摘 " " "要：選擇法尼基轉(zhuǎn)移酶（FTase）和香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶 （GGTase-I）作為靶標(biāo)，利用Autodock系列軟件，將Artemisian C和Artemisian D兩個倍半萜內(nèi)酯二聚體與FTase和GGTase-I兩個蛋白分別進(jìn)行了分子對接，并分析了各自的作用模式。結(jié)果：Artemisian C與Artemisian D與FTase 的結(jié)合能分別為-44.379和-47.016 6 kJ/mol，Artemisian C 與Artemisian D與GGTase-I的結(jié)合能分別為-33.406 6 kJ/mol和-39.220 9 kJ/mol。兩個化合物能夠以氫鍵和疏水作用與兩種蛋白相結(jié)合。結(jié)論：Artemisian C與Artemisian D能夠在一定程度上抑制FTase和GGTase-I活性，是這兩個靶標(biāo)的雙重抑制劑。兩種分子能夠以多藥多靶的形式協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。

關(guān) "鍵 "詞：分子對接；艾葉；法尼基轉(zhuǎn)移酶；香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶

中圖分類號：TQ041+.8 " " 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A " " 文章編號： 1004-0935（2023）07-0943-04

Ras蛋白屬于小三磷酸鳥鳥苷酶（GTPase）家族，是一種分布在細(xì)胞膜內(nèi)的小分子蛋白質(zhì)，被稱為細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的“分子開關(guān)”，在細(xì)胞生長、增殖、發(fā)育、分化和癌細(xì)胞產(chǎn)生中起重要作用。然而，若RAS蛋白始終處于激活狀態(tài)，則會對細(xì)胞的生長增殖產(chǎn)生持續(xù)的刺激作用，使細(xì)胞處于持續(xù)增殖甚至癌變的狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，人類20%～30%的癌癥是由Ras基因的獲得性功能型突變引起的[1]。

Ras蛋白的脂質(zhì)化是實現(xiàn)其功能的重要翻譯后修飾，也是使其定位到細(xì)胞膜上的必須過程，其過程依次需要三種酶：法尼基轉(zhuǎn)移酶 （Ftase）、香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶I （GGTase-I）和香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶II （GGTase-II）。Ftase能夠催化Ras脂質(zhì)化的第一步，是致癌Ras生物活性的專有修飾過程，是翻譯修飾過程中關(guān)鍵性催化酶[2]。目前國內(nèi)外大量研究集中于尋找Ftase抑制劑（FTI），并開發(fā)了臨床藥物，但治療效果不佳。隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)在FTI存在的情況下，N-Ras和K-Ras通過一種稱為交替預(yù)烯基化的過程成為香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶I （GGTase-I）的底物，這樣導(dǎo)致Ras蛋白仍然與膜結(jié)合，并具有生物活性，使細(xì)胞增殖甚至癌變。所以FTI盡管達(dá)到了抑制Ftase的目標(biāo)，但仍然無法阻止細(xì)胞生長增殖。針對這個問題，一些研究者開發(fā)了對Ftase和GGTase-I的雙重抑制劑，其中一些已經(jīng)進(jìn)入臨床，但因為毒性較大限制了其廣泛使用[3]?；诖耍_發(fā)一些低毒有效的Ftase和GGTase-I雙重抑制劑對于腫瘤的治療具有重要的理論和實踐價值。

近年來，研究者在天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎的Ftase抑制劑，如艾葉中的青蒿素內(nèi)酯類成分、蒼耳子中的內(nèi)酯類成分、紫蘇中的異鼠李素

等[4]。這些天然產(chǎn)物小分子抑制劑作為一類低毒、安全、有效的新型抗癌藥物值得進(jìn)一步研究。

艾葉是菊科蒿屬植物艾葉的干燥葉，是中醫(yī)臨床常用藥之一。艾葉始載于《名醫(yī)別錄》，具有灸百病、理氣血、逐寒濕、止痛、安胎、溫胃等作用。臨床廣泛應(yīng)用于腫瘤、婦科疾病、呼吸系統(tǒng)、風(fēng)濕痹痛，取得了較好的療效。艾葉中主要含有揮發(fā)油、黃酮、多糖、萜類等多種化學(xué)成分。Lee等從艾葉中分離得到一些倍半萜內(nèi)酯類化合物，并證實這類化合物具有Ftase的抑制作用[5]。研究表明艾葉中的倍半萜內(nèi)酯二聚體類成分對FTase具有抑制作用，但是具體的活性成分的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理仍不清楚，值得進(jìn)一步探索和研究。因此，本研究利用分子對接技術(shù)，對本課題組前期實驗分離和篩選出來的倍半萜內(nèi)酯二聚體類新骨架化合物Artemisian C與Artemisian D進(jìn)行分子對接研究[6]，以期發(fā)現(xiàn)新的Ftase和GGTase-I的雙重小分子抑制劑，并為后續(xù)的艾葉中倍半萜內(nèi)酯二聚體的相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 "材料

1.1 "平臺與軟件

本研究主要采用Autodock tools 1.5.6[7]、AutoDock4Zn[8]、Autodock Vina[9-10]軟件完成。

2 "方法與結(jié)果

2.1 "分子對接

2.1.1 "受體蛋白晶體的處理

從蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org）搜索并下載法尼基轉(zhuǎn)移酶晶體結(jié)構(gòu)（PDBID：3E33）和香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶晶體結(jié)構(gòu)（PDBID：1N4Q）。利用Autodock tools對法尼基轉(zhuǎn)移酶晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步處理，刪除原有配體，去掉水分子和無機(jī)離子，但保留活性中心的鋅離子，添加氫原子，給原子電荷，最后將晶體結(jié)構(gòu)保存為pdbqt格式。對香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行類似處理。

2.1.2 "配體化合物的構(gòu)建

通過課題組前期實驗[6]，已經(jīng)從艾葉中分離得到2個愈創(chuàng)木內(nèi)酯單元和開環(huán)倍半雜萜雜聚形成的倍半萜二聚體。通過分子繪圖Chemdraw軟件繪制其二維結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)見圖1。接著利用Chem3D轉(zhuǎn)換成三維結(jié)構(gòu)并進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。然后利用Autodock tools 1.5.6 對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步處理，以PDBQT的格式進(jìn)行保存，供下一步分子對接使用。

2.1.3 "分子對接參數(shù)設(shè)置

根據(jù)原晶體結(jié)構(gòu)中配體的位置確定兩個靶標(biāo)的網(wǎng)格盒子的中心，分別為（-68.94 ?，-20.87 ?，

2.44 ?）和（71.58 ?，104.51 ?，28.50 ?），大小均為（30 ?×30 ?×30 ?）。由于蛋白質(zhì)法尼基轉(zhuǎn)移酶中含有鋅離子，所以對于它的對接采用專門處理含鋅蛋白的對接軟件AutoDock4Zn分子對接軟件來實現(xiàn)，而對于蛋白質(zhì)香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ型的對接則是利用Autodock Vina軟件完成。在對接過程中，只改變配體構(gòu)象，酶蛋白的構(gòu)象保持不改變。除特別聲明外，其余所有參數(shù)均采用默認(rèn)值。選擇結(jié)合能?G最低的構(gòu)象作為最終對接結(jié)果。并依據(jù)公式Ki=exp[?G×1 000/（Rcal×T）]，得到化合物的抑制常數(shù)Ki，其中?G的單位為kcal/mol，T=298 K，R=

1.987 19 cal/（mol?K），最后換算為kJ/mol。

2.1.4 "Artemisian C和D與Ftase的分子對接

從表1中可以看出Artemisian C與Artemisian D與Ftase的平均結(jié)合能分別為-44.379 kJ?mol-1，和-47.016 6 kJ?mol-1， 相對應(yīng)的抑制常數(shù)也都小于

1 uM， 說明兩個化合物對Ftase都有較明顯的抑制作用。對以上2個化合物與Ftase的結(jié)合構(gòu)型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Artemisian C和D的分子形狀剛好與Ftase的活性形成很好的契合。Artemisian C與Ftase上的羰基作為氫鍵受體與CYS（B：299）、TYR（B：361）及ARG（B：202）形成強(qiáng)的氫鍵相互作用。另外，F(xiàn)tase的不飽和雙鍵可以與TRP（B：102）形成σ-π相互作用，同時和ALA9（B：151）形成疏水作用。而Artemisian D與Ftase的結(jié)合模式和Artemisian C的相類似，除了羰基氧與位于TYR（A：166）、ARG（B：202）和TRP（B：102）形成氫鍵作用外，還與TYR（B：361）、ALA（A：98）及TYR（A：131）形成疏水相互作用。

2.1.5 "Artemisian C和 D與GGTase-I的分子對接

Artemisian C、Artemisian D與GGTase-I的結(jié)合能分別為-33.406 6和-39.220 9 kJ/mol （見表1），可以看出Artemisian D對GGTase-I（1N4Q）的抑制能力更強(qiáng)。從圖3中可以看出，Artemisian C與GGTase-I的ARG （H：173）形成氫鍵相互作用，其余的就是與HIS（H：121）、ALA（H：123）、LEU（H：320）、LEU（H：43）和PHE（H：174）形成的疏水相互作用。Artemisian D可以與THR（H：49）、HR（H：45）和ARG（H：173）形成三個強(qiáng)的氫鍵相互作用，此外還與ALA（G：129）和TYR（G：166）存在疏水作用。由于Artemisian D與GGTase-I的氫鍵作用明顯多于Artemisian C，所以活性也更強(qiáng)一些。

3 "討論與結(jié)論

從1982年首次在人類癌癥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)突變激活的Ras蛋白以來，基于Ras蛋白抑制劑的篩選工作就已經(jīng)開展起來[11]。Ras的持續(xù)激活可以使細(xì)胞處于惡行增殖狀態(tài)。Ftase和GGTase-I是激活Ras蛋白的兩種關(guān)鍵酶。針對Ras蛋白和單一Ftase的抑制劑先后在臨床試驗上的失敗，使一些學(xué)者對Ras蛋白的研究陷入僵局[12]。隨著新方法和研究的進(jìn)一步深入，國內(nèi)外科學(xué)家堅信針對不同種類的Ras蛋白同時進(jìn)行組合抑制設(shè)計，以及針對脂質(zhì)化途徑的組合設(shè)計，是未來最有希望獲得由Ras蛋白引起的癌癥藥物的研究方向[13]。隨著Ras蛋白新機(jī)制的闡明，研究者開發(fā)了對Ftase和GGTase-I的雙重抑制劑，其中一些也已經(jīng)進(jìn)入臨床，但因為毒性較大，其廣泛使用受到了一定的限制[14]。因此，本研究將研究目標(biāo)投向天然產(chǎn)物，以期發(fā)現(xiàn)毒性較低的Ftase和GGTase-I的雙重小分子抑制劑。

艾葉作為傳統(tǒng)天然藥物，其在臨床上具有廣泛的應(yīng)用，也被用于各種腫瘤疾病的治療。有文獻(xiàn)報道[11]艾葉的提取物對人的腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用。根據(jù)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，艾葉中的倍半萜內(nèi)酯類成分為抑制Ftase的活性部分[15]。

因此，本研究利用前期課題組已經(jīng)分離得到的倍半萜內(nèi)脂類二聚體進(jìn)行了初步的分子對接研究，選取艾葉中的倍半萜內(nèi)酯二聚體類成分Artemisian C和D對Ftase晶體結(jié)構(gòu)（PDBID：3E33）和GGTase-I（PDBID：1N4Q）這兩個靶蛋白的調(diào)控作用。結(jié)果表明兩個化合物分別對其都具有一定的抑制作用，雖然Artemisian C和Artemisian D的結(jié)構(gòu)相似。但Artemisian D對Ftase和GGTase-I的抑制活性均高于Artemisian C，這可能與他們的立體空間結(jié)構(gòu)微小差異有關(guān)系，經(jīng)推測，原因可能為Artemisian D與GGTase-I的氫鍵作用明顯多于Artemisian C，所以活性也更強(qiáng)一些。

基于以上發(fā)現(xiàn)，有理由推測，艾葉中倍半萜內(nèi)酯類二聚體類化合物應(yīng)該是具有Ftase和GGTase-I雙重抑制活性的有效部位，下一步課題組將對已經(jīng)分離的這類活性化合物進(jìn)行體內(nèi)和體外的抗腫瘤的實驗研究。本研究揭示了艾葉中倍半萜內(nèi)脂二聚體類化合物抗腫瘤的部分分子機(jī)制，為艾葉作為抗腫瘤藥物的進(jìn)一步開發(fā)提供了科學(xué)和理論依據(jù)。

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Molecular Docking Study of Dual Inhibitors of Farnesyltransferase and Geranylgeranyltransferase From Artemisia argyi

SHAN Shu-jun1， ZHENG Su1， WANG Yuan-yuan1， SHI Li-li1， CHEN Gui-rong3， XUE Gui-min2

（1. Jiangsu Provincial Xuzhou Pharmaceutical Vocational College， Xuzhou Jiangsu 221116， China;

2. Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou Henan 450046， China;

3. Liaoning University of Chinese Medicine， Dalian Liaoning 116600， China）

Abstract： "Farnesyl transferase （FTase） and geranylgeranyl transferase （GGTase-I） were selected as targets， using Autodock series software， Artemisian C and Artemisian D sesquiterpene lactone dimers were docked with FTase and GGTase-I proteins， respectively， and their respective action modes were analyzed. The results showed that， the binding energies of Artemisian C and Artemisian D with FTase were -44.379 kJ/mol and -47.016 6 kJ/mol， respectively. The binding energies of Artemisian C and Artemisian D with GGTase-I were -33.406 6 kJ/mol and -39.220 9 kJ/mol， respectively. The two compounds could bind to the two proteins by hydrogen bonding and hydrophobic interaction. Artemisian C and Artemisian D can inhibit the activity of FTase and GGTase-I to a certain extent， and are dual inhibitors of these two targets. The two molecules can synergistically exert anti-tumor effects in the form of multi-drug and multi-target.

Key words： Molecular docking; Artemisia argyi; Farnesyltransferase; Geranylgeranyl transferase