何嘉偉

廣東省東莞生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，廣東 東莞 523000

葉綠素a 是浮游植物、藻類及一些細菌中的重要色素，具有將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的作用。當(dāng)水體中葉綠素a 含量超標(biāo)時，會導(dǎo)致藻類大量繁殖，引發(fā)赤潮，降低水體透明度，威脅生態(tài)環(huán)境并造成巨大的經(jīng)濟損失[5]。因此，測定水體中葉綠素a 的濃度，可以精準(zhǔn)判斷水體的富營養(yǎng)化程度，明確水體的光合作用能力及營養(yǎng)狀況。

目前，葉綠素a 的測定方法主要有分光光度法[1]、熒光光度法和高效液相色譜法[2]。在實際操作中，分光光度法是比較常用的分析方法，然而，人們在運用分光法測定葉綠素a 濃度的過程中面臨著不少困擾，如：以9+1 丙酮為參比溶液，樣品吸光度出現(xiàn)負值情況；人工研磨操作費時費力，樣品飛濺問題難以控制，操作誤差較大；此外，使用丙酮作為提取液極易揮發(fā)，對實驗人員身體傷害較大，且會污染環(huán)境。因此，有必要對分光光度法進行進一步探究，以便于測定水質(zhì)中的葉綠素a 時更加高效且安全。

1 實驗材料

1.1 試劑與材料

本次實驗用水為新鮮制備的去離子水，用到的試劑及各材料情況見表1。

表1 使用試劑及材料情況登記表

1.2 儀器和設(shè)備

本實驗所用到的儀器設(shè)備：CARY 60 紫外可見分光光度計（配10 mm 石英比色皿）；F6/10 手持式高速勻漿機；離心機TG16-WS；過濾裝置HDG-6A。

2 實驗方法

除以下實驗部分外，本實驗方法的具體實驗內(nèi)容均依據(jù)HJ 897-2017 規(guī)定[1]進行。

實驗分為三部分：1）在測定過程中，將9+1 丙酮、經(jīng)過針式濾器的9+1 丙酮及空白試驗樣品分別作為參比，分別在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm處測量其吸光度。2）分別采用玻璃研磨杵和手持式高速勻漿機對樣品進行研磨，使用9+1 丙酮將樣品浸泡提取2 h，離心后，以經(jīng)過針式濾器的9+1 丙酮為參比測量吸光度，計算實際樣品結(jié)果[3]。3）采用玻璃研磨杵對樣品進行研磨，使用9+1 丙酮和95%乙醇分別浸泡提取，離心后，再分別以經(jīng)過針式濾器的9+1 丙酮和95%乙醇為參比測量吸光度[4-8]。

3 結(jié)果與討論

3.1 空白試驗

按照HJ 897-2017 的操作要求[9]，對空白試樣進行過濾—研磨—浸泡提取—離心過濾等操作。鑒于9+1 丙酮在使用過程中極易揮發(fā)，樣品經(jīng)過研磨—浸泡提取—離心過濾后，樣品管內(nèi)的丙酮含量遠低于9+1，含水量升高，同時純度不高的丙酮中很可能含有黃色的丙酮酸，以9+1 丙酮為參比溶液，空白試樣在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 處均出現(xiàn)了負值的異常情況。

本實驗又以經(jīng)過針式濾器的9+1 丙酮和試驗空白樣品分別為參比，對空白試樣進行分析，發(fā)現(xiàn)各吸光度結(jié)果為負值的情況均得到了改善。不同參比溶液的空白試驗測試結(jié)果見表2。

表2 不同參比溶液的空白試驗測試結(jié)果

3.2 研磨方式

使用玻璃研磨杵手工研磨需要耗費大量的時間和精力，故而僅適用于小批量樣品處理，難以滿足高批量的實驗需要。同時，手工研磨的不可控性，決定了樣品研磨可能不均勻，會影響到實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。此外，手工研磨需要較高的技術(shù)水平和極強的耐心，對人員操作水平的要求較高[10]。

本研究對使用玻璃研磨杵手工研磨方式與搗碎濾紙后使用手持式高速勻漿機的半自動研磨方式進行比較，測試不同研磨方式對實驗結(jié)果的影響。

通過實驗及數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，玻璃研磨杵操作簡單，破壁充分，但費時費力，丙酮使用過程中揮發(fā)嚴重且溶液飛濺，有一定的安全風(fēng)險；而使用手持式高速勻漿機操作簡單，破壁充分，且省時省力，能夠減少丙酮飛濺，有利于降低實驗風(fēng)險。其詳細結(jié)果見表3。

表3 不同研磨方式的實際樣品測試結(jié)果（單位：μg/L）

3.3 提取液種類

經(jīng)查閱相關(guān)資料了解到，葉綠素a 可溶于丙酮、乙醇、乙醚等有機溶劑中，考慮到丙酮試劑受公安部管制且使用過程中存在安全風(fēng)險，而乙醇容易獲得且無毒安全，故本實驗使用95%乙醇作為提取液與標(biāo)準(zhǔn)要求的9+1 丙酮提取液進行比對。

通過實驗及數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，使用95%乙醇提取液的浸提效果與9+1 丙酮相當(dāng)，同時也能解決參比溶液調(diào)零后吸光度為負值的問題。其詳細結(jié)果見表4。

表4 不同提取液的實際樣品測試結(jié)果（單位：μg/L）

4 結(jié)論

使用9+1 丙酮作為參比溶液時對空白試樣進行測量和對比分析，發(fā)現(xiàn)其在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 處均出現(xiàn)了吸光度為負值的異常情況，而采用經(jīng)過針式濾器處理的9+1 丙酮或空白樣品作為參比溶液，可以有效改善空白試樣的負值問題。

本文對比了使用玻璃研磨杵和手持式高速勻漿機兩種不同研磨方式對實驗結(jié)果的影響。研究結(jié)果表明，手持式高速勻漿機操作簡單，效率高且更加安全，能夠有效降低實驗風(fēng)險。因此，運用分光光度法時應(yīng)使用手持式高速勻漿機進行研磨處理，以獲得更加準(zhǔn)確且可靠的實驗數(shù)據(jù)。

經(jīng)實驗比對，使用95%乙醇與9+1 丙酮提取液浸提效果相當(dāng)，故而，95%乙醇可取代受管制的丙酮用作提取試劑。此外，使用95%乙醇還能有效解決參比溶液調(diào)零后吸光度為負值的問題。因此，建議使用95%乙醇作為9+1 丙酮的替代試劑，應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域中。