王志凌 郭源源 張浩 傅德皓

骨是一個動態(tài)器官，通過不斷的骨構(gòu)塑和骨重建來維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能[1-2]。在骨重建過程中，成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收是緊密耦合的動態(tài)平衡過程，可以保證骨的強度和骨礦物質(zhì)穩(wěn)定[3]。干擾成骨細胞和破骨細胞的活性和功能，可以導(dǎo)致這種平衡遭到破壞，可能導(dǎo)致骨丟失[2]。造成骨丟失的原因往往與性別、年齡、生活習(xí)慣及影響骨代謝的疾病或藥物有關(guān)。正常情況下，機體所產(chǎn)生的生理性炎癥屬于機體自我防御機制，可以促進骨愈合，而持續(xù)的炎癥刺激可以通過多種途徑對成骨細胞、破骨細胞的生成及功能產(chǎn)生重要影響，造成炎癥性骨丟失[4]。筆者總結(jié)了誘導(dǎo)炎癥性骨丟失的主要促炎細胞因子及其相關(guān)分子生物學(xué)機制，并介紹了基于骨免疫學(xué)改善炎癥性骨丟失的治療方式。

一、炎癥性骨丟失

炎癥是由感染性或非感染性致病因素引起的一種機體防御和損傷修復(fù)的反應(yīng)，免疫細胞在對抗炎癥中起著關(guān)鍵作用[5]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus，SLE)、強直性脊柱炎 (ankylosing spondylitis，AS)、炎癥性腸病 (inflammatory bowel disease，IBD) 及牙周炎等慢性炎癥性疾病患者，均存在全身或局部骨量丟失現(xiàn)象，具有骨折的高風(fēng)險性[1]。此外，Claudio Franceschi 在 2000 年提出“inflammaging (炎性衰老)”的概念，其表現(xiàn)為衰老的機體中促炎標志物在細胞或組織中高表達的慢性低度炎癥狀態(tài)[6]，也被認為與骨質(zhì)丟失的發(fā)生相關(guān)。在炎性衰老及 RA 等自身免疫性疾病所涉及的骨免疫微環(huán)境中，促炎細胞因子明顯升高，包括腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor，TNF)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-18、干擾素 (interferon，IFN)、C-反應(yīng)蛋白 (C-reactive protein，CRP) 和血清淀粉樣蛋白等。盡管炎癥的基本生理作用是抵御感染或外來分子，但當炎癥持續(xù)和延長時，其被認為是心血管疾病、肌少癥和老年或絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等年齡相關(guān)疾病的危險因素[7-8]。通常，炎癥環(huán)境下的骨丟失被認為是破骨細胞過度激活導(dǎo)致骨過度吸收的結(jié)果，但炎癥性細胞因子影響骨代謝的具體機制目前仍不完全清楚。

2000 年，Arron 等[9]提出了“骨免疫學(xué)”概念，研究發(fā)現(xiàn)成骨細胞和破骨細胞活性受到免疫細胞分泌的可溶性介質(zhì)調(diào)節(jié)，包括細胞因子、趨化因子及生長因子，如 IL-1、TNF-α、IL-6 和 IL-17 等；同時，成骨細胞和破骨細胞也可以反向作用于免疫細胞[10]。骨保護素(osteoprotegerin，OPG)/ 核因子-κB 受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)/ 核因子-κB 受體活化因子 (receptor activator of NF-κB，RANK) 信號通路是聯(lián)系骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵通路，在骨重建和免疫功能中均發(fā)揮作用[10]。2018 年，Srivastava 等[11]提出了“immunoporosis (免疫性骨質(zhì)疏松)”的概念，發(fā)現(xiàn)先天性和適應(yīng)性免疫細胞均可以通過促炎細胞因子參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，OPG/ RANKL/ RANK 系統(tǒng)的過度激活參與了RA、AS、IBD、牙周炎及新冠肺炎 (COVID-19) 等炎癥性疾病的骨丟失[5,12]。炎癥部位免疫細胞的激活以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)、趨化因子、炎癥因子的產(chǎn)生均可影響破骨細胞和成骨細胞的分化和功能，引起局部或全身性骨丟失[10,13-14]。因此除了調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的功能，基于炎癥因子導(dǎo)致骨丟失的分子機制，通過抑制促炎細胞因子的免疫治療開始被廣泛應(yīng)用[2]。

二、促炎細胞因子對破骨細胞的影響

在正常骨重建時，破骨細胞的激活由成骨細胞產(chǎn)生的RANKL 調(diào)控，但在慢性炎癥等情況下，促炎性細胞因子刺激多種不同細胞 (如牙周炎中的牙周膜細胞和關(guān)節(jié)炎中的滑膜成纖維細胞) 使 RANKL 的產(chǎn)生增加[5,15]，也可以直接誘導(dǎo)破骨細胞的分化和激活。

TNF-α 主要由巨噬細胞產(chǎn)生，它作用于大多數(shù)細胞表面的腫瘤壞死因子受體 1 (tumor necrosis factor receptor-1，TNFR1) 和 TNFR2，通過激活破骨細胞內(nèi) NF-κB、蛋白酶、c-Jun N-末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase，JNK) 和絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK) 等信號通路釋放多種細胞因子、趨化因子并激活免疫細胞，進一步促進炎癥反應(yīng)[16]。研究證明，TNF-α 不能直接刺激破骨細胞分化，但可通過上調(diào) RANKL 發(fā)揮作用[17]。首先，TNF-α 直接刺激成骨細胞等細胞 RANKL 的表達促進破骨細胞生成[18]；其次，TNF-α 使 Dickkopf 相關(guān)蛋白 1 (Dickkopf-related protein 1，DKK-1) 或硬化蛋白(sclerostin，SOST) 等 Wnt/ β-catenin 信號通路的抑制蛋白表達增加，通過干擾成骨細胞功能，而阻斷 DKK-1 或SOST 則可保護 Wnt 信號通路，誘導(dǎo) OPG 增加，使破骨細胞生成減少。因此，TNF-α 通過改變 RANKL/ OPG 比例使骨吸收效應(yīng)增強[14,17,19-20]。此外，TNF-α 還可以作用于巨噬細胞集落刺激因子 (macrophage colony-stimulating factor 1，M-CSF) 通過磷脂酰肌醇 3-激酶 (phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/ 蛋白激酶 B (protein kinase B，AKT) 通路協(xié)同 RANKL 促進破骨細胞生成[10]。

IL-6 在 CXC 趨化因子配體 8 (C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8)、趨化因子配體 20 (C-C motif chemokine ligand，CCL20) 的刺激下[21]，由單核細胞、巨噬細胞、T 細胞、B 細胞和成纖維細胞等產(chǎn)生，其受體分為膜結(jié)合和可溶性受體，可以造成局部或全身炎癥反應(yīng)，與COVID-19、RA、AS、系統(tǒng)性硬化病、巨細胞動脈炎及青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)病機制相關(guān)[12,22-23]。IL-6作用于 IL-6 受體及共受體 gp130，直接激活 JAK 激酶(Janus kinase)/ 信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白 (signal transducer and activator of transcription，STAT) 信號通路和 MAPK 信號通路促進破骨細胞相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄以及炎癥因子的釋放，而釋放的炎癥因子又作為 NF-κB 通路的刺激因素，使炎癥持續(xù)發(fā)生形成正反饋回路。IL-6 的增加也可間接地通過誘導(dǎo)成骨細胞產(chǎn)生 RANKL 促進破骨細胞生成。此外，IL-6 可上調(diào)破骨細胞前體表面鞘氨醇-1-磷酸受體 2(sphingosine-1-phosphate receptor 2，S1PR2) 的表達，并幫助其從骨髓中遷移至血液，因此在全身性骨丟失中發(fā)揮重要作用[10,14,21,24-26]。

IL-1 同樣是一種高度促炎細胞因子，在大多數(shù)全身性炎癥疾病中，IL-1 家族中的 IL-1β 發(fā)揮主要作用，一般在促炎刺激或自身誘導(dǎo)下由髓系細胞如巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞產(chǎn)生[27]。首先，IL-1 可以增加趨化因子CCL19、CCL21 及其受體趨化性細胞因子受體 7 (C-C motif chemokine receptor 7，CCR7) 的表達從而促進破骨細胞的遷移和激活[28]；其次，通過激活轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 和激活蛋白-1 (activator protein-1，AP-1) 促進 RANKL 依賴的破骨細胞分化[10]。在 IL-1 缺失的 TNF 轉(zhuǎn)基因小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α 誘導(dǎo)的局部骨質(zhì)破壞和全身炎癥性骨丟失在一定程度上依賴于 IL-1 的存在[29]，因此 IL-1 受體拮抗劑也可以抑制 TNF-α 誘導(dǎo)骨丟失[30]。

IL-17 主要是由輔助性 T 細胞 17 (T help 17 cells，Th17) 產(chǎn)生，其中以 IL-17A 為主，可以激活多個下游信號級聯(lián) [MAPK、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases，ERK)、STAT3] 進一步上調(diào)炎癥細胞因子和趨化因子[20]，繼而激活并募集中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞，增強炎癥反應(yīng)，是 AS 發(fā)病機制的關(guān)鍵因素。IL-17 誘導(dǎo)成骨細胞、滑膜細胞和間充質(zhì)細胞表達RANKL，改變 RANKL/ OPG 比值，增強破骨細胞生成，導(dǎo)致局部或全身骨質(zhì)破壞[31-32]。研究證明，在關(guān)節(jié)炎大鼠中 IL-17 可通過調(diào)節(jié)成纖維細胞樣滑膜細胞蛋白酪氨酸磷酸酶 (src homology-2-containing protein tyrosine phosphatase 2，SHP-2) 表達和 IL-17/ IL-17RA/ STAT3 信號通路促進炎癥因子和 RANKL 的產(chǎn)生[33]。

除上述細胞因子外，如 IL-9、IL-21、IL-23 及 IL-33等更多促炎細胞因子被發(fā)現(xiàn)與炎癥性骨丟失相關(guān)，其機制有待更充分的研究。

三、促炎細胞因子對成骨細胞的影響

TNF-α、IL-1、IL-6 是 DKK-1 和 SOST 分泌的刺激因子，過度表達的 DKK-1 通過結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-5/ 6 (low density lipoprotein receptor-related protein 5/ 6，Lrp5/ 6) 抑制成骨細胞 Wnt 信號通路進而抑制局部骨的生成[21]。另外，TNF-α 還可通過抑制促成骨分化的轉(zhuǎn)錄因子特異 AT 序列結(jié)合蛋白 2 (Special AT-rich sequencebinding protein 2，SATB2)、Runx2 和 osterix 表達，直接抑制成骨細胞分化[14,17]。正常條件下，成骨細胞表面的 IL-6受體處于低表達；在 RA 中，IL-6 與循環(huán)中過量表達的可溶型受體結(jié)合后與成骨細胞膜融合，通過 JAK/ STAT3 通路分泌破骨細胞刺激因子 RANKL、IL-1、甲狀旁腺素相關(guān)肽 (parathyroid hormone-related protein，PTHrP) 和前列腺素 E2 (prostaglandin E2，PGE2) 等[26]，其中 IL-1 和 TNF-α可以正反饋刺激 IL-6 的產(chǎn)生[25]。另外，IL-6 通過 PI3K/AKT2 和 MEK/ ERK 通路減少成骨細胞分化相關(guān)基因的表達，包括堿性磷酸酶 (alkaline phosphate，ALP)、Runx2 和骨鈣素，損害骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化能力，降低新生骨礦化[26]。IL-1β 可抑制成骨細胞募集[34]。其次，IL-1 可通過 Smad 和 STAT 介導(dǎo)的信號通路抑制 ALP，下調(diào)成骨細胞活性，減弱骨的礦化和膠原纖維的合成[10]。另有研究表明，IL-1α 通過激活 JNK 和 p38/ MAPK 通路誘導(dǎo)成骨細胞凋亡[35]。IL-17 可同時刺激間充質(zhì)干細胞成骨分化和破骨相關(guān)蛋白表達破壞骨代謝平衡[36]。但不同的是，IL-17A反而可通過激活 JAK2/ STAT3 誘導(dǎo) AS 成骨細胞分化[37]；同樣在牙周炎中，IL-17 是骨保護因子還是骨破壞因子也仍存在爭議[36]。

四、抗炎細胞因子的影響

除上述促炎性細胞因子抑制成骨細胞功能并誘導(dǎo)破骨細胞分化和激活外，同時還存在大量具有抑制破骨和抗骨吸收作用的抗炎細胞因子。比如，IL-3 可激活 STAT5 通路增強 Id 基因表達，進而抑制 RANKL，最終使破骨細胞生成相關(guān)蛋白表達降低[38]。IL-13 和 IL-27 通過 STAT1 抑制RANKL 表達進而抑制 c-Fos 基因，從而抑制破骨細胞前體增殖、分化。IL-4 可使破骨細胞 NF-κB 和 MAPK 失活抑制活化 T-細胞核因子 1 (nuclear factor of activated T cells 1，NFATc1)，以減弱 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細胞生成。據(jù)報道，IL-4 和 IL-13 均可增強成骨細胞 OPG 的產(chǎn)生，其中 IL-4 較 IL-13 擁有更強的促成骨細胞分化的能力[39-41]。IFN-γ、IL-12 和 IL-18 誘導(dǎo)成骨細胞 FasL 的表達作用于Fas 導(dǎo)致破骨細胞前體凋亡[42-45]。

五、炎癥性骨丟失的免疫治療

臨床中針對炎癥狀態(tài)下的骨丟失，除了常規(guī)抗骨質(zhì)疏松治療外，還需考慮消除炎癥疾病本身的負面影響。AS、RA 等的主要治療目標是減輕疼痛，延緩疾病進展，改善關(guān)節(jié)功能和生活質(zhì)量，而單獨使用非甾體抗炎藥并不足以緩解癥狀和改善生活質(zhì)量。目前并無足夠關(guān)于非甾體抗炎藥對白介素等炎癥因子水平影響的研究，針對持續(xù)存在的炎癥活動，生物類改善病情抗風(fēng)濕藥 (disease modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs) 可以在非甾體抗炎藥效果不佳時聯(lián)合使用，包括 TNF-α 抑制劑及 IL-17 抑制劑等[46]。此外，糖皮質(zhì)激素類藥物作為治療 RA 等自身免疫性疾病最常用的藥物之一，可有效發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛效果。但研究表明，高劑量和長期使用糖皮質(zhì)激素可以增加 M-CSF和 RANKL 因子表達，同時抑制 Wnt/ β-catenin 等成骨相關(guān)信號通路，從而直接影響破骨細胞和成骨細胞活性[47]。糖皮質(zhì)激素是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥最常見的原因，因此在炎癥性疾病的臨床使用中須慎重。大多數(shù)慢性炎癥的發(fā)病機制過于復(fù)雜或仍不清楚，但由于促炎細胞因子的激活是慢性炎癥級聯(lián)反應(yīng)的最終結(jié)果，針對炎癥細胞和促炎細胞因子的免疫治療被用于改善炎癥性骨丟失[2](表 1)。

表1 不同治療方式的代表藥物Tab.1 Representative drugs for different treatment modalities

1.TNF-α 抑制：TNF-α 阻滯劑可減輕活動性炎癥疾病并減少全身性骨丟失，增加骨密度，因此可應(yīng)用于治療RA、IBD、AS、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等導(dǎo)致的炎癥性骨丟失[2]，其中阿達木單抗等單克隆抗體特異性結(jié)合 TNF，而依那西普競爭性抑制細胞表面 TNFR 從而消除其生物學(xué)功能。由于其它促炎細胞因子 IL-1、IL-6 及 IFN-γ 等存在，因此單獨的抑制 TNF-α 對于約 1/ 3 的患者治療效果不佳[14]。抗 TNF-α 藥物的耐受性良好，常見的不良反應(yīng)比較輕微，不需停藥，而最常見的嚴重不良反應(yīng)為嚴重感染，其次還有惡性腫瘤、充血性心力衰竭和藥物性狼瘡等[16]。雖然 TNF-α 阻滯劑已廣泛應(yīng)用于臨床，但 TNF-α的完全抑制仍帶來不可避免的副作用。針對 TNF 受體TNFR1 和 TNFR2 的研究發(fā)現(xiàn)，選擇性抑制 TNFR1 或激活TNF/ TNFR2 相比于 TNF-α 阻滯劑可以更安全有效地抑制炎癥反應(yīng)，且避免產(chǎn)生明顯副作用[48-49]。

2.IL-6 抑制：IL-6 受體的中和性單克隆抗體塞利木單抗、托珠單抗能阻斷可溶性或膜結(jié)合 IL-6 受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，有效地控制全身炎癥，可用于治療 AS、RA、成人Still 病和克羅恩病等自身免疫性疾病[22,50]。研究表明塞利木單抗和托珠單抗的總體療效和安全性與 TNF-α 抑制劑相似，但托珠單抗具有用作單藥治療的優(yōu)勢。此外，感染是抗 IL-6R 藥物最常見的不良反應(yīng)，無明顯的 CRP 升高往往會掩蓋感染癥狀[51]。思妥昔布作為一種靶向 IL-6 的嵌合單克隆抗體，直接降低 IL-6 水平，可作為 IL-6R 抑制劑的補充[23]。而且，更多的抗 IL-6 藥物 (如 olokizumab) 處于臨床研究階段，有望與甲氨蝶呤聯(lián)合應(yīng)用治療 RA 等炎癥性疾病[52]。

3.IL-1 抑制：IL-1 抑制劑可阻斷 IL-1 從而減少軟骨和骨的破壞。阿那白滯素是一種重組 IL-1 受體 (IL-1R) 拮抗劑，阻斷 IL-1α 和 IL-1β 的活性，在臨床上可單獨或與其它藥物聯(lián)用治療 RA、新生兒發(fā)病的多系統(tǒng)炎癥性疾病，改善全身性骨丟失，但與其它炎癥因子相關(guān)的生物制劑相比，其改善的程度相對較低。利用可溶性受體阻斷劑利納西普或抗 IL-1β 單抗卡那奴單抗中和 IL-1，也可發(fā)揮抗炎和抗骨丟失作用[53-54]。

4.IL-17 抑制：目前 IL-17A 單克隆抗體司庫奇尤單抗和依奇珠單抗以及 IL-17 受體 A 的單克隆抗體布羅利尤單抗被廣泛用于治療銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎和 AS，此類藥物有希望用于改善炎癥導(dǎo)致的全身性骨丟失，可在 TNF-α治療無效時使用，最常見的副作用是導(dǎo)致輕中等程度的感染[55-56]。

5.淋巴細胞抑制：活化的 B 細胞和 T 細胞可通過分泌炎癥因子等多種途徑促進破骨細胞生成，抑制慢性炎癥中這些細胞的活化和增殖，可對骨丟失的改善產(chǎn)生有益影響。選擇性免疫抑制劑阿巴西普和利妥昔單抗可使 T 細胞或 B 細胞的產(chǎn)生受到抑制或增加其消耗，可抑制 RA 患者關(guān)節(jié)損傷的進展[2,57-58]。

6.骨組織工程應(yīng)用：通過免疫調(diào)節(jié)促進骨再生是骨組織工程中一個較新的研究領(lǐng)域，具有免疫調(diào)節(jié)作用的生物材料可以抑制局部過度激活的免疫反應(yīng)，同時具有增強骨再生的效果[59]?？刂粕锊牧系男蚊?、潤濕性、表面電荷、細胞因子、離子和其它生物活性分子的釋放等特性可影響免疫反應(yīng)，干擾骨代謝[60-61]。例如，生物材料的形貌可影響巨噬細胞的極化[62]，M1 巨噬細胞持續(xù)存在和 M2巨噬細胞缺乏將導(dǎo)致嚴重的異物反應(yīng)和慢性炎癥，使組織愈合延遲和生物材料整合失??；M2 巨噬細胞可通過釋放 TGF-β 和 IL-10 抑制炎癥反應(yīng)，促進骨組織重建[60]。另外，來自間充質(zhì)干細胞的外泌體也具有免疫調(diào)節(jié)和促進成骨分化的功能，可以作為生物材料上的一種新型骨誘導(dǎo)因子，并且很少產(chǎn)生不良反應(yīng)[63-64]。研究表明，人骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體也可以顯著降低巨噬細胞中促炎基因和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (inducible Nitric oxide synthase，iNOS)的表達，并促進人骨髓間充質(zhì)干細胞中早期成骨標志物的表達[65]。

六、總結(jié)

骨免疫學(xué)涵蓋了免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)的相互調(diào)節(jié)，慢性炎癥疾病或炎性衰老導(dǎo)致局部或全身骨質(zhì)丟失越來越被重視，免疫調(diào)節(jié)失衡產(chǎn)生的大量炎癥細胞和促炎細胞因子通過復(fù)雜的分子機制參與骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致不同程度的骨丟失，免疫性骨質(zhì)疏松便是慢性炎癥干擾全身骨代謝的結(jié)果。改善炎癥性骨丟失、預(yù)防免疫性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生可以從骨免疫調(diào)節(jié)出發(fā)，通過炎癥細胞因子和炎癥細胞的抑制減輕炎癥反應(yīng)來調(diào)節(jié)成骨細胞與破骨細胞性能。此外，骨組織工程中具有免疫調(diào)節(jié)作用的生物材料的研究與應(yīng)用提供了更多治療炎癥性骨丟失的潛在方式。