摘要：為探究藻菌生物膜處理含鎳廢水的可行性，對(duì)自然城市水體的藻菌富集掛膜得到藻菌生物膜，并在不同運(yùn)行參數(shù)下對(duì)含鎳溶液進(jìn)行處理，研究鎳的吸附量及藻菌生物膜胞外聚合物（EPS）含量在不同條件下的變化。結(jié)果表明，經(jīng)富集掛膜的藻類屬于綠藻門小球藻屬，其對(duì)含鎳廢水有較高的處理效果，在pH為8、溫度為35 ℃時(shí)處理效果最佳；且能在3 d內(nèi)達(dá)到鎳吸附平衡，去除率達(dá)70%以上，同時(shí)，藻菌生物膜多聚糖含量隨時(shí)間的變化與鎳吸附量呈一定的正相關(guān)，證明其為鎳吸附中的主要作用物質(zhì)，而ATP含量則更能反映藻菌生物膜受脅迫的過程。藻菌生物膜在鎳的脅迫下，胞外聚合物含量隨脅迫程度升高而減少；從吸附量來看，其對(duì)鎳的耐受值為10 mg/L，在此范圍內(nèi)，吸附量隨鎳濃度的升高而升高，最高達(dá)2.358 mg，繼續(xù)升高鎳濃度則吸附量明顯下降。

關(guān)鍵詞：藻菌生物膜；胞外聚合物（EPS）；鎳（Ni）；吸附量；去除率

中圖分類號(hào)：X703" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）03-0135-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.03.022 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on treatment of nickel-containing wastewater by alga-bacteria biofilm and changes of the extracellular polymeric substances

REN Yun-yun1， ZHANG Sha2， PEI Cuo-ping1， ZHANG Zhi-lin1

（1.Tongchuan Vocational and Technical College， Tongchuan" 727031，Shaanxi，China；

2.Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an" 710021，China）

Abstract： To explore the feasibility of algal-bacteria biofilm’s treatment for nickel-containing wastewater， alga-bacteria biofilm was obtained by filming algae and bacteria enrichment in natural urban water， and nickel-containing solution was treated under different operating parameters to study the adsorption amount of nickel and the change of extracellular polymer substance（EPS） content of algal bacteria biofilm under different conditions. The results showed that the algas after enrichment and filming belonged to Chlorella， which had a higher treatment effect on nickel-containing wastewater. The treatment effect was best when pH was 8 and the temperature was 35 ℃. Nickel adsorption equilibrium was reached within 3 days and the removal rate was more than 70%. At the same time， the content of polysaccharides in alga-bacteria biofilm with time was positively correlated with nickel adsorption amount， which proved that it was the main substance in nickel adsorption， while ATP content could reflect the stress process of alga-bacteria biofilm. Under the stress of nickel， the content of extracellular polymer substances in alga-bacteria biofilm decreased with the increase of stress. From the perspective of adsorption amount， its tolerance to nickel was 10 mg/L. Within this range， adsorption amount increased with the increase of the nickel concentration， up to 2.358 mg. However， adsorption amount decreased significantly when the nickel concentration continued to increase.

Key words： algae biofilm； extracellular polymer substance （EPS）； nickel （Ni）； adsorption amount； removal rate

隨著中國(guó)工業(yè)化的日益進(jìn)步，由于資源開采及產(chǎn)業(yè)排放等原因，所造成的的環(huán)境污染也日益增加，其中最引人擔(dān)憂的便是各種重金屬污染［1］。而鎳（Ni）作為重金屬污染的八大元素之一，已經(jīng)引起了各界廣泛的關(guān)注［2］。由于鎳被普遍應(yīng)用于電子行業(yè)中，不僅導(dǎo)致制造業(yè)產(chǎn)生的鎳污染嚴(yán)重，同時(shí)也伴隨鎳礦開采對(duì)水體的污染［3］，這些鎳污染物通過地表水流沖刷及地下水滲透等方式進(jìn)入地球水循環(huán)，并最終在生物鏈的作用下超量累積于生物體內(nèi)，并對(duì)生物體形成長(zhǎng)期毒害作用［4］。因此，對(duì)鎳污染水體的處理成為重金屬修復(fù)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

通常使用的重金屬污染水體修復(fù)方法包括生物法、化學(xué)法及物理法。生物修復(fù)法由于其本身環(huán)境友好性、無二次污染的優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注［5］。其中，利用藻類修復(fù)重金屬比植物修復(fù)具有繁殖快、回收方便及吸附量大等優(yōu)點(diǎn)，因此在此領(lǐng)域被寄予厚望［6，7］。范彩彩［8］利用鼠尾藻（Sargassum thunbergii）對(duì)重金屬Pb2+、Cd2+、Cu2+及Zn2+進(jìn)行吸附，發(fā)現(xiàn)鼠尾藻對(duì)幾種重金屬都具有較好的吸附效果。Mata等［9］使用墨角藻（Fucus vesiculosus）對(duì)Pb2+、Cu2+及Cd2+進(jìn)行吸附，發(fā)現(xiàn)其吸附能力表現(xiàn)為Pb2+＞Cu2+＞Cd2+，且吸附能力主要來自于墨角藻細(xì)胞壁上的巖藻聚糖。馬艷等［10］利用藻菌生物膜處理鉛鋅尾礦渣中的重金屬，結(jié)果表明藻菌生物膜可以通過胞外聚合物（EPS）與重金屬的絡(luò)合來吸附重金屬，其中對(duì)Pb2+的作用能力最強(qiáng)。以上研究已證明了藻類及藻菌生物膜對(duì)部分重金屬的去除效果，但目前使用藻菌生物膜處理鎳的報(bào)道仍較為鮮見。本研究擬利用城市自然水體，通過富集培養(yǎng)及掛膜制備藻菌生物膜，并對(duì)含鎳溶液進(jìn)行處理，以驗(yàn)證藻菌生物膜對(duì)鎳的處理效果及其胞外聚合物的變化，以期對(duì)鎳污染水體的生物修復(fù)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用包含藻菌的水樣取自西安市長(zhǎng)樂公園芙蓉湖。

液體培養(yǎng)基成分：每升培養(yǎng)基包含滅菌米湯水100 mL，Ca（NO3）2·4H2O 0.25 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO4 0.05 g，ZnSO4·7H2O 0.05 g，NaHCO3 0.02 g，F(xiàn)eCl3、MnCl2、Na2MoO·H2O、CuSO4·5H2O痕量。

1.2 處理設(shè)計(jì)

背景重金屬的濃度過高將對(duì)微生物產(chǎn)生較強(qiáng)的脅迫毒害作用，因此研究中普遍采用的重金屬濃度為0.5～30.0 mg/L［11，12］。本試驗(yàn)中采用的鎳濃度及運(yùn)行參數(shù)根據(jù)需要具體設(shè)計(jì)如下。

1.2.1 pH對(duì)鎳處理效果的影響 鎳處理濃度為" " 1 mg/L，溫度為室溫，pH設(shè)計(jì)為5、6、7、8、9共5個(gè)梯度，在運(yùn)行后2 d取樣，并測(cè)定鎳濃度。

1.2.2 溫度對(duì)鎳處理效果的影響 鎳處理濃度為" 1 mg/L，pH自然，溫度設(shè)計(jì)為25、30、35、40、45 ℃共 5個(gè)梯度，在運(yùn)行后2 d取樣，并測(cè)定鎳濃度。

1.2.3 鎳初始濃度對(duì)其處理效果的影響 鎳處理濃度設(shè)計(jì)為1、5、10、15、20 mg/L共5個(gè)梯度，pH自然，溫度為室溫，在運(yùn)行后3 d取樣，并測(cè)定鎳濃度、多聚糖及ATP含量。

1.2.4 生物膜處理含鎳廢水隨時(shí)間的變化 鎳處理濃度設(shè)計(jì)為8 mg/L，pH自然，溫度為室溫，在運(yùn)行前取樣，并在之后每隔1 d取樣，測(cè)定鎳濃度、多聚糖及ATP含量。并設(shè)置空白對(duì)照（不添加鎳）。

以上試驗(yàn)中每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 藻菌富集培養(yǎng)及掛膜 取回一定量水樣后，在容積為20 L的有機(jī)玻璃圓桶中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：自然光照下室溫（夏季）培養(yǎng)，用空壓機(jī)進(jìn)行曝氣，同時(shí)加入滅菌的液體培養(yǎng)基16 L用于培養(yǎng)生物膜，之后每10 d加1次培養(yǎng)基至原水位線。培養(yǎng)30 d后，用半軟性填料掛膜15 d，得到藻菌生物膜備用。

1.3.2 藻類鑒別 用壓滴法［13］制作藻類的標(biāo)本片，通過顯微鏡（CX41RF型，奧林帕斯有限公司）放大" 1 000倍觀察。載玻片經(jīng)洗滌劑浸泡24 h后用去離子水清洗再放入15%的硝酸溶液中浸泡24 h，重復(fù)2次后用去離子水洗凈備用。為便于采集生物膜樣品，每片填料上平行懸置2片預(yù)處理的載玻片。

1.3.3 鎳處理試驗(yàn) 根據(jù)處理設(shè)計(jì)，配制含鎳溶液及調(diào)節(jié)相關(guān)參數(shù)。含鎳溶液使用NiCl2·6H2O（分析純），配制濃度為1 000 mg/L的濃縮液，在500 mL培養(yǎng)所得菌液中加入相應(yīng)量的濃縮液，得到不同鎳初始濃度溶液。用1 mol/L NaOH（分析純）和HCl（分析純）調(diào)節(jié)pH，采用精密pH計(jì)（PHS-3C型，北京普析通用儀器有限公司）測(cè)定pH，使用水浴加熱鍋調(diào)節(jié)運(yùn)行溫度。開始運(yùn)行時(shí)每個(gè)處理組加入1片已掛膜且長(zhǎng)勢(shì)相似的藻菌生物膜。

1.3.4 鎳濃度及胞外聚合物含量測(cè)定 從反應(yīng)器中取100 mL水樣，并用鑷子刮取載玻片上約2 cm3生物膜，將二者一起放入離心機(jī)中6 000 r/min、20 ℃條件下離心10 min，取上清液，測(cè)定水樣中重金屬離子含量，并將離心后的生物膜分成2份，分別稱取重量并測(cè)定生物膜中多聚糖和ATP含量。

鎳濃度測(cè)定采用火焰法［14］，取100.0 mL水樣放入150 mL錐形燒杯中，加入硝酸5 mL，在電熱板上加熱消解（不要沸騰），蒸發(fā)至10 mL左右，再加入5 mL硝酸和2 mL高氯酸繼續(xù)消解，至1 mL左右，取下冷卻，并用水稀釋至100 mL標(biāo)線，樣品經(jīng)過針頭過濾器過濾后，用原子吸收光譜儀（AnaLyst 800型，珀金埃爾默儀器有限公司）測(cè)定鎳濃度。取0.2%硝酸100 mL，按上述相同的程序操作，以此為空白樣。

多聚糖的測(cè)定根據(jù)苯酚-硫酸法測(cè)定［15］，將離心后的1份生物膜放入10 mL試管中，加入1 mL去離子水并充分混合，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1 mL，搖勻后迅速加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的硫酸溶液，在黑暗中反應(yīng)10 min，再振蕩10 s。將試管置于30 ℃水浴10 min后，使用紫外分光光度計(jì)（Tu-1901型，肇慶市高能達(dá)化工有限公司）在" " "490 nm處比色測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出多聚糖濃度。

ATP的測(cè)定采用間接測(cè)定法［16］，即用含磷量測(cè)ATP。將離心后的1份生物膜加入裝有1 mL去離子水的試管中，完全混合后加入2.5 mL 95%的硫酸，然后蓋上紗布，用繩扎緊，置于高壓鍋加壓，溫度128 ℃，15 min后取出，室溫下冷卻后，加1～2滴30%過氧化氫溶液，搖勻，用2 mL去離子水稀釋，然后各試管加定磷試劑3 mL，置于45 ℃水浴25 min，取出冷卻至室溫，在紫外分光光度計(jì)上660 nm處比色測(cè)定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出ATP濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

吸附量=（初始濃度-吸附后濃度）×容量

去除率=吸附量/初始總量×100%

利用DPS 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻菌生物膜的培養(yǎng)及鑒別

藻菌富集及掛膜流程如圖1a所示，隨著富集時(shí)間的增加，水樣逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色，藻類含量增加明顯，隨后在有機(jī)玻璃圓筒中用半軟性填料掛膜，掛膜15 d后，水樣顏色為黃綠色，掛膜30 d后，水樣呈深綠色，此時(shí)填料上已明顯附著一層藻菌生物膜。

填料掛膜過程如圖1b所示，取有機(jī)玻璃圓筒中水樣，顯微鏡下放大1 000倍，可觀察到淡綠色、球形或橢圓形、單細(xì)胞或無一定細(xì)胞數(shù)目的群體，對(duì)比《微生物的鑒別與圖譜》，此類微生物符合綠藻門小球藻屬微生物的典型特征，是一種較為常見的可從溶液中吸附重金屬的微生物。

2.2 處理參數(shù)對(duì)生物膜處理鎳效果的影響

藻菌生物膜在不同處理?xiàng)l件下對(duì)鎳的處理效果如圖2所示，3種參數(shù)中，pH對(duì)鎳處理效果影響較為明顯，而溫度對(duì)鎳處理效果影響較小，生物膜處理Ni2+的效果受Ni2+初始濃度影響明顯。隨著3種參數(shù)的升高，鎳處理效果皆表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。

由圖2a可以看出，當(dāng)Ni2+初始濃度為1 mg/L、溫度為35 ℃的條件下處理1 d時(shí)，隨著pH的升高，Ni2+的去除率增大；當(dāng)pH為8時(shí)，Ni2+的去除率達(dá)到最大，為38.07%，吸附量為0.190 mg；當(dāng)pH為9時(shí)，其去除率迅速下降到31.01%。當(dāng)pH為6～8時(shí)，去除效果較好。由圖2b可以看出，在Ni2+初始濃度為1 mg/L，pH為7的條件下處理1 d，隨著溫度的升高，去除率緩慢升高，并在溫度為35 ℃時(shí)達(dá)到最高值，為36.43%，吸附量為0.182 mg，之后隨著溫度的升高而迅速降低。由圖2c可以看出，處理2 d后，去除率隨著Ni2+初始濃度的升高，由Ni2+初始濃度為1 mg/L時(shí)的71.26%下降至Ni2+初始濃度為20 mg/L時(shí)的5.62%；但吸附量卻由Ni2+初始濃度為1 mg/L時(shí)的0.356 mg升高至Ni2+初始濃度為10 mg/L時(shí)的2.358 mg，并最終在Ni2+初始濃度為20 mg/L時(shí)下降至0.562 mg。

2.3 生物膜處理含鎳廢水的動(dòng)力學(xué)擬合

由圖3可以看出，廢水中鎳含量持續(xù)減少，去除率持續(xù)增加。廢水中鎳濃度在反應(yīng)器運(yùn)行后1 d達(dá)4.879 mg/L，去除率達(dá)39.01%；在運(yùn)行后3 d基本達(dá)到穩(wěn)定，鎳濃度達(dá)2.308 mg/L，去除率達(dá)71.15%；在運(yùn)行后6 d鎳濃度降至最低，為1.802 mg/L，去除率達(dá)最高，為77.48%。

對(duì)藻菌生物膜處理含鎳廢水的過程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)擬合，結(jié)果如圖4所示，一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型都能較好地驗(yàn)證數(shù)據(jù)。動(dòng)力學(xué)模型用方程式表示，如表1所示，一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的回歸系數(shù)（R2）分別為0.955 2和0.955 0，擬合效果較好。結(jié)果表明，藻菌生物膜在反應(yīng)器運(yùn)行后3 d能較高效地處理含鎳廢水。

2.4 含鎳廢水對(duì)生物膜胞外聚合物的影響

由圖5a可以看出，處理含鎳廢水的反應(yīng)器中生物膜多聚糖含量比空白水樣中高，空白水樣中的多聚糖隨時(shí)間的延長(zhǎng)而穩(wěn)步上升，而處理含鎳廢水的反應(yīng)器中生物膜多聚糖含量從0 d的0.53 mg/（mL·g）增加到4 d的1.42 mg/（mL·g）（最大值），并最終在" "6 d下降至0.87 mg/（mL·g）。

生物膜ATP的變化如圖5b所示，與多聚糖不同，處理含鎳廢水的反應(yīng)器中生物膜ATP含量總是低于空白水樣，并在24 h內(nèi)從2.81 mg/（mL·g）急劇下降至1.23 mg/（mL·g），并最終上升，在4 d時(shí)達(dá)5.16 mg/（mL·g），隨后趨于穩(wěn)定。

不同鎳初始濃度對(duì)藻菌生物膜胞外聚合物含量的影響如圖6所示，隨著鎳初始濃度的增加，生物膜多聚糖含量和ATP含量都呈下降的趨勢(shì)。分別從鎳初始濃度1 mg/L時(shí)的1.20 mg/（mL·g）和4.03 mg/（mL·g），下降至鎳初始濃度為20 mg/L時(shí)的0.56 mg/（mL·g）和0.37 mg/（mL·g）。

縱觀藻菌生物膜處理含鎳廢水中生物膜胞外聚合物含量的變化，整體而言，隨處理含鎳廢水時(shí)間的延長(zhǎng)，多聚糖含量和ATP含量都呈升高的趨勢(shì)，而隨著處理鎳初始濃度的增加，二者都呈下降的趨勢(shì)。

3 小結(jié)與討論

運(yùn)行參數(shù)如pH、溫度及離子濃度都會(huì)對(duì)藻菌生物膜處理重金屬的效果造成明顯的影響［17］。研究表明，藻類細(xì)胞表面的自由位點(diǎn)數(shù)量是由pH控制的［18］，同時(shí)，對(duì)于胞外聚合物，強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件都會(huì)抑制其對(duì)重金屬的處理效果［19］。當(dāng)pH升高至8時(shí)，鎳處理效果上升至最高，并隨著pH進(jìn)一步升高而明顯下降。這主要是由于當(dāng)溶液pH為酸性時(shí)，溶液中的H+與帶正電的鎳離子對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，不利于水中鎳離子的去除；而且由于細(xì)胞壁上的羧基、磷酸基團(tuán)、羥基、胺基等表面官能團(tuán)在pH較小時(shí)是質(zhì)子化的［20］，與鎳離子靜電相斥，不利于水中鎳離子的去除；且酸性條件也不利于藻類正常生存代謝［21］。當(dāng)pH增大時(shí)，減弱了H+的競(jìng)爭(zhēng)及官能團(tuán)與鎳離子的靜電斥力，有利于藻類正常代謝及對(duì)水中鎳離子的去除。當(dāng)pH過高時(shí)，藻類死亡率升高，將減少胞外多聚物的釋放，削弱對(duì)鎳的處理效果。

溫度是影響微生物生長(zhǎng)的重要因素之一［22］，在處理含鎳廢水過程中，溫度為25～35 ℃時(shí)去除率較高，其隨溫度變化波動(dòng)不大，最適溫度為35 ℃左右，這是因?yàn)樵诖藴囟葏^(qū)間，微生物能較好地生長(zhǎng)代謝，且由于重金屬吸附屬于放熱反應(yīng)［23］，所以隨溫度的升高去除率有微小的上升。但當(dāng)溫度過高時(shí)，藻菌生物膜代謝生長(zhǎng)會(huì)受到嚴(yán)重影響，此時(shí)這種影響在整個(gè)作用系統(tǒng)中占據(jù)負(fù)面的主導(dǎo)地位，處理重金屬的效果將明顯減弱。

重金屬初始濃度不僅主導(dǎo)著生物膜的吸附量、去除率，同時(shí)也明顯影響微生物的生長(zhǎng)代謝［24］。隨著鎳初始濃度的升高，生物膜吸附量先升高后下降，吸附量的升高是由于溶液中離子總量增加導(dǎo)致的富集增加，而隨后的減小則主要是由于過量的鎳離子已經(jīng)對(duì)藻菌生物膜產(chǎn)生了明顯的毒害作用。在較高的重金屬背景下，藻類生物活性降低，死亡率上升，同時(shí)藻菌共生體分泌的胞外聚合物減少，影響去除效率［25］，不同鎳濃度下的胞外聚合物含量變化也證明了這一點(diǎn)；同時(shí)，在DLVO理論中，當(dāng)離子濃度過高時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)抗凝聚作用，也會(huì)導(dǎo)致吸附能力降低［26］。

在動(dòng)力學(xué)研究中，除了發(fā)現(xiàn)藻菌生物膜表現(xiàn)出在3 d左右達(dá)到吸附平衡外，藻菌生物膜的胞外聚合物含量變化更能體現(xiàn)生物膜對(duì)鎳脅迫的響應(yīng)。與空白水樣相比，由于鎳離子的刺激，生物膜分泌出更多的多聚糖，而隨著時(shí)間的變化，生物膜中多聚糖在運(yùn)行后4 d達(dá)到最大值，而后開始緩慢下降，一方面說明由于鎳離子的刺激使得生物膜分泌更多的多聚糖等胞外聚合物以保護(hù)細(xì)胞在不利環(huán)境下的活性，大量微生物及植物都具備這樣的響應(yīng)機(jī)制［27］；另一方面，生物膜分泌的多聚糖含量與鎳的去除率呈正相關(guān)，這可能的原因是多聚糖中的羥基等官能團(tuán)能夠直接結(jié)合水中的重金屬離子［28］，因此多聚糖在鎳去除中扮演著重要角色。含鎳水樣中生物膜ATP含量整體比空白水樣小，這是由于鎳對(duì)微生物有一定的毒害作用，在加入鎳離子24 h內(nèi)，ATP含量明顯減少，隨后由于生物膜分泌的胞外聚合物又提供了能緩沖重金屬毒性的微環(huán)境，導(dǎo)致生物膜微生物增多，活性增強(qiáng)，ATP含量逐漸升高。

由于微生物修復(fù)處理重金屬污染所具備的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其已逐漸成為污染修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，通過城市湖水水樣中藻類的富集掛膜得到藻菌生物膜，其對(duì)含鎳廢水具有良好的處理效果。通過不同處理參數(shù)下的運(yùn)行，得出在pH為8、溫度為35 ℃左右時(shí)對(duì)鎳的去除效果較好，可在" "3 d左右達(dá)到吸附平衡，且生物膜對(duì)鎳的耐受值為10 mg/L。同時(shí)通過研究胞外聚合物含量的變化，鎳離子去除率在4 d時(shí)基本達(dá)到最高，多聚糖含量也在4 d時(shí)達(dá)到最高，結(jié)合鎳離子去除率和多聚糖含量隨處理時(shí)間的變化，可以得出二者呈一定程度的正相關(guān)關(guān)系。本研究證明了藻菌生物膜在重金屬處理中的應(yīng)用價(jià)值。

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