摘 " " "要：目的：建立了硫酸氫氯吡格雷對映異構(gòu)體的HPLC測定方法。方法：采用CHIRALCEL OJ-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以V（無水乙醇）∶ V（正庚烷）∶ V（二乙胺）=15∶85∶0.01為流動相，流速為每分鐘0.8 mL，檢測波長為220 nm。結(jié)果：專屬性良好，對映異構(gòu)體濃度在0.20～1.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=1.000 0，n=7）；平均回收率為101.9%，RSD為3.7%。結(jié)論：方法精密度好、準確度高，可用于本品的對映異構(gòu)體檢測。

關(guān) "鍵 "詞：氯吡格雷；對映異構(gòu)體；高效液相色譜儀法（HPLC）

中圖分類號：O657.7 " " 文獻標識碼： A " " 文章編號： 1004-0935（2023）07-1079-05

就全世界范圍內(nèi)而言，最主要的死亡疾病之一是心腦血管疾病。中國心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，推算心血管病現(xiàn)階段患病人數(shù)3.3億，高血壓2.45億人[1]。

硫酸氫氯吡格雷片是一種血小板抑聚集制劑，通過抑制腺苷二磷酸酯（ADP）途徑來抑制血小板活化，進而抑制血小板的聚集。其乙酸衍生物，與噻氯匹定相比，其生產(chǎn)成本更低，治療效果更強且副作用相對較小[2]。與阿司匹林相比，氯吡格雷解決了部分患者的耐受性高及過敏問題。因此，在同類型的產(chǎn)品中，氯吡格雷在醫(yī)療作用、 藥物耐受性以及安全性方面表現(xiàn)出了它的優(yōu)越性[3-4]。

臨床上使用的氯吡格雷主要是硫酸鹽，化學(xué)名：S（+）-2-（2-氯苯基）-2-（4，5，6，7-四氫噻吩并［3，2-c］吡啶-5-基）乙酸甲酯硫酸鹽。法國賽諾菲公司于1986年研究并開發(fā)成功，在1997年11，美國食品藥物監(jiān)督管理局（FDA）批準賽諾菲-安萬特公司的Plavix（“波利維”）用于心梗后、卒中后和確診的外周動脈疾病（PAD），品名Piavix（波立維）[5-6] ，目前已經(jīng)得到美國、歐洲以及中國在內(nèi)的很多國家的廣泛應(yīng)用。

查閱藥典［ChP2020[7]，USP-NF2022版[8]］結(jié)合原料藥合成工藝[9]，可知硫酸氫氯吡格雷片中涉及的R（-）-2-（2-氯苯基）-2-（4，5，6，7-四氫噻吩并［3，2-c］吡啶-5-基）乙酸甲酯硫酸鹽為其對映異構(gòu)體，（±）2-［（2-氯苯基）］-2-（4，5，6，7-四氫噻吩并［3，2-c］吡啶-6-基）乙酸甲酯硫酸鹽為其位置異構(gòu)體，相關(guān)的結(jié)構(gòu)見圖1[7-8]。

研究表明，只有S構(gòu)型氯吡格雷顯示出抑制血小板凝聚的活性。然而，現(xiàn)行的檢測方法測定重復(fù)性不佳[7-8]，多次進樣系統(tǒng)會發(fā)生漂移，不能穩(wěn)定快捷的控制藥品質(zhì)量。

本文建立了HPLC法，同時拆分硫酸氫氯吡格雷及三個異構(gòu)體，并對對映異構(gòu)體的含量進行了測定。

對測定方法進行了方法學(xué)研究，結(jié)果表明：本法專屬性好，靈敏度高，對映異構(gòu)體加樣回收良好，色譜條件耐用性佳，為該原料藥質(zhì)量控制提供了依據(jù)[8-12]。

1 "儀器與試藥

1.1 "儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀，電子分析天平（梅特勒XS105DU）。

1.2 "試藥

硫酸氫氯吡格雷對照品（批號20 161 019，含量99.4%）；對映異構(gòu)體對照品（批號20 161 015，含量99.2%）；氯吡格雷雜質(zhì)II對照品（批號20 160 802，含量99.1%）；硫酸氫氯吡格雷樣品（批號20 161 019、20 161 016、161 001）；各對照品和樣品均為正大天晴藥用集團股份有限公司制備，乙醇、正庚烷和二乙胺均為色譜級，水為自制超純水。

2 "方法與結(jié)果

2.1 "色譜條件

色譜柱CHIRALCEL OJ-H柱（4.6mm×250 mm，5 μm），流動相：V（無水乙醇）∶ V（正庚烷）∶ V（二乙胺）=15∶85∶0.01，流速為每分鐘0.8 mL，柱溫30 ℃，檢測波長220 nm，進樣器溫度10 ℃，進樣體積10 μL。

2.2 "溶液的制備

溶劑：V（乙醇）∶ V（正庚烷）=1∶1。

各對照品貯備液：分別取對映異構(gòu)體、硫酸氫氯吡格雷、雜質(zhì)II對照品約25 mg，分別置不同

25 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液：取硫酸氫氯吡格雷樣品約20 mg，置10 mL量瓶中，加溶劑適量，超聲使溶解，搖勻。

2.3 "專屬性

取硫酸氫氯吡格雷對照品（批號：20 161 019）約20 mg，置10 mL量瓶中，加溶劑適量，超聲使溶解，加入上述對映異構(gòu)體對照品貯備液100μL，雜質(zhì)II對照品貯備液200μL，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，測定，出峰順序依次為氯吡格雷雜質(zhì)II（R）、對映與氯吡格雷、雜質(zhì)II（S）和氯吡格雷，數(shù)據(jù)見表1，典型圖譜見圖2。

硫酸氫氯吡格雷出峰時間為15.430 min，對映異構(gòu)體出峰時間為10.397 min，對映異構(gòu)體與前后相鄰的氯吡格雷雜質(zhì)II的RS異構(gòu)體峰分離良好，分離度依次為4.09和3.38，方法專屬性良好。

2.4 "檢測限與定量限

對照品貯備液：取對映異構(gòu)體對照品和硫酸氫氯吡格雷對照品各約25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

精密量取上述對照品貯備液適量，采用溶劑逐級稀釋后測定。

硫酸氫氯吡格雷在進樣量為0.405 6 ng時達到檢測限，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.002 0%，連續(xù)測定3針，信噪比（S/N）在3.1～3.5之間；在進樣量為1.267 4 ng時達到定量限，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.006 3%，連續(xù)測定6針，峰面積的RSD（n=6）為5.99%，保留時間的RSD（n=6）為0.10%，信噪比（S/N）在9.8～10.5之間。

對映異構(gòu)體在進樣量為0.163 3 ng時達到檢測限，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.000 8%，連續(xù)測定3針，信噪比（S/N）在2.2～3.7之間；在進樣量為0.510 3 ng時達到定量限，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.002 6%，連續(xù)測定6針，峰面積的RSD（n=6）為5.43%，保留時間的RSD（n=6）為0.04%，信噪比（S/N）在10.6～11.5之間。

由上可見，方法靈敏度良好。

2.5 "標準曲線

對映異構(gòu)體對照品貯備液：取對映異構(gòu)體對照品約25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

硫酸氫氯吡格雷對照品貯備液：取硫酸氫氯吡格雷對照品約25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

線性貯備液：精密量取上述對映異構(gòu)體和硫酸氫氯吡格雷對照品貯備液各4 mL，置同一20 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性貯備液。

線性溶液③～⑥：精密量取上述線性貯備液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL和0.7 mL，置不同10 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，得到相當(dāng)于供試品溶液濃度0.1%、0.2%、0.5%和0.7%的溶液，分別作為線性溶液③～⑥。

線性溶液①～②：精密量取上述線性溶液④和⑤各1 mL，置不同10 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，得到相當(dāng)于供試品溶液質(zhì)量分數(shù)0.02%和0.05%的溶液，分別作為線性溶液①、②。

測定：精密量取線性溶液①～⑥各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，平行測定2次。以進樣量（ng）為x軸，峰面積（A）為y軸，進行線性相關(guān)，計算線性相關(guān)系數(shù)r，見表3和圖3（硫酸氫氯吡格雷線性和范圍）。

硫酸氫氯吡格雷進樣量在4.055 5～141.943 2 ng濃度范圍內(nèi)與峰響應(yīng)成顯著的線性關(guān)系，線性方程為y=0.040 0x+0.020 4，線性相關(guān)系數(shù)r為1.000 0，y軸截距占百分百響應(yīng)值的1.03%。

圖3和表4顯示對映異構(gòu)體進樣量在4.082 3～142.879 7 ng濃度范圍內(nèi)與峰響應(yīng)成顯著的線性關(guān)系，線性方程為y=0.038 9x+0.004 9，線性相關(guān)系數(shù)r為1.000 0，y軸截距占百分百響應(yīng)值的0.13%。綜上所述，本方法的線性良好。

2.6 "待測溶液穩(wěn)定性

配制加標供試品溶液：取硫酸氫氯吡格雷約40 mg，置20 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，加入上述對映異構(gòu)體對照品貯備液200 μL，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，于10 ℃下放置0、2、4、6、8、12、18、25、32、40和48 h后測定。

供試品溶液在10 ℃下放置48 h內(nèi)，穩(wěn)定性良好。各時間點，對映異構(gòu)體檢出量均為0.60%，變化值為0.00%，RSD（n=11）值為0.00%。

2.7 "回收率

對映異構(gòu)體對照品貯備液：取對映異構(gòu)體對照品約20 mg，置200 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對映異構(gòu)體對照品貯備液a; 精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對映異構(gòu)體對照品貯備液b。

精密配制依次加標0.02%、0.10%、0.50%和0.70的準確度溶液：取本品約20 mg，置10 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，分別精密量取對映異構(gòu)體對照品貯備液b 0.2 mL或1 mL于其中，用空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別作為加標0.02%和0.10%的回收率溶液；取本品約20 mg，置10 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，分別精密量取對映異構(gòu)體對照品貯備液a 0.5 mL或0.7 mL于其中，用空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別作為加標0.50%和0.70%的回收率溶液；各回收率溶液分別平行配制3份，測定對映異構(gòu)體的檢出量，按式（1）計算對映異構(gòu)體的回收率：

回收率（%）＝ ×100%。 " " " （1）

式中：X1—供試品中對映異構(gòu)體實測總量，ng；

X2—供試品中對映異構(gòu)體原有量，ng；

M—對映異構(gòu)體理論加入量，ng。

結(jié)果顯示，對映異構(gòu)體0.02%濃度點的回收率在106.96%～109.16%之間，其余濃度點回收率在98.50%～101.55%之間，所有濃度點回收率均值為101.9%，RSD（n=12）為3.7%，方法準確度良好。

2.8 "耐用性

耐用性測試溶液的配制同專屬性試驗項下：適當(dāng)調(diào)整柱溫（30±3 ℃）、流速（0.8±0.1 mL/min）、流動相比例（乙醇占比：15%±3%）和二乙胺濃度（0.01%±0.002%），分別測定耐用性測試溶液。

測定結(jié)果顯示：各考察條件下，耐用性測試溶液中，對映異構(gòu)體與相鄰雜質(zhì)II的兩個對映異構(gòu)體分離度均大于2.0，對映異構(gòu)體峰拖尾因子均小于3.0，表明測定方法耐用性良好。

2.9 "樣品測定

供試品溶液：取硫酸氫氯吡格雷（批號：20 161 019、20 161 016、161 001）約20 mg，置10 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

對照溶液：精密量取上述供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

精密量取供試品溶液和對照溶液進行測定，按自身對照法計算，20 161 019、20 161 016和161 001批硫酸氫氯吡格雷樣品。對映異構(gòu)體檢出量依次為0.08%、0.21%和0.03%。

3 "討論

3.1 "檢測波長的選擇

硫酸氫氯吡格雷及其對映異構(gòu)體均在 220 nm 波長處均有較強吸收，選擇 220 nm 作為本品對映異構(gòu)體的檢測波長。

3.2 "色譜柱的選擇

大賽璐Daicel CHIRALCEL OJ-H液相手性色譜柱是多糖衍生物正相涂敷型手性色譜柱，硅膠表面涂敷有纖維素-三（4-甲基苯甲酸酯），具有優(yōu)秀的分離能力和耐受性，適用于反相系統(tǒng)。因此采用此色譜柱進行試驗。

3.3 "流動相的選擇

常規(guī)流動相為無水乙醇與正己烷體系，硫酸氫氯吡格雷為1∶1的硫酸鹽，連續(xù)進樣多針樣品溶液，會引起色譜體系pH值的微小變化，導(dǎo)致主峰和對映異構(gòu)體峰保留時間的漂移，方法重復(fù)性差。

本文選擇在流動相中加入少量二乙胺，以中和供試品溶液進樣瞬間的酸性，色譜條件更加穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

4 "結(jié) 論

開發(fā)了硫酸氫氯吡格雷對映異構(gòu)體含量的HPLC測定方法，操作便捷，專屬性良好，方法靈敏度高，加樣準確度良好，適于樣品中對映異構(gòu)體含量的準確測定，可以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

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Determination of Enantiomer of Clopidogrel Bisulfate by HPLC

JIN Mei-hong， YANG Lei-lei

（Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Lianyungang Jiangsu 222069， China）

Abstract： "In order to establish a HPLC method for detemination of enantiomers of clopidogrel bisulfate， the separation was performed on a CHIRALCEL OJ-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）column， and the mobile phase was the mixture of ethanol-n- heptane-diethylamine （15∶85∶0.01）， the flow rate was 0.8 mL·min-1， and the detection wavelength was 220 nm. The results showed that the specificity of the method was good， and the linear relationship was good within the mass concentration of 0.20～1.4 μg·mL-1 for enantiomers （r=1.000 0， n=7）. The average recovery was 101.9%， with RSD of 3.7%. So，the method has good precision and high accuracy， and can be used for the determination of enantiomers of this product.

Key words： Clopidogrel; Enantiomer; High performance liquid chromatography （HPLC）