統(tǒng)一，因此也是分離原生質(zhì)體較好的材料。

1.3 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)通常是指將來自胚性愈傷組織的細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式。最早的關(guān)于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的研究只是得到了白化苗，對(duì)于正常植株的再生報(bào)道最早見于1989年，Zaghmout等［76］對(duì)紫羊茅（Festuca rubra L.）的懸浮培養(yǎng)物培養(yǎng)后經(jīng)體細(xì)胞發(fā)生途徑得到再生植株。

外植體的選擇對(duì)于植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)具有重要影響，應(yīng)選擇未成熟的且具有較強(qiáng)分生能力的組織，對(duì)于禾本科植物而言常用的外植體有未成熟的胚、種子、幼穗等。另外，愈傷組織的接種密度也是一個(gè)重要的影響因素。劉思妤等［77］指出，起始接種密度必須達(dá)到一定的有效密度才能夠維持細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。接種密度過高會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中養(yǎng)分加速消耗，使細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育受限，并且需要頻繁更換培養(yǎng)基造成人力物力的浪費(fèi)；接種密度過低則容易造成懸浮細(xì)胞褐化甚至死亡。目前已有越來越多的植物建立了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，該培養(yǎng)方式具有細(xì)胞分散性、均一性好、生長(zhǎng)速度快且易于控制等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域，但該方法的一個(gè)不足之處就是容易產(chǎn)生遺傳變異及胚胎發(fā)生能力的下降，這也是目前單子葉植物在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方面存在的主要問題之一。

1.4 花藥離體培養(yǎng)

花藥離體培養(yǎng)是一種獲得單倍體植株的主要方法，是指通過培養(yǎng)使小孢子細(xì)胞離開正常發(fā)育途徑而分化成為單倍體植株。1985年，Kasperbauer等［78］發(fā)現(xiàn)利用高羊茅單倍體和純合二倍體培育新品種能夠縮短育種進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中，花藥只有在特定時(shí)期才會(huì)較為敏感的響應(yīng)外界刺激?；ㄋ庪x體培養(yǎng)最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠縮短育種年限，但同時(shí)也存在一些問題，如愈傷組織分化成苗的概率低，容易產(chǎn)生大量白化苗等。

2 影響再生過程的因素

植物再生過程中的影響因素是至關(guān)重要的，其直接決定了植株再生的成功與否。本文針對(duì)幾種常見且重要的影響因素進(jìn)行了詳細(xì)的討論，具體闡述如下。

2.1 外植體的選擇

植物組織培養(yǎng)過程中外植體的選取既是基礎(chǔ)環(huán)節(jié)也是能否培育出合格幼苗的核心步驟［79］。不同的外植體對(duì)再生也有一定的影響。在草坪草的組織培養(yǎng)研究中，多數(shù)是以種子作為外植體的，另外還有幼穗、莖尖等也可作為外植體材料，但以幼穗等作為外植體存在的主要問題是受季節(jié)影響較大且取材難度也相對(duì)較大，而利用種子作為外植體則不受季節(jié)限制，易取材并且受污染幾率較小。另外，研究表明處于幼體發(fā)育階段的外植體比成年外植體具有更高的再生性和全能性［80］。如朱根發(fā)等［15］發(fā)現(xiàn)幼穗是草地早熟禾再生培養(yǎng)的最佳外植體。表1中列舉了部分草坪草再生體系所選用的外植體的類型。

2.2 基因型的選擇

研究表明，植物組織培養(yǎng)存在很強(qiáng)的物種依賴性以及基因型特異性［81］。因此，不同草坪草種或同一草坪草種中的不同品種之間由于內(nèi)源激素含量以及體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力不同等因素，導(dǎo)致其愈傷誘導(dǎo)能力有所差異。

陳陽等［82］通過對(duì)4個(gè)草地早熟禾品種的再生研究發(fā)現(xiàn)，在相同的培養(yǎng)基條件下，4個(gè)品種的愈傷誘導(dǎo)情況不同。支大英等［83］通過研究8個(gè)不同高羊茅品種的組培再生發(fā)現(xiàn)，8個(gè)品種在相同的分化培養(yǎng)基中的分化情況存在差異。不僅如此，類似的研究結(jié)果在小麥（Triticum aestivum L.）及高粱（Sorghum bicolor L.）等作物中也被發(fā)現(xiàn)［84-85］。結(jié)合表2并查閱大量文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，無論哪種再生途徑，基因型對(duì)再生結(jié)果的影響都是至關(guān)重要的。

2.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)過程中必不可少的一部分，它能夠?yàn)橹参锿庵搀w愈傷的誘導(dǎo)、分化及生根等提供多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而使其完成再生過程。常見的培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基以及WPM培養(yǎng)基等，其都能夠顯著影響組織培養(yǎng)過程中植物的再生能力［81］。

MS培養(yǎng)基最早是由Murashige和Skoog［86］于1962年為培養(yǎng)煙草材料而設(shè)計(jì)的。其含有的無機(jī)鹽濃度較高，尤其是銨鹽和硝酸鹽的含量高，能夠使愈傷組織較快生長(zhǎng)，但MS培養(yǎng)基不適合生長(zhǎng)緩慢、對(duì)無機(jī)鹽要求比較低的植物，尤其不適合因銨鹽濃度過高而引發(fā)毒害的植物組織培養(yǎng)。在對(duì)草坪草的相關(guān)研究中，趙俊俠等［59］通過研究結(jié)縷草的再生體系發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織分化階段，MS培養(yǎng)基的效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于NB培養(yǎng)基。除此以外，在培養(yǎng)基中添加其他成分，如甘露醇、金屬離子等也會(huì)影響外植體的再生能力［87］。

2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇

植物的體外再生依賴于外源激素的添加和在組織培養(yǎng)過程中對(duì)這些激素的反應(yīng)［88］。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（Plant growth regulators，PGRs），特別是生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等，在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生中起著重要作用［89］。2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）是一種廣泛應(yīng)用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，一般而言低濃度2，4-D能夠促進(jìn)胚性愈傷組織形成，而高濃度則抑制胚性愈傷形成，對(duì)于大多數(shù)禾本科植物而言，2 mg·L-1的2，4-D是誘導(dǎo)胚性愈傷組織形成的最佳使用濃度［90-91］。細(xì)胞分裂素也是組織培養(yǎng)中常用的一種激素，它不僅能夠單獨(dú)誘導(dǎo)不定芽的分化，還可以與生長(zhǎng)素協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞的增殖［92］。在草坪草的研究中，吳艷歌等［61］研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的細(xì)胞分裂素不僅顯著促進(jìn)溝葉結(jié)縷草愈傷組織的生長(zhǎng)和分化，也明顯影響抗氧化酶活性，從而有助于提高胚性愈傷組織的再生能力。吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）常用于生根培養(yǎng)階段，郭伶娜等［93］研究發(fā)現(xiàn)加入吲哚丁酸（Indole-3-butyric acid，IBA）或萘乙酸（1-naphthylacetic-acid，NAA）提高了高羊茅的生根率，其中IBA的促進(jìn)效果好于NAA。除此以外，近年來對(duì)于在非生物脅迫下如何提高再生效率也有了相關(guān)報(bào)道：在5%～15% PEG-6000的水分脅迫下，添加0.05～0.20 mmol·L-1的褪黑素（Melatonin，MEL）或0.05～0.10 μmol·L-1表油菜素內(nèi)酯（Epibrassinolide，EBL）對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生能力具有顯著的提升作用［94］。

2.5 不同的外植體處理方式

2.5.1 去除部分胚乳 植物外植體在進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，可能由于沒有傷口或其他原因?qū)е抡T導(dǎo)產(chǎn)生愈傷的速度較慢，因此，可以通過人為的物理或化學(xué)手段使其加快愈傷的誘導(dǎo)。較為常用的方法就是切除種子的部分胚乳，這一方法有助于愈傷組織生長(zhǎng)的原因可能是切除部分胚乳后，減弱了種子內(nèi)源激素對(duì)外施2，4-D效果的影響，另外就是產(chǎn)生了傷口。Bai等［95］在以高羊茅成熟種子作為外植體時(shí)，認(rèn)為對(duì)種子進(jìn)行切割可以提高愈傷組織的誘導(dǎo)率和再生率。姜倩倩［19］在對(duì)多年生黑麥草種子橫切后放入培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的誘導(dǎo)率增加。

2.5.2 浸泡處理 陳智勇等［13］研究發(fā)現(xiàn)，將草地早熟禾種子浸泡于濃鹽酸中1～2分鐘，后消毒接種于MS培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)較對(duì)照組相比，經(jīng)濃鹽酸浸泡的種子出愈率由39.29% 提高到58.1%，出愈時(shí)間縮短了約15 d。其原因可能是濃鹽酸浸種提高了種子活力，同時(shí)使種皮變軟，從而使外植體更加容易被誘導(dǎo)形成愈傷組織。除用濃鹽酸浸種外，代小梅等［96］研究了無菌水浸種對(duì)多年生黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，浸泡48 h處理有利于種子愈傷組織誘導(dǎo)，但隨著浸泡時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸下降，且出愈時(shí)間推遲。

3 存在問題及解決方法

3.1 有效愈傷產(chǎn)量低

有效愈傷產(chǎn)量低的問題主要是由組織培養(yǎng)過程中褐化、玻璃化以及菌類污染所造成，其不僅降低了有效愈傷的產(chǎn)量，甚至還會(huì)導(dǎo)致外植體材料的死亡，進(jìn)而直接決定了植物組織培養(yǎng)的成功與否，對(duì)植物的規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用產(chǎn)生了很大影響。

3.1.1 褐化現(xiàn)象 褐化現(xiàn)象是指在植物組織培養(yǎng)過程中，由于外植體自身分泌出的酚類化合物導(dǎo)致外植體發(fā)生褐變褐化的現(xiàn)象［97］。研究表明褐化現(xiàn)象主要分為酶促褐化和非酶促褐化兩類，酶促褐化是指細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或遭破壞時(shí)，氧化酶和底物結(jié)合后，在氧化作用下生成醌類物質(zhì)，使培養(yǎng)基和外植體褐變，進(jìn)而影響植物組織培養(yǎng)物生長(zhǎng)和分化甚至死亡；非酶促褐化是由于細(xì)胞受脅迫條件或其他不利條件影響（如高溫等）所造成的細(xì)胞死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡而導(dǎo)致的褐變，未涉及到酚類物質(zhì)的產(chǎn)生［98］。

對(duì)于解決褐化問題的方法，主要有以下幾點(diǎn)。

①選擇幼嫩部位（木質(zhì)素含量低）作為外植體，取材應(yīng)盡量在植物休眠期或生長(zhǎng)緩慢的季節(jié)，如早春或深秋。

②由于光照會(huì)誘導(dǎo)植物組織內(nèi)部酚類氧化酶活性，因此培養(yǎng)初期應(yīng)在黑暗條件下進(jìn)行，同時(shí)培養(yǎng)溫度不宜過高。

③可以適當(dāng)增加培養(yǎng)基中瓊脂用量，降低無機(jī)鹽濃度。

④適當(dāng)添加抗褐化劑。對(duì)于外源添加物緩解褐化的研究已有報(bào)道，如Akasaka-Kennedy等［99］通過在油菜（Brassica napus L.）葉片組織培養(yǎng)基中加入硝酸銀（Silver nitrate）發(fā)現(xiàn)，硝酸銀不僅能夠防止褐化的產(chǎn)生，還能夠通過抑制乙烯（Ethylene，ET）的合成從而促進(jìn)葉芽的形成。在草坪草中也有相關(guān)報(bào)道，如代小梅等［96］研究表明，在愈傷組織的繼代培養(yǎng)中，對(duì)愈傷組織褐化抑制效果較好的檸檬酸（Citric acid，CA）濃度是2 mg· L-1，培養(yǎng)2周的褐化率為15%，而隨檸檬酸濃度升高，褐化率逐漸增加，而未添加檸檬酸的愈傷褐化率為50%。錢永強(qiáng)［100］研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl pyrrolidone，PVP）及抗壞血酸（Vitamin C，VC）濃度為200 mg·L-1時(shí)，可延遲野牛草愈傷組織褐化時(shí)間，并且縮短繼代周期至5 d從而有效防止愈傷組織褐化。除此之外，林輝鋒等［101］研究表明，在組織培養(yǎng)過程中，通過不同的培養(yǎng)方式或固態(tài)培養(yǎng)添加適量的活性炭（Active carbon，AC）也可以有效抑制褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生。

⑤外植體預(yù)處理。Cai等［102］研究發(fā)現(xiàn)，將切除的外植體用氯化鈉（NaCl）溶液浸泡預(yù)處理，能夠有效抑制芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）組織褐變。

3.1.2 玻璃化現(xiàn)象 玻璃化現(xiàn)象是指在植物組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的一種形態(tài)和生理紊亂，由于水分?jǐn)z入過多，導(dǎo)致葉片呈半透明、腫脹、卷曲、易碎的狀態(tài)，多數(shù)發(fā)生在植物莖尖培養(yǎng)和離體快繁中［103］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已有200多種植物在組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象，其中約150種玻璃化現(xiàn)象較為嚴(yán)重［104］。玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因包括內(nèi)在及外在因素，外因主要有外植體的選擇、光照、溫度及培養(yǎng)基的成分等，內(nèi)因主要就是外植體自身相關(guān)酶的活性，如Tian等［105］通過對(duì)大蒜（Allium sativum L.）玻璃化研究發(fā)現(xiàn)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和再生多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）均可誘導(dǎo)植物內(nèi)源性活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，因此NADPH氧化酶的激活可能在玻璃化過程中起到了關(guān)鍵作用。另一個(gè)重要因素就是玻璃化形成基因的表達(dá)調(diào)控，Bakir等［106］通過對(duì)桃（Amygdalus persica L.）的玻璃化葉片和正常狀態(tài)葉片分別進(jìn)行RNA測(cè)序（RNA-Seq）發(fā)現(xiàn)，兩者之間有超過300個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)發(fā)生了改變。

解決玻璃化現(xiàn)象的措施主要有以下幾點(diǎn)。

①外植體盡量不要選擇分化程度過低的組織。

②適宜的光照及溫度。通常適宜的培養(yǎng)溫度為（25±3）℃。

③加強(qiáng)通風(fēng)。由于組織培養(yǎng)需要無菌環(huán)境，因此常將其放置在空間有限的密閉培養(yǎng)皿等容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，從而容易導(dǎo)致空氣流通性差及乙烯等有害物質(zhì)的積累，進(jìn)而導(dǎo)致玻璃化現(xiàn)象的產(chǎn)生［107］。

④改善培養(yǎng)基成分。研究表明，高濃度的細(xì)胞分裂素可以通過誘導(dǎo)乙烯的合成積累從而使組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，因此應(yīng)當(dāng)適當(dāng)降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素（Cytokinin，CTK）的濃度［108］。有研究發(fā)現(xiàn)［109］，在培養(yǎng)基中添加間苯三酚（Phloroglucinol），可以增強(qiáng)植物的木質(zhì)化過程從而有效地控制玻璃化。

3.1.3 菌類污染 菌類污染是指在植物組織培養(yǎng)過程中，由于外植體本身以及外界或人為操作因素造成的細(xì)菌、真菌等微生物污染。菌類污染在一定程度上嚴(yán)重阻礙了植物組織培養(yǎng)的進(jìn)程，不利于植物新品種的選育開發(fā)和應(yīng)用，對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展造成了直接影響，其次菌類污染還導(dǎo)致人力物力等資源的浪費(fèi)，因此，如何有效降低植物組織培養(yǎng)過程中的菌類污染率就顯得尤為重要。

降低菌類污染的主要措施有以下幾點(diǎn)。

①外植體取材。通常來說，植物生長(zhǎng)環(huán)境越復(fù)雜其帶菌就越多，因此可以將植物在室內(nèi)種植（如溫室或水培）并取材；若室外取材，取材時(shí)間應(yīng)在晴朗的中午，同時(shí)避免在高溫多雨季節(jié)取材，外植體應(yīng)選取幼嫩部位。另外，不同的外植體所需要的滅菌方式以及滅菌時(shí)間等存在差異，需具體分析。

②組培環(huán)境消毒。需要定期對(duì)組培間以及超凈工作臺(tái)進(jìn)行消毒，同時(shí)在組織培養(yǎng)試驗(yàn)前后都要進(jìn)行紫外殺菌，同時(shí)試驗(yàn)人員也應(yīng)規(guī)范操作，避免人為因素造成的污染。

③抑菌劑。在培養(yǎng)基中加入一定的抗生素或化學(xué)藥物也能夠起到一定的抑菌作用，如白一葦?shù)龋?10］研究發(fā)現(xiàn)按一定比例在培養(yǎng)基中加入頭孢霉素（Cephalosporin）、百菌清（Chlorothalonil）、代森錳鋅（Mancozeb）具有較為高效的抑菌效果；Li等［111］研究發(fā)現(xiàn)在MS培養(yǎng)基中加入10 μg·mL-1卡那霉素（Kanamycin）、5 μg· L-1氯霉素（Chloramphenicol）和0.015 625% 山梨酸鉀（Potassium sorbate）可有效防止微生物污染。

④利用植物不同部位提取物作為抑菌劑是一種較為新穎的方法，如Septiani等［112］研究表明，積雪草（Centella asiatica （L.） Urb）葉提取物能夠有效抑制馬鈴薯組織培養(yǎng)過程中菌類的產(chǎn)生。

3.2 再生體系不穩(wěn)定

組培再生體系不穩(wěn)定是當(dāng)前草坪草組培再生體系研發(fā)過程中存在的另一個(gè)主要問題。組培再生過程需要比較完善的環(huán)境控制系統(tǒng)，涉及到的試劑較多，個(gè)別環(huán)節(jié)還需要一定的技術(shù)手法和操作人員的主觀判斷，因此整個(gè)組培再生過程存在一定的不確定性。產(chǎn)生該問題的主要原因包括但不限于以下幾個(gè)方面。

3.2.1 環(huán)境控制不嚴(yán)格，培養(yǎng)條件不穩(wěn)定 光照、溫度乃至濕度的改變都會(huì)對(duì)再生體系造成影響，穩(wěn)定的再生體系需要較為穩(wěn)定的環(huán)境控制系統(tǒng)。另外，實(shí)驗(yàn)試劑的批次、生產(chǎn)廠家不同，純度也不同，對(duì)再生體系也會(huì)產(chǎn)生影響。比如消毒試劑由于儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)，有效物質(zhì)揮發(fā)，或生產(chǎn)廠家不同，導(dǎo)致濃度發(fā)生變化，消毒效果不一致，就會(huì)造成外植體生理狀態(tài)出現(xiàn)差異，進(jìn)而影響整個(gè)再生過程。因此，可以從加強(qiáng)環(huán)境控制設(shè)施建設(shè)、嚴(yán)格控制試劑的選用等方面提高再生體系穩(wěn)定性。

3.2.2 外植體的狀態(tài)不統(tǒng)一 外植體是再生過程的起始環(huán)節(jié)，外植體狀態(tài)的一致對(duì)再生體系的穩(wěn)定具有決定性影響。在獲得理想數(shù)量再生植株的過程中，一般需要重復(fù)多次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)所使用的外植體狀態(tài)不可能完全一致，組織細(xì)胞重編程的過程也不相同，這也是導(dǎo)致再生體系不穩(wěn)定的因素之一。解決該問題需要在育苗過程、取樣時(shí)間、取樣部位等細(xì)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格控制，以盡量確保初始材料的穩(wěn)定一致。

3.2.3 實(shí)驗(yàn)人員操作技術(shù)手法差異大 在試劑配制、外植體前處理、繼代轉(zhuǎn)移等過程中，人員操作和主觀判斷的差異也是影響組培再生體系的重要因素。比如在切割葉片等組織的過程中，操作人員的熟練度不同，葉片傷口切面的完整度就會(huì)不同，組織對(duì)傷口的響應(yīng)差異就會(huì)影響組織再生過程，進(jìn)而造成出愈率的差異。針對(duì)這一點(diǎn)可以加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)人員培訓(xùn)以及雇用專門人員負(fù)責(zé)相關(guān)工作，從而盡量避免因操作差異、主觀判斷等不穩(wěn)定因素所導(dǎo)致的問題。

4 結(jié)論與展望

2021年我國(guó)發(fā)布了若干種業(yè)振興相關(guān)政策，旨在解決我國(guó)種業(yè)發(fā)展過程中原創(chuàng)性種質(zhì)資源缺乏的問題，這其中就包括牧草及草坪草種質(zhì)資源。有調(diào)查顯示，目前我國(guó)草地草坪用種主要依賴進(jìn)口，造成這一現(xiàn)狀的主要原因有傳統(tǒng)草坪草品種選育周期長(zhǎng)，同時(shí)現(xiàn)代生物技術(shù)育種又普遍受到再生體系不成熟等瓶頸問題所限制。因此，提升草坪草再生效率和遺傳轉(zhuǎn)化率，建立一套完善且高效的草坪草種子生產(chǎn)體系，才能從真正意義上朝著種質(zhì)資源國(guó)有化、自主化方向前進(jìn)，從而解決草坪草種的“卡脖子”問題，推動(dòng)草坪草產(chǎn)業(yè)更好的發(fā)展。綜合近年來多種草坪草等植物再生體系研究來看，制約草坪草愈傷再生的主要問題是褐化和玻璃化現(xiàn)象。愈傷組織褐化和玻璃化的根本原因是由于外部或內(nèi)部的條件限制，使愈傷組織的生理狀態(tài)出現(xiàn)異常，無法正常分化。為了解決這兩個(gè)問題應(yīng)分別從優(yōu)化內(nèi)部自身?xiàng)l件（如外植體的選擇、基因型的選擇、以及利用形態(tài)發(fā)生因子等）和外部環(huán)境條件（如培養(yǎng)基成分、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)條件等）兩方面入手開展研究。

①外植體的選擇。不同外植體的再生能力不同，因此選擇合適的外植體是建立組織培養(yǎng)再生體系的重要步驟。綜合來看，對(duì)于能夠產(chǎn)生種子的草坪草而言，采用幼穗為外植體并成功再生的研究較多，但由于取材受季節(jié)時(shí)間的限制難以大規(guī)模進(jìn)行。種子具有易于保存和操作不受時(shí)間限制的優(yōu)勢(shì)，且種子產(chǎn)生的幼芽細(xì)胞分化能力強(qiáng)于葉片，研究人員將更傾向于選擇種子作為外植體來構(gòu)建草坪草再生繁殖體系。

②基因型的選擇?，F(xiàn)有研究表明，不同物種的遺傳再生體系普遍存在基因型依賴的現(xiàn)象，因此篩選再生能力強(qiáng)的基因型，對(duì)成功建立遺傳再生體系也很重要。建立再生體系的初期，選擇表型性狀差異較大的不同基因型同時(shí)進(jìn)行組織培養(yǎng)，將有利于提升再生體系構(gòu)建的效率。

③形態(tài)發(fā)生因子。最近已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，利用形態(tài)發(fā)生因子突破外植體和基因型甚至是物種的限制，來構(gòu)建遺傳再生體系［113］。這些形態(tài)發(fā)生因子包括WUSCHEL （WUS） 蛋白和BABY BOOM （BBM） 蛋白等。目前這些基因僅在玉米、小麥、大麥、楊樹等物種中成功應(yīng)用［114-116］，在草坪草遺傳再生方面還未見報(bào)道，未來有望依賴此類形態(tài)發(fā)生因子提高頑拗型草坪草的再生轉(zhuǎn)化效率。

④培養(yǎng)基的成分。從文獻(xiàn)來看，MS培養(yǎng)基是應(yīng)用十分廣泛的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，一般能夠滿足大部分物種的營(yíng)養(yǎng)需求。對(duì)于再生體系尚未建立的物種，可以同時(shí)采用2～3種常見的培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)，從中篩選出合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

⑤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。通過綜合分析比較以往的研究，結(jié)果表明生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素以及二者之間的配比是決定細(xì)胞脫分化和再分化的重要基礎(chǔ)。因此，在構(gòu)建再生體系時(shí)不僅要考慮激素的獨(dú)立用量，還應(yīng)考慮不同激素之間的配比。同時(shí)，不同物種對(duì)激素種類也具有選擇依賴性，再生效果不理想時(shí)可考慮更換其他激素。

另外，對(duì)于外界環(huán)境條件，可從培養(yǎng)基質(zhì)、容器、設(shè)施環(huán)境以及添加活性炭等方面加以優(yōu)化。在今后應(yīng)當(dāng)逐步建立一套系統(tǒng)化的草坪草再生研究體系，推進(jìn)組培苗的產(chǎn)業(yè)化，為今后草坪草優(yōu)良品種的培育奠定基礎(chǔ)。

由于我國(guó)草坪草種質(zhì)資源相對(duì)豐富，物種齊全，但用于草坪草育種的資金投入和從事草坪草育種的科研人員有限。因此，只能對(duì)部分草坪草種的再生體系進(jìn)行優(yōu)先建立，進(jìn)而引領(lǐng)草坪草育種領(lǐng)域研究。首先，當(dāng)前應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)草坪草種應(yīng)優(yōu)先建立再生體系。傳統(tǒng)草坪草種種植面積大，應(yīng)用廣泛，優(yōu)先建立再生體系可進(jìn)一步促進(jìn)傳統(tǒng)草坪草種的育種進(jìn)程，有利于創(chuàng)造更多經(jīng)濟(jì)生態(tài)效益。其次，具有較大應(yīng)用價(jià)值和潛力的新興草坪草種應(yīng)優(yōu)先建立再生體系。隨著學(xué)科發(fā)展和人類社會(huì)需求的轉(zhuǎn)變，一些具有優(yōu)良性狀的草坪草種正在嶄露頭角。比如抗逆性強(qiáng)的野牛草、苔草等草坪草，具有非常強(qiáng)大的耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠等特性，十分適合像我國(guó)這樣水資源匱乏的國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行利用。優(yōu)先建立再生體系可加快其繁育進(jìn)程，節(jié)約研發(fā)的時(shí)間成本，對(duì)于優(yōu)先搶占市場(chǎng)，促進(jìn)草坪草種國(guó)產(chǎn)化進(jìn)程有重要意義。再次，瀕危、資源稀缺草種應(yīng)優(yōu)先建立再生體系。對(duì)于瀕危、稀缺草坪草種質(zhì)資源，可利用再生體系促進(jìn)資源的擴(kuò)繁，避免滅絕，故應(yīng)優(yōu)先開展再生體系研究。

總之，只有將草坪產(chǎn)業(yè)重視起來，構(gòu)建高效的草坪草再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系，加快繁殖速度，培育優(yōu)良性狀的草坪草品種，才能不斷推動(dòng)草坪草產(chǎn)業(yè)自主化、一體化發(fā)展，從而更好更快的完善城鄉(xiāng)綠化建設(shè)，不斷滿足人們對(duì)環(huán)境和生活質(zhì)量的要求。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）

收稿日期：2022-12-30；修回日期：2023-03-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（32271763）資助

作者簡(jiǎn)介：馬承澤（1997-），男，漢族，山東濟(jì)南人，博士研究生，主要從事草坪科學(xué)與管理研究，E-mail：mczturf@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：liyue2020@cau.edu.cn;02008@cau.edu.cn