摘要：通過對煙草連作病害土壤、連作非病害土壤及新墾植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間的差異性比較，為以微生物手段減少煙草連作病害提供一定的理論依據(jù)。采用宏基因組高通量測序技術(shù)，測定分析三類土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，連作病害土壤細(xì)菌總OTUs與獨(dú)有OTUs最多，群落結(jié)構(gòu)相似，同源性高；連作病害土壤中的藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鐵礦沙單孢菌屬（Arenimonas）、厭氧繩菌屬（Bellilinea）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）占比顯著高于連作非病害土壤和新墾土壤。連作非病害土壤樣本間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，同源性較低。新墾土壤細(xì)菌慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、酸土單胞菌屬（Aciditerrimonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）5個(gè)屬所占比例較高，但硝化螺旋菌屬（Nitrospira）占比較低，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)各具自身特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：煙草；連作植煙土壤；病害土壤；宏基因組；細(xì)菌群落

中圖分類號：S154.37；S572" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）03-0047-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.03.009 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Comparison on differences of bacteria community between tobacco continuous cropping diseased soil and continuous cropping non-diseased soil

DI Hui-hui， WANG Rui， TAN Jun， PENG Wu-xing

（Enshi Tobacco Company of Hubei Tobacco Corporation， Enshi" 445000， Hubei， China）

Abstract： The differences of bacteria community structure among tobacco continuous cropping diseased soil， continuous cropping non-diseased soil and newly cultivated soil were compared， so as to provide a theoretical basis for reducing tobacco continuous cropping diseases through microbial means. Metagenome high-throughput sequencing technology was used to compare bacterial communities of three types of soils. The results showed that， the number of total and unique OTUs of bacteria in continuous cropping diseased soil was the highest， and the bacterial community was very similar and had high homology. Proportions of Cyanobacteria， Bacteroides， Pseudomonas， Arenimonas， Bellilinea， Arthrobacter， Flavobacterium and Nocardioids were significantly higher in continuous cropping diseased soil than those in continuous cropping non-diseased soil and newly cultivated soil. The bacterial community structure of continuous cropping non-diseased soil was quite different， and the homology was low. Bradyrhizobium， Aciditerrimonas， Mycobacterium， Sphingomonas， and Rhodoplanes had relatively high proportions， but the proportion of Nitrospira was low in newly cultivated soil， and the bacterial community structure had its own characteristics.

Key words： tobacco； continuous cropping tobacco-growing soil； diseased soil； metagenome； bacteria community

受耕地面積及其他經(jīng)濟(jì)作物發(fā)展等因素限制，煙葉生產(chǎn)中連作已經(jīng)成為一個(gè)普遍現(xiàn)象［1-3］。煙草連作常會(huì)導(dǎo)致煙田病害暴發(fā)或煙株生長發(fā)育不良，給煙葉生產(chǎn)和煙農(nóng)收入造成巨大損失［4-6］。有研究表明，連作可以影響根際土壤微生物區(qū)系［7-9］，造成病害暴發(fā)的根本原因也在于土壤中微生物區(qū)系的失衡，病原物激增［10，11］。土壤微生物對植物健康生長具有重要作用［12-14］，良好的根際微生態(tài)可促進(jìn)煙株根系發(fā)育，增強(qiáng)根系活力。國內(nèi)外對煙草連作障礙土壤的微生物研究報(bào)道較多，但多集中于對連作障礙土壤的微生物分布特點(diǎn)研究［15-17］，而將同一土壤類型的連作病害煙田、連作非病害煙田、新墾煙田間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行比較的研究報(bào)道較少。探明煙草連作病害土壤與非病害土壤間的細(xì)菌群落差異，對通過微生物技術(shù)手段調(diào)控連作病害的發(fā)生具有重要意義。

宏基因組技術(shù)可以避免土壤中可培養(yǎng)微生物有限并且培養(yǎng)復(fù)雜的難題，而且可以為微生物多樣性研究提供更全面的信息［18-20］。為此，本研究通過土壤宏基因組技術(shù)，從土壤中提取微生物基因組，建立基因組文庫，分析同一生態(tài)環(huán)境、同一土壤條件下連作病害、連作非病害及新墾植煙土壤間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，以期為通過微生物技術(shù)手段促進(jìn)連作煙田的健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于湖北省恩施州宣恩縣椒園鎮(zhèn)， 屬于亞熱帶濕潤氣候，土壤為黃棕壤，烤煙品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N云煙87。選取10塊連續(xù)種煙10年以上且土傳病害較為嚴(yán)重的煙田，命名為連作病害土壤，編號為CCO1至CCO10；選取8塊連續(xù)種煙10年以上且沒有顯著病害發(fā)生的煙田，命名為連作非病害土壤，編號為DSH1至DSH8；選取5塊土壤類型一致、地貌相似的地塊開荒種煙，命名為新墾土壤，編號為EN1至EN5。各土壤樣品屬于同一小氣候、同一土壤分類單元。各地塊不進(jìn)行土傳病害防治，其他按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)方案的生產(chǎn)措施進(jìn)行煙葉生產(chǎn)栽培。

1.2 土樣的采集與制備

在煙葉采收結(jié)束后，以人工多點(diǎn)混合的方式取樣，取土鉆統(tǒng)一采用管形不銹鋼土鉆，取樣層次為耕作層，深度0～20 cm，采用“S”形采樣，每個(gè)地塊取15～20個(gè)樣點(diǎn)，制成一個(gè)混合樣。土樣裝入保鮮袋放入低溫冷藏箱（-20 ℃）中保存?zhèn)溆?，以提取土壤微生物基因組DNA。

1.3 土壤宏基因組測序

土壤樣品送至北京諾禾致源科技有限公司進(jìn)行宏基因組測序，DNA提取采用DNA抽提試劑盒Fast DNA? SPIN Kit for Soil（Qbiogene，Inc. USA）進(jìn)行；16S rRNA的V3和V4區(qū)擴(kuò)增采用338F（5′-ACTCCT ACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對；采用Illumina-miseq平臺(tái)（Illumina Inc.，美國）進(jìn)行擴(kuò)增測序；使用FASTX Toolkit 0.0.13軟件包對原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行初步過濾，將序列相似性達(dá)97%的序列聚類生成操作分類單元OTU。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Mothur軟件進(jìn)行測序序列去重，以數(shù)據(jù)庫GreenGene、Silva進(jìn)行篩選比對，再利用Mothur軟件做Rarefaction分析、計(jì)算Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)等常用的多樣性指數(shù)。

利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌α-多樣性研究

利用宏基因組技術(shù)對3類土壤樣品進(jìn)行高通量測序，由圖1可知，測序深度已達(dá)到飽和，結(jié)果能真實(shí)反映樣本條件。分別將細(xì)菌的OTUs、香農(nóng)指數(shù)和Chao1指數(shù)在不同土壤類型中進(jìn)行多重比較，由表1可知，土壤樣品3個(gè)指標(biāo)的平均值均為連作病害土壤最高，新墾土壤最低，連作非病害土壤居中，且各土壤類型變化幅度相似，均為連作病害土壤變幅最小，連作非病害土壤變幅最大，表明連作病害土壤的細(xì)菌群落數(shù)量、多樣性具有較高的相似性，而連作非病害土壤樣本間細(xì)菌群落數(shù)量、多樣性差異較大。連作病害土壤的OTUs、香農(nóng)指數(shù)與連作非病害土壤差異達(dá)顯著水平（Plt;0.05），與新墾土壤差異達(dá)極顯著水平（Plt;0.01）；連作非病害土壤OTUs、香農(nóng)指數(shù)與新墾土壤無顯著差異。Chao 1指數(shù)各樣本間無顯著差異。

2.2 土壤細(xì)菌門水平群落組成

如表2所示，在3類土壤樣品中占比較大的細(xì)菌門類是變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。比較同一門類細(xì)菌在不同土壤中的差異，結(jié)果表明，連作病害土壤中藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）所占比例極顯著高于連作非病害及新墾土壤，擬桿菌門（Bacteroidetes）顯著高于連作非病害土壤；新墾土壤中浮霉菌門（Planctomycetes）比例極顯著高于連作病害土壤和連作非病害土壤，而硝化螺旋菌門（Nitrospirae）比例則極顯著低于二者。

2.3 土壤細(xì)菌屬水平群落組成

連作病害、連作非病害、新墾土壤三類土壤中共有的細(xì)菌屬類超過500種，比較土壤樣品中豐富度前20的菌屬在不同土壤類型中的差異。從表3可以看出，連作病害土壤中假單胞菌屬（Pseudomonas）、鐵礦沙單孢菌屬（Arenimonas）、厭氧繩菌屬（Bellilinea）3個(gè)屬的豐富度與連作非病害土壤及新墾土壤差異極顯著；節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）3個(gè)屬豐富度與連作非病害土壤及新墾土壤差異顯著；假單胞菌屬、鐵礦沙單孢菌屬、厭氧繩菌屬、節(jié)桿菌屬、黃桿菌屬（Flavobacterium）、類諾卡氏菌屬豐富度在連作非病害土壤及新墾土壤中均無顯著差異，表明這6個(gè)屬豐富度增加是連作病害土壤的獨(dú)有現(xiàn)象。新墾土壤中慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、酸土單胞菌屬（Aciditerrimonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）3個(gè)菌屬豐富度極顯著高于煙草連作的土壤，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）2個(gè)菌屬豐富度顯著高于煙草連作的土壤，由此可見煙草連作可顯著降低以上5個(gè)菌屬數(shù)量。

2.4 韋恩圖分析

如圖2所示，各土壤樣本細(xì)菌總OTUs與獨(dú)有OTUs均以連作病害土壤最多，連作非病害土壤次之，新墾土壤最低；連作病害土壤獨(dú)有OTUs分別較連作非病害土壤、新墾土壤高出14.45%和245.45%；連作病害土壤與新墾土壤二者共有細(xì)菌的OTUs為2 342，連作非病害土壤與新墾土壤二者共有細(xì)菌的OTUs為1 556，前者較后者高出50.51%；新墾土壤細(xì)菌的總OTUs與獨(dú)有OTUs均為最低。

2.5 細(xì)菌PCoA分析

圖3為土壤樣品的PCoA分析（Unweighted），從圖3可以看出，三類土壤已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的區(qū)分度，連作病害土壤的10個(gè)樣品更具有聚集性，少數(shù)樣本有部分重疊；連作非病害土壤8個(gè)樣品彼此分散性較大，樣品DSH08距離最遠(yuǎn)；新墾土壤的5個(gè)樣品彼此稍微分離。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，連作病害土壤細(xì)菌的總OTUs與獨(dú)有OTUs均最多，連作非病害土壤次之，新墾土壤最低；連作病害土壤中藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門2個(gè)門類及假單胞菌屬、鐵礦沙單孢菌屬、厭氧繩菌屬、節(jié)桿菌屬、黃桿菌屬、類諾卡氏菌屬6個(gè)菌屬所占比例顯著高于其他兩類土壤。煙草連作可顯著降低土壤慢生根瘤菌屬、酸土單胞菌屬、分枝桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、紅游動(dòng)菌屬5個(gè)屬所占比例，明顯提高硝化螺旋菌屬（Nitrospira）比例。連作病害土壤的細(xì)菌群落組成更具有相似性，同源性更高；連作非病害土壤樣本間細(xì)菌群落差異性較大；新墾土壤由于未受到人類長期耕作的影響，其土壤細(xì)菌群落環(huán)境更具有自身特點(diǎn)。

Yuan等［21］對8個(gè)國家758個(gè)病害或健康的土壤樣本進(jìn)行微生物群落分析，并建立了土壤枯萎病預(yù)測模型，研究結(jié)果表明，病害土壤比健康土壤具有更多的獨(dú)有OTUs，這與本研究中連作病害土壤樣本細(xì)菌總OTUs與獨(dú)有OTUs最多相一致。連作病害土壤中的細(xì)菌群落數(shù)量、多樣性、豐富度均較連作非病害土壤和新墾土壤增加，這可能是由于連作病害土壤的典型表現(xiàn)是細(xì)菌性土傳病害青枯病暴發(fā)嚴(yán)重，從而造成土壤微生物群落改變，使其相對連作非病害土壤中相關(guān)的細(xì)菌數(shù)量、多樣性及豐富度增加；國內(nèi)外關(guān)于施肥對土壤微生物群落影響研究較多，Marschnera等［22］研究表明，施用肥料能顯著影響土壤微生物的生長，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；侯曉杰等［23］研究表明，一定條件下合理配施肥料可顯著增加微生物多樣性；樊曉剛等［24］研究表明，短期施肥對土壤微生物影響較小。新墾土壤僅在試驗(yàn)開展當(dāng)年施用了肥料，其細(xì)菌群落多樣性較長期施用肥料的連作土壤相對單一，這與已有研究結(jié)論一致。高林等［25］研究認(rèn)為，連續(xù)種植造成土壤細(xì)菌群落多樣性、豐富度降低，其種植年限是主要差異，而本研究比較的是已無種植年限差異的連作病害土壤與連作非病害土壤，是否發(fā)病是主要差異，因此結(jié)論并不矛盾。連作病害土壤中含有較高數(shù)量的藍(lán)細(xì)菌門和擬桿菌門，以及假單胞菌屬、鐵礦沙單孢菌屬、厭氧繩菌屬、節(jié)桿菌屬、黃桿菌屬和類諾卡氏菌屬。藍(lán)細(xì)菌門具有固氮作用，擬桿菌門則包含大量的病原菌，厭氧繩菌屬適宜在無氧環(huán)境生存，節(jié)桿菌屬和類諾卡氏菌屬具有降解煙堿的功能，可見連作病害土壤中不僅含有大量的病原菌，而且土壤環(huán)境適宜固氮菌、厭氧細(xì)菌及煙堿降解細(xì)菌生存。在煙區(qū)土地輪作較難實(shí)現(xiàn)的狀況下，采取有針對性的技術(shù)手段［26-29］降低連作病害土壤與連作非病害土壤間的微生物群落差異是解決煙草連作病害發(fā)生的一項(xiàng)重要措施。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 張仕祥， 過偉民， 李輝信， 等. 煙草連作障礙研究進(jìn)展［J］. 土壤，2015，47（5）：823-829.

［2］ 劉 曄，姜 瑛，王國文，等. 不同連作年限對植煙土壤理化性狀及微生物區(qū)系的影響［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，32（13）：136-140.

［3］ 焦永吉，程 功，馬永健，等. 煙草連作對土壤微生物多樣性及酶活性的影響［J］. 土壤與作物，2014，3（2）：56-62.

［4］ 岳冰冰. 烤煙連作改變了根際土壤微生物的多樣性［D］.哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)，2012.

［5］ 石秋環(huán)， 焦 峰， 耿 偉， 等. 烤煙連作土壤環(huán)境中的障礙因子研究綜述［J］.中國煙草學(xué)報(bào)， 2009， 15（6）：81-84.

［6］ 施河麗， 向必坤， 譚 軍， 等. 煙草青枯病發(fā)病煙株根際土壤細(xì)菌群落分析［J］. 中國煙草學(xué)報(bào)，2018， 24（5）：57-65.

［7］ 陳丹梅，段玉琪，楊宇虹，等.長期施肥對植煙土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（17）：3424-3433.

［8］ 劉株秀， 劉俊杰， 徐艷霞， 等. 不同大豆連作年限對黑土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2019，39（12）： 4337-4346.

［9］ 許自成，王發(fā)展，金伊楠，等. 不同連作年限烤煙根際土壤真菌群落18S rDNA-PCR-DGGE分析［J］. 中國土壤與肥料，2019（4）：39-46.

［10］ 侯 慧， 董 坤， 楊智仙， 等.連作障礙發(fā)生機(jī)理研究進(jìn)展［J］.土壤， 2016， 48（6）：1068-1076.

［11］ 穰中文，朱三榮，田 峰， 等. 不同種植模式煙田土壤細(xì)菌種群特征與青枯病發(fā)生的關(guān)系［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2018， 44（1）：33-38.

［12］ 李 倩， 張常興，程玉淵， 等. 微生態(tài)制劑對烤煙連作土壤酶活性及其產(chǎn)量的影響［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019， 47（1）：43-48.

［13］ 賈丙瑞， 周廣勝， 王風(fēng)玉，等. 土壤微生物與根系呼吸作用影響因子分析［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2005， 16（8）：1547-1552.

［14］ 劉艷霞， 李 雨， 李 想，等. 烤煙根際土壤微生物對根系酚酸類物質(zhì)的響應(yīng)［J］. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)， 2019， 25（8）：1373-1382.

［15］ 郭 利， 王學(xué)龍， 陳永德，等. 煙草連作對煙田土壤微生物的影響［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 48（10）：2443-2445.

［16］ 柯文輝. 煙草連作障礙的根際微生態(tài)研究［D］. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)， 2009.

［17］ 楊宇虹， 陳冬梅， 晉 艷，等. 長期連作不同施鉀處理下烤煙根際土壤微生物功能多樣性的變化研究［A］. 云南省煙草學(xué)會(huì). 云南省煙草學(xué)會(huì)農(nóng)業(yè)專業(yè)委員會(huì)優(yōu)秀論文集（2011～2012）［C］. 昆明：云南省煙草學(xué)會(huì)農(nóng)業(yè)專業(yè)委員會(huì)2011—2012年學(xué)術(shù)年會(huì)，2012. 97-102.

［18］ 常安然， 李 佳， 張 聳， 等. 基于宏基因組學(xué)16S rDNA測序?qū)煵莞H土壤細(xì)菌群落組成分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)， 2017， 19（2）： 43-50.

［19］ 沈菊培，張麗梅，鄭袁明，等. 土壤宏基因組學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2007， 18（1）：212-218.

［20］ 張藝潔， 邵慧芳， 張 珂， 等. 基于高通量測序研究施肥對連作植煙土壤環(huán)境及微生物的影響［J］. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)， 2018， 20（5）：16-25.

［21］ YUAN J， WEN T， ZHANG H， et al. Predicting disease occurrence with high accuracy based on soil macroecological patterns of Fusarium wilt［J］. The ISME journal， 2020，14（12）：2936-2950.

［22］ MARSCHNERA P， KANDELER E， MARSCHNER B. Structure and function of the soil microbial community in a long-term fertilizer experiment［J］.Soil biology and biochemistry， 2003， 35（3）： 453-461.

［23］ 侯曉杰， 汪景寬， 李世朋. 不同施肥處理與地膜覆蓋對土壤微生物群落功能多樣性的影響［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27（2）： 655-661.

［24］ 樊曉剛， 金 軻， 李兆君， 等. 不同施肥和耕作制度下土壤微生物多樣性研究進(jìn)展［J］. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2010，16（3）：744-750.

［25］ 高 林，王新偉，申國明，等.不同連作年限植煙土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)差異［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2019，21（8）：147-152.

［26］ 焦曉光， 高崇升， 隋躍宇， 等.不同有機(jī)質(zhì)含量農(nóng)田土壤微生物生態(tài)特征［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（18）：3759-3767.

［27］ 曹仕明，廖 浩， 張 翼， 等.施用腐熟秸稈肥對烤煙根系土壤微生物和酶活性的影響［J］.中國煙草學(xué)報(bào)，2014，20（2）：75-79.

［28］ 楊宇虹， 陳冬梅， 晉 艷， 等. 不同肥料種類對連作煙草根際土壤微生物功能多樣性的影響［J］. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（1）： 105-111.

［29］ 劉金光， 李孝剛， 王興祥. 連續(xù)施用有機(jī)肥對連作花生根際微生物種群和酶活性的影響［J］.土壤， 2018， 50（2）：305-311.