楊 巍，蔣 磊，董秀梅

1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室東北科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，黑龍江哈爾濱 150030；2.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽 110032

牛副流感病毒3型（BPIV3）屬于副黏病毒科、副黏病毒亞科、呼吸道病毒屬，是一種能夠引起牛的急性呼吸道疾病的病毒性病原。BPIV3有3種常見的基因型，包括a、b、c型，這三種基因型之間的差異很小[1]。在臨床上BPIV3容易與其它病原發(fā)生混合感染，很少發(fā)現(xiàn)單獨(dú)感染的病例。如果是BPIV3的單獨(dú)感染，一般不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，個(gè)別病例會(huì)有輕微的呼吸道癥狀。若是BPIV3與其它病原發(fā)生混合感染則病情惡化迅速，特別是細(xì)菌的繼發(fā)性感染容易引起嚴(yán)重的呼吸道癥狀，最終導(dǎo)致死亡。近些年來，我國黑龍江、內(nèi)蒙古等省在流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，牛群中BPIV3的血清陽性率很高，其它一些省如山東、江西等也在牛群中檢測(cè)到了BPIV3抗體的存在[2]。因此對(duì)于BPIV3的防治應(yīng)引起高度重視,否則將嚴(yán)重危害我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。

本研究中，我們從黑龍江某牛場(chǎng)中有呼吸道癥狀的病牛鼻拭子中成功分離到一株BPIV3。將分離株M基因與GenBank中已發(fā)表毒株的M基因進(jìn)行同源性比較及進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明分離株屬于c基因型。我們的結(jié)果將為牛副流感病毒3型檢測(cè)試劑盒及疫苗的研發(fā)工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病料

病料樣本采集于黑龍江某牛場(chǎng)患有呼吸系統(tǒng)疾病的病牛。

1.1.2 細(xì)胞和主要試劑

MDBK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，RNA提取試劑盒、2×Taq PCR試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA marker等購自天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、FITC標(biāo)記的兔抗羊IgG購自賽默飛世爾科技公司，BPIV3抗體購自VMRD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病毒的分離純化

先將無菌采集到的病牛鼻拭子放置于1 mLPBS中充分混勻，用0.22 μm的濾膜過濾除菌后接種于長滿單層的MDBK細(xì)胞。盲傳三代后對(duì)產(chǎn)生CPE的樣本進(jìn)行噬斑純化[3]。純化后的病毒在MDBK細(xì)胞上連續(xù)傳代，收集各代病毒液放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫熒光鑒定

用純化后的病毒感染MDBK細(xì)胞，感染72 h后固定被感染的細(xì)胞，Triton-X-100透膜，BSA封閉后加入一抗（BPIV3抗體）孵育1 h，然后加入二抗（FITC標(biāo)記的兔抗羊IgG）孵育1 h，最后用含有DAPI的封片劑封片，封片后樣品用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察[4]。

1.2.3 分離株生長情況的測(cè)定

用純化后的病毒感染MDBK細(xì)胞，于感染后的不同時(shí)間點(diǎn)收取病毒，測(cè)定感染后病毒的生長情況。病毒滴度的測(cè)定方法如下：將收獲病毒的上清液進(jìn)行10倍稀釋（10-1～10-10）；將MDBK細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板上，長滿單層后加入稀釋好的病毒液，每個(gè)稀釋度做8個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL，使其在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；同時(shí)設(shè)立陽性和陰性對(duì)照。每天觀察細(xì)胞病變情況，5 d后用Karber法計(jì)算結(jié)果[5]。

1.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的BPIV3分離株SD0835（GenBank登錄號(hào)：HQ530153）和NX49（GenBank登錄號(hào)：KT071671） M基因序列，利用生物學(xué)軟件Oligo和DNAStar設(shè)計(jì)一對(duì)引物。上游引物為：5’-GCCAATCAGTCCCTCGACAAA-3’，下游引物為：5’-TGTCCAGGCTGTCGGTGTTAC-3’。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 094 bp。引物由吉林庫美生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.5 RT-PCR

參照病毒RNA提取試劑盒說明書提取BPIV3病毒基因組RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板使用上述設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix Ⅱ 12.5 μL，DNA 模板 2 μL，dH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物置于4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.2.6 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序與序列分析

樣品送吉林庫美生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank上已發(fā)表的序列進(jìn)行比較，并利用Mega 6.0和DNAStar軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析和同源性比較。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 接種BPIV3分離株的MDBK細(xì)胞的免疫熒光鑒定

MDBK細(xì)胞被病毒感染后48 h用間接免疫熒光法對(duì)被感染細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，細(xì)胞對(duì)照組中只有代表細(xì)胞核的藍(lán)色熒光信號(hào)，而實(shí)驗(yàn)組中除了藍(lán)色熒光信號(hào)外還發(fā)現(xiàn)了代表BPIV3感染的綠色熒光信號(hào),證明分離到的病毒為BPIV3。

2.2 BPIV3分離株在MDBK細(xì)胞上生長情況的測(cè)定

用純化后的病毒感染MDBK細(xì)胞，于感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（0、12、24、48、72、96 h）收取病毒，測(cè)定病毒滴度并繪制病毒生長曲線。結(jié)果表明在感染后第72小時(shí)達(dá)到病毒最高滴度為5.62×108TCID50/mL。

噬斑純化后的病毒在MDBK細(xì)胞上進(jìn)行七次連續(xù)傳代（P1～P5），比較各代次之間的病毒滴度。結(jié)果表明傳至P5代病毒的滴度明顯提升達(dá)到6.58×108TCID50/mL。

2.3 BPIV3分離株M基因的擴(kuò)增

利用RT-PCR方法擴(kuò)增出HLJ1分離株的M基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，與預(yù)期大小一致，為1 094 bp。

2.4 BPIV3分離株M基因的序列測(cè)定與分析

測(cè)序結(jié)果表明HLJ1分離株的M基因大小為1 056 bp，與BPIV3c型參考毒株NX49和SD0835同源性較高分別達(dá)到99.7%、99.1%，而與其它BPIV 3a和BPIV3b型參考毒株同源性較低為83.1%～85.8%（NM09（GenBank登錄號(hào)：JQ063064）,Q5592（GenBank登錄號(hào)：EU277658），TVMDL15（GenBank登錄號(hào)：KJ647284），TVMDL60（GenBank登錄號(hào)：KJ647289））。氨基酸同源性方面，HLJ1與NX49和SD0835的同源性均為99.7%，而與Q5592的同源性最低為96.3%。遺傳進(jìn)化分析表明，HLJ1與NX49和SD0835同屬于c基因型。

3 討論

在本研究當(dāng)中我們采取患有呼吸系統(tǒng)疾病的病牛的新鮮鼻拭子，經(jīng)放置在無菌PBS中混勻并濾膜除菌后，立即接種MDBK細(xì)胞，盲傳三代后，能夠產(chǎn)生典型的病變。分離到的病毒經(jīng)噬斑純化后，用間接免疫熒光方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明成功分離出一株BPIV3毒株。病毒感染MDBK細(xì)胞后，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度并繪制病毒生長曲線。我們發(fā)現(xiàn)在感染后0～72 h病毒增殖速度較快，并于感染后第72小時(shí)達(dá)到病毒最高滴度，72 h后病毒滴度逐漸回落，因此在進(jìn)行病毒傳代過程中，為獲得最大滴度病毒，應(yīng)在感染后72 h進(jìn)行收毒。噬斑純化后的病毒在MDBK細(xì)胞上進(jìn)行5次連續(xù)傳代，經(jīng)比較各代次之間的病毒滴度發(fā)現(xiàn)，傳至P5代病毒的滴度較之前明顯提高。M基因是BPIV3的分型基因，在本研究中我們擴(kuò)增出HLJ1的M基因，測(cè)序結(jié)果表明分離株的M基因?yàn)? 056 bp。利用生物學(xué)軟件將HLJ1的M基因與GenBank上已發(fā)表的BPIV3參考毒株M基因序列比較后，結(jié)果表HLJ1與NX49和SD0835同屬于c基因型。在本研究當(dāng)中，我們從患呼吸系統(tǒng)疾病的病牛鼻拭子當(dāng)中成功分離到一株c型BPIV3，我們的結(jié)果將為牛副流感病毒3型檢測(cè)試劑盒及疫苗的研發(fā)工作奠定基礎(chǔ)。