楊潤瑞 王 勇,2 段柳劍 柯尊麗

(1 貴州中醫(yī)藥大學,貴陽,550000; 2 中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心中國科學院合成生物學重點實驗室,上海,200000)

肝癌是由多種因素引起的消化系統(tǒng)內(nèi)的惡性腫瘤之一。流行病學表明,中國的肝癌發(fā)病率位居世界之首[1]。而臨床的治療手段并不能很好地改善肝癌患者的預后,且多伴有嚴重的不良反應[2-4]。故臨床亟須尋找肝癌發(fā)展過程中的深層次作用機制和更為有效的治療手段。

細胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細胞死亡方式,在腫瘤類疾病中發(fā)揮著關鍵作用[5]。中醫(yī)藥作為我國的傳統(tǒng)醫(yī)療手段,對肝癌的發(fā)生發(fā)展有著獨特的認知。且中藥有多成分、多靶點的特性,對肝癌發(fā)展的各個階段均有較好的治療作用。有研究表明,中醫(yī)藥通過調(diào)節(jié)細胞焦亡過程影響肝病患者的痰瘀程度和預后[6]。故本文擬基于對細胞焦亡的分子機制及其在肝癌發(fā)病機制中的作用進行分析,探討中醫(yī)藥調(diào)節(jié)細胞焦亡在肝癌發(fā)展過程中的作用,以期為臨床提供新的治療思路。

1 細胞焦亡的發(fā)生機制

細胞焦亡過程多由經(jīng)典的胱天蛋白酶(Caspase-1)依賴型與非經(jīng)典的Caspase-1依賴型2種分子途徑調(diào)控。見圖1。其中以經(jīng)典的Caspase-1依賴型較為多見,這一途徑以核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3)炎癥小體的激活為主。當外界刺激因子被細胞膜、細胞質(zhì)上的識別受體識別后會刺激NLRP3、黑色素瘤缺乏因子-2(Absent in Melanoma 2,AIM2)等焦亡相關蛋白的激活。隨后繼續(xù)募集凋亡相關斑點樣蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein Containing Caspase Recruitment Domains,ASC)和Caspase-1進行拼接,形成具有生物學活性的NLRP3炎癥小體并促進白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-18的成熟和分泌[7-8]。Caspase-1也會將GSDM切割釋放GSDM-N結構域,該結構域可在細胞膜上打孔,導致細胞質(zhì)腫脹、膜破裂等特征性形態(tài)變化[9]。而非經(jīng)典的Caspase-1依賴型相對簡單,一部分是由脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激ASC后致使Caspase-4/5/11激活并切割GSDM完成[10]。此外,Caspase-4/5/11會刺激泛連接通道蛋白1(Pannexin-1)進而誘導細胞膜上P2X7R的激活使細胞膜上形成微孔[11]。值得注意的是,Pannexin-1被激活后也會促進NLRP3炎癥小體的形成引起細胞焦亡。因此,在疾病的發(fā)展過程中,經(jīng)典與非經(jīng)典的分子途徑會協(xié)同調(diào)控焦亡的進程。值得注意的是,焦亡會使細胞發(fā)生較為嚴重的形態(tài)學改變,使細胞膜表面出現(xiàn)大量氣泡狀突起,進而形成孔膜[12]。細胞內(nèi)部的脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)、染色質(zhì)、線粒體、溶酶體等物質(zhì)也會出現(xiàn)不同程度的損傷并通過孔膜釋放至細胞外,細胞自身形態(tài)也會隨著細胞內(nèi)部物質(zhì)的流出逐漸趨于扁平化。

圖1 細胞焦亡的發(fā)生機制

2 細胞焦亡對肝癌發(fā)生發(fā)展的作用機制

目前,學術界普遍認為細胞焦亡在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中有“雙刃劍”的作用。研究表明,細胞焦亡可以誘導肝癌細胞的迅速死亡進而降低腫瘤惡化和轉移的風險。但在細胞焦亡的過程中,細胞內(nèi)容物也從肝細胞內(nèi)部釋放到細胞外,作為內(nèi)源性刺激介導肝臟內(nèi)不同細胞的不同生物學改變[13]。不僅如此,肝臟內(nèi)的細胞可能自身也有發(fā)生或誘導其他細胞發(fā)生焦亡的潛力。因此,這些基于細胞焦亡產(chǎn)生的后續(xù)生物學改變也在潛移默化地影響著肝癌的預后。

2.1 肝臟內(nèi)免疫細胞與細胞焦亡 肝臟是人體內(nèi)重要的免疫器官,含肝巨噬細胞、自然殺傷細胞(Natural Killer Cell,NK Cell)和細胞毒性T細胞等免疫細胞[14]。其中,肝巨噬細胞為肝組織的巨噬細胞,是抵御癌細胞的第一道防線[15]。生理狀態(tài)下,肝巨噬細胞極易被內(nèi)毒素、補體和其他病原體相關分子模式通過各類信號途徑激活發(fā)揮自身的吞噬作用[16]。但肝巨噬細胞內(nèi)部的NLRP3/Caspase-1通路被激活后,不僅會自身產(chǎn)生焦亡現(xiàn)象還會增加細胞對內(nèi)毒素的敏感性,也會使機體產(chǎn)生過度的免疫反應加重癌癥患者的炎癥反應損傷[17]。NK細胞與細胞毒性T細胞也是肝內(nèi)淋巴細胞的重要組成成分,二者共同維持著機體的免疫穩(wěn)態(tài)。研究表明,細胞毒性T細胞多通過T細胞抗原受體來識別和消除靶細胞,而NK細胞多被各類細胞因子激活,可以消除不被細胞毒性T細胞識別的靶細胞[18]。因此,二者以互補的方式發(fā)揮滅殺病原體、癌變細胞,抑制腫瘤免疫逃逸等免疫功能[19]。值得注意的是,這些免疫功能的正常發(fā)揮極可能與二者介導的細胞焦亡有關。研究表明,NK和細胞毒性T細胞可通過釋放顆粒酶A(Granzyme A,GZMA)裂解并激活GSDMB,以非經(jīng)典的Caspase-1依賴型的途徑觸發(fā)細胞焦亡[20]。不僅如此,NK細胞釋放的顆粒酶B(GZMB)除了通過激活Caspase-3來誘導GSDM的激活外,還能夠以不依賴于Caspase的方式直接切割GSDM誘發(fā)細胞焦亡[21]。因此,NK細胞與細胞毒性T細胞參與肝癌患者的免疫反應可能是通過調(diào)節(jié)細胞焦亡實現(xiàn)的。

2.2 肝星狀細胞、肝細胞與細胞焦亡 肝星狀細胞(Hepatic Stellate Cells,HSC)是肝內(nèi)的脂質(zhì)儲存細胞,通過調(diào)節(jié)纖維化的程度參與肝癌的發(fā)病進展[22]。生理情況下,HSC的狀態(tài)受轉化生長因子等信號分子的調(diào)節(jié)?；罨腍SC可上調(diào)轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)表達,并在HSC自分泌機制的作用下,產(chǎn)生膠原纖維和細胞外基質(zhì)成分共同參與肝纖維化的進展,增加癌變的風險[23-24]。

在癌癥的發(fā)展過程中,由于體內(nèi)免疫微環(huán)境的劇烈變化極易導致肝細胞的損傷。受損的肝細胞可釋放活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)和其他損傷分子模式[25]。在ROS、損傷相關分子模式(Damage Associated Molecular Pattern,DAMP)等因素的作用下,NLRP3、ASC與Caspase-1組裝并介導IL-1β的成熟和分泌,加劇肝臟的炎癥反應損傷[26]。成熟的IL-1β也可直接觸發(fā)HSC活化,從而增加細胞外基質(zhì)的沉積加重肝纖維化的程度。值得注意的是,NLRP3炎癥小體和ASC等成分也存在于HSC中,并在HSC活化和肝纖維化發(fā)展中發(fā)揮重要作用。NLRP3引起HSC的功能變化,上調(diào)TGF-β的產(chǎn)生和細胞外基質(zhì)的分泌[27]。因此,細胞焦亡會造成肝細胞的損傷及肝臟纖維化的增強進而影響肝癌的進展。

2.3 肝癌細胞與細胞焦亡 肝癌細胞的增值、遷移和侵襲等現(xiàn)象也受細胞焦亡的調(diào)控。肝癌細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活會誘導癌細胞死亡及炎癥介質(zhì)的釋放,進而抑制癌細胞的增殖和轉移[28]。但在二乙基亞硝胺誘導的小鼠肝癌模型初期,NLRP3的表達上調(diào)會加速肝癌的形成[29]。低氧應激下,高表達的Caspase-1也可促進肝癌細胞侵襲和轉移[30]。這些證據(jù)表明,在肝癌的不同階段細胞焦亡發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。

3 中醫(yī)理論對肝癌及細胞焦亡的認識

在中醫(yī)理論中,并無確切病名與肝癌對應,但依據(jù)其臨床表現(xiàn)多將肝癌歸屬于“肝積”“肝壅”等范疇。肝是人體五臟中的重要臟器,有“將軍”之稱,“罷極”之能?！端貑枴分杏休^多的篇幅論述肝的作用,如肝可疏泄全身的氣機、可作為血液的儲藏器官等。從氣血角度而言,氣為陽,血為陰。故肝作為調(diào)節(jié)氣血的重要臟器,亦有調(diào)和陰陽、沖氣以為和之用。而若肝受邪,氣血隨之而亂,氣郁易生熱,血停易成瘀,久蘊則成毒。肝乘脾土,運化失調(diào)則成痰濕。痰濕瘀熱毒邪日久化癥瘕積聚停于左脅,過一歲則杯盤牢結一分,日久則人身瘦而腹大,至死不消而成肝積。

細胞焦亡是內(nèi)源性致熱的主要生物學過程之一,是機體內(nèi)炎癥反應、細胞死亡的重要機制[31]。其本質(zhì)為各種原因?qū)е碌娜梭w內(nèi)肝細胞膜完整性喪失、內(nèi)容物流出的程序性細胞死亡。這一過程會伴隨著能量的釋放和細胞內(nèi)部物質(zhì)的流出,而中醫(yī)理論中多將無形物質(zhì)歸屬為陽,有形物質(zhì)歸屬為陰。故若將細胞視為獨立個體,則細胞在焦亡時狀態(tài)應為陰隨陽脫、陰陽離絕。細胞內(nèi)部物質(zhì)流出后作為痰瘀進一步加劇機體陰陽失衡的表現(xiàn)。如體溫是反映整體陰陽波動的重要指標,而大鼠肝組織中Caspase-1、GSDMD的表達水平與核心體溫呈正比[32]。大鼠體內(nèi)痰濕程度也與NLRP3/Caspase-1信號通路的表達正相關[33-34]。Caspase-1激活后也會誘導內(nèi)皮細胞活化及焦亡,并使細胞間黏附分子的表達水平升高,加重單核細胞與內(nèi)皮細胞的黏附,進而加速瘀血的形成[35]。此外,細胞內(nèi)容物在細胞膜破裂后流入脈絡,日久則形成“痰瘀毒結”。故細胞焦亡會影響人體的陰陽平衡,并加重體內(nèi)痰瘀的嚴重程度[6]。因此,若要調(diào)節(jié)肝癌中細胞焦亡的生物學過程,應從陰陽平衡處著眼,依體內(nèi)痰濕瘀熱毒邪之深淺立法,如此多可獲效。

4 中醫(yī)藥調(diào)控肝癌發(fā)展過程中的細胞焦亡現(xiàn)象

通過現(xiàn)代手段發(fā)現(xiàn),多種活性成分及復方可調(diào)節(jié)肝癌進展過程中細胞焦亡的變化。有趣的是,中藥具有明顯的雙向調(diào)節(jié)作用。在肝癌細胞中,中藥能增加細胞焦亡相關基因和蛋白的表達進而誘導癌癥細胞的凋亡,避免癌癥的惡化和轉移。而在肝組織中,中藥可抑制細胞焦亡相關基因和蛋白的表達,避免肝損傷及肝臟免疫微環(huán)境紊亂的發(fā)生。

4.1 復方 黃連解毒湯出自《肘后備急方》,內(nèi)有黃芩、黃連、黃柏、梔子,為清熱解毒之良劑,三焦內(nèi)各臟腑的火熱實證均可用之。黃連解毒湯可抑制NLRP3介導的炎癥反應、細胞焦亡等生物學過程,改善肝臟的脂滴聚集和脂質(zhì)代謝進而避免原發(fā)性肝癌的發(fā)生[36-37]。西黃丸原名犀黃丸,為乾隆五年王維德所著的《外科證治全生集》中的丸劑,由牛黃、麝香、乳香及沒藥組成?，F(xiàn)代研究表明,西黃丸能夠通過抑制核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)、NLRP3、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)蛋白的表達進而干預肝癌SMMC-7721細胞焦亡過程,發(fā)揮抗肝癌作用[38]。

健脾益氣方為卓少元教授根據(jù)多年治療肝癌的臨床實踐所得驗方,由黃芪、白術、云苓、白芍、半夏、薏苡仁及神曲等7味中藥組成,有扶正補虛、運脾化濕之功。動物實驗表明,健脾益氣方對DEN誘導的肝癌模型大鼠具有較好的治療作用,可改善大鼠的肝細胞脂肪變性、壞死和肝組織損傷指數(shù),降低血清中TNF-α、IL-1β等炎癥介質(zhì)含量以及肝組織中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、受體相互作用蛋白1(Receptor Interacting Protein-1,RIP1)、RIP3、混合系列激酶域樣蛋白(Mixed Lineage Kinase Domain-Like,MLKL)的表達水平[39]。鱉甲煎丸出自漢代名醫(yī)張機《金匱要略》,多用于治療肝纖維化、肝硬化、肝炎、肝癌等肝病[40]。鱉甲煎丸可顯著降低二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌模型肝臟中NLRP3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18的表達水平,抑制大鼠肝組織纖維化程度、癌變細胞和炎性細胞浸潤且呈現(xiàn)劑量依賴關系[41]。

有研究在治療原發(fā)性肝癌時多采用固脾消積飲的臨床效驗方,方以人參、黃芪、白術、莪術、半枝蓮組成。體外實驗表明,固脾消積飲通過上調(diào)細胞焦亡經(jīng)典通路中相關分子Caspase-1的表達,進而誘導人肝癌HepG2.2.15細胞發(fā)生焦亡[42]。

4.2 單體 研究表明,紫檀芪、槲皮素、姜黃素等酚類物質(zhì)可改善焦亡相關信號通路的激活。其中,紫檀芪是藜蘆醇內(nèi)的多酚化合物,具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性[43]。紫檀芪可改善抗腫瘤藥物阿霉素誘導的肝臟病理變化以及谷草轉氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)、谷丙轉氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)水平,并通過抑制NLRP3炎癥小體的表達減少焦亡現(xiàn)象的發(fā)生進而對阿霉素誘導的肝損傷產(chǎn)生保護作用[44]。槲皮素也是一種多酚類化合物,近些年它已被證實在重塑腫瘤微環(huán)境、抑制惡性腫瘤轉移和誘導腫瘤細胞保護性自噬等方面存在積極作用。動物實驗表明,槲皮素可通過調(diào)節(jié)核轉錄因子紅系2相關因子2(Nuclear Factor-erythroid 2-related Factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶(Heme Oxygenase,HO-1)通路的表達,從而抑制NLRP3炎癥小體的激活和炎癥介質(zhì)的分泌,從而維持肝臟的正常功能[45]。姜黃素是姜黃科根莖內(nèi)的多酚類物質(zhì),它對HepG2細胞裸鼠移植瘤有較好的抑制作用,可明顯減少腫瘤質(zhì)量和體積、凋亡指數(shù)及裸鼠腫瘤組織中的NLRP3、IL-1β mRNA和蛋白相對表達量[46]。迷迭香酸是一類天然酚酸類化合物,它能下調(diào)Vimentin/NLRP3蛋白的表達抑制HepG2細胞增殖并誘導細胞焦亡[47]。

高山異黃酮、木犀草苷等黃酮類成分可以影響HCC肝癌細胞焦亡過程。高山異黃酮是石斛中具有廣泛的藥理特性的黃酮類化合物,可直接通過激活NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡抑制HCC細胞生長和轉移[48]。木犀草苷是一種常見的黃酮類化合物,它能通過下調(diào)NLRP3、ROS、Caspase-1等基因的表達抑制HCC細胞的增殖、侵襲和轉移[49]。

雙氫青蒿素、山莨菪堿等其他成分也對焦亡過程有一定的調(diào)節(jié)作用。其中,雙氫青蒿素是青蒿素的一種衍生物,具有抗炎、抗腫瘤、抗瘧疾等多種藥理作用[50]。體外實驗表明,雙氫青蒿素通過上調(diào)AIM2/Caspase-1通路的表達促進肝癌HepG221細胞自噬的產(chǎn)生進而抑制肝癌細胞的異常增殖[51]。山莨菪堿是從山莨菪中提取的一種生物堿,對感染性疾病有良好的治療作用[52]。山莨菪堿可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活及γ干擾素(Interferon-Gamma,IFN-γ)、TNF-α、IL-4和IL-27等炎癥介質(zhì)的水平進而抑制HCC細胞的生長[53]。黃色當歸醇是從明日葉中分離出來的查耳酮類物質(zhì),能夠誘導肝癌細胞發(fā)生Caspase-1依賴性的細胞焦亡,從而抑制細胞增殖[54]。

5 討論

細胞焦亡與機體自身的陰陽平衡有關,且焦亡產(chǎn)生的細胞內(nèi)容物流出會介導痰濕瘀熱毒邪的產(chǎn)生。中醫(yī)藥可影響細胞焦亡的變化,對肝癌發(fā)展過程中所介導的組織損傷、癌細胞的增殖與轉移、局部的炎癥級聯(lián)反應均有較好地改善作用,充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥具有多方位、綜合性的優(yōu)勢。今后課題組將充分發(fā)揮現(xiàn)代技術的優(yōu)勢,進一步將中醫(yī)理論與現(xiàn)代生物學現(xiàn)象進行深一步融合,并設計相關臨床、基礎實驗對細胞焦亡在肝癌的變化進行多維度的深入研究,以期闡明不同藥物、劑型對肝癌不同階段焦亡相關基因和蛋白表達的影響,為臨床治療提供相應的理論支持。

利益沖突聲明:無。