摘要 目的：分析2型糖尿?。═2DM）病人內(nèi)皮型一氧化氮合酶3（NOS3）基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病風(fēng)險的分析。方法：納入2019年12月—2021年12月于我院就診的302例T2DM病人為研究對象，根據(jù)是否合并冠心病分為單純T2DM組（224例）和合并冠心病組（78例）。收集病人臨床資料、實驗室指標(biāo)、影像學(xué)資料，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)檢測NOS3 G894T、NOS 3T786C多態(tài)性，對年齡、性別、吸煙史、體質(zhì)指數(shù)、冠心病家族史、基礎(chǔ)疾病、降糖方案進行傾向性評分匹配后采用Logistic回歸分析T2DM病人NOS3基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。結(jié)果：兩組經(jīng)傾向性評分匹配后有56例配對成功，匹配后一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組載脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ）、同型半胱氨酸（Hcy）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、NOS3 G894T、NOS3 T786C多態(tài)性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Logistic回歸分析顯示，ApoAⅠ（OR＝620.821）、Hcy（OR＝1.823）、NOS3 G894T中TT型（OR＝5.157）、NOS3 T786C中CC型（OR＝5.342）是糖尿病合并冠心病的危險因素（P＜0.05）。結(jié)論：T2DM病人NOS 3G894T、NOS3 T786C多態(tài)性與冠心病發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，臨床可針對性相關(guān)指標(biāo)進一步干預(yù)。

關(guān)鍵詞 冠心?。?型糖尿?。粌?nèi)皮型一氧化氮合酶3；基因多態(tài)性；傾向性評分

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.16.020

心血管并發(fā)癥是導(dǎo)致2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）病人死亡的主要原因，與內(nèi)皮功能密切相關(guān)［1-3］。一氧化氮（NO）可調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞增殖和遷移、血管張力、內(nèi)皮通透性及內(nèi)皮-白細胞相互作用，是內(nèi)皮抗動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。內(nèi)皮型一氧化氮合酶3（NOS3）位于染色體7q35-36上的基因編碼，可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能，維持血管穩(wěn)態(tài)，NOS3遺傳多態(tài)性已證實對NO水平、血脂有影響，且與高血壓［4］和糖尿病足潰瘍［5］相關(guān)，但與冠心病風(fēng)險之間的關(guān)系尚未明確。有研究顯示，敲除小鼠中NOS3基因引起嚴(yán)重的血管內(nèi)皮功能障礙，并導(dǎo)致典型的冠心病異常表型發(fā)展［6］。一氧化氮合酶（NOS）表達上調(diào)與冠心病的良好保護作用有關(guān)［7］。NOS3多態(tài)性可能是T2DM病人合并冠心病的遺傳標(biāo)志物。本研究進行T2DM病人NOS3基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病風(fēng)險的傾向性評分匹配分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國2型糖尿病防治指南（2017年版）》［8］中T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)，空腹血糖（FBG）≥7.0 mmol/L；或口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）2h血糖（2 hPG）≥11.1 mmol/L；符合《中國心血管病預(yù)防指南》中冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，經(jīng)冠狀動脈造影確診；年齡35～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿病、妊娠糖尿??；合并糖尿病急性代謝紊亂并發(fā)癥；嚴(yán)重肝、腎功能異常；合并心臟結(jié)構(gòu)瓣膜性病變。納入2019年12月—2021年12月我院T2DM病人302例為研究對象，收集病人一般資料、表型影響因素與基因型影響因素。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，病人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料

收集病人年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、治療方案。

1.2.2 實驗室指標(biāo)

1）FBG、2 hPG：入組時抽取空腹靜脈血，置于NaF抗凝管1管中，采用AU5800型全自動生化儀（美國貝克曼庫爾特公司）及配套試檢測FBG和2 hPG。2）糖化血紅蛋白（HbA1c）：采集病人指尖全血5 μL，置于凍存盒中，在2～6 ℃環(huán)境下保存，采用糖化血紅蛋白測定儀（VariantⅡ型）以離子交換高壓液體色譜法測量HbA1c水平。3）脂代謝水平：將抽取的靜脈血置于促凝管1管離心分離血清，標(biāo)本保存至－40 ℃冰箱備用，測定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ）。4）同型半胱氨酸（Hcy）：抽取空腹靜脈血3 mL，采用熒光偏振免疫分析技術(shù)檢測Hcy水平。5）血尿酸（UA）：抽取靜脈血3 mL，分離提取血清，采用液相層析技術(shù)檢測UA水平。

1.3 影像學(xué)資料

采用PHILIPS HD 11型超聲心動圖測定左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、室間隔厚度（IVST）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、舒張早期最大峰值速度/舒張晚期最大峰值速率（E/A）。采用彩色多普勒超聲診斷儀（HP5500型）進行頸動脈超聲檢查，設(shè)置探頭頻率為4.0～10.0 MHz，病人取仰臥位，充分暴露頸部，確定頸總動脈位置，超聲探頭縱行逐漸由前至后移動尋找最佳顯影位置，橫截面掃描測定血管內(nèi)徑、頸動脈內(nèi)中膜厚度（IMT）及斑塊情況，連續(xù)測量3次，取平均值。踝臂指數(shù)（ABI）測定：采用電子血壓測定儀（U3l型）測定單側(cè)ABI（踝動脈或脛后動脈），即踝動脈的收縮壓和雙側(cè)肱動脈收縮壓最高值的比值，最后確定ABI。

1.4 NOS3基因多態(tài)性

1.4.1 NOS3 G894T多態(tài)性

抽取所有病人空腹靜脈血10 mL，采用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的人外周血DNA提取試劑盒，以飽和酚-氯仿法提取細胞基因組DNA，采用NanoDrop檢測基因組DNA含量，置于－70 ℃環(huán)境下保存。采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物；PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，模板DNA 0.5 μL，5 μL緩沖劑，0.5 μL脫氧核苷三磷酸，正向、反向引物均為0.5 μL，17.25 μL H2O、0.25 μL Taq聚合酶，混勻并進行離心處理；反應(yīng)條件：預(yù)變性5 min（94 ℃）、變性15 s（96 ℃）、退火30 s（60 ℃）、延伸90 s（72 ℃），35次循環(huán)后72 ℃再延伸5 min，用2%瓊脂糖凝膠電泳40min放置擴增產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶BanⅡ1 μL，電泳、溴化乙啶（EB）染色后在7500熒光實時定量PCR判斷基因型。

1.4.2 NOS3 T786C多態(tài)性

以提取的DNA為模板，根據(jù)設(shè)計的引物，采用PCR方法進行特異性擴增；PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，模板0.5 μL，正向、反向引物均為0.5 μL，Buffer 5 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq DNA聚合酶1.25 U；反應(yīng)條件：預(yù)變性5 min（95 ℃）、變性30 s（96 ℃）、退火30 s（60 ℃）、延伸60 s（72 ℃），35次循環(huán)后72 ℃再延伸7 min，PCR產(chǎn)物用3%的瓊脂糖電泳測定擴增結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗；定性資料以例數(shù)、百分比（%）表示，采用χ2檢驗；等級資料采用Wilcoxon秩和檢驗。對年齡、性別、吸煙史、體質(zhì)指數(shù)、冠心病家族史、基礎(chǔ)疾病、降糖方案進行傾向性評分匹配（PSM），利用PSM擴展程序進行：以是否合并冠心病為因變量，各協(xié)變量為自變量，通過Logistic回歸分析估計傾向性評分值，采用1∶1臨近匹配法進行匹配，通過卡鉗值為0.02保證匹配結(jié)果的優(yōu)良性，按照合并冠心病組與單純T2DM組1∶1進行匹配，并繪制PS分布的抖點圖，之后比較組間協(xié)變量的標(biāo)準(zhǔn)差在匹配前后的改變，匹配后的標(biāo)準(zhǔn)差越接近于0，匹配結(jié)果越滿意，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)差異絕對值小于0.1時，認為組間變量的均衡性較好。對匹配后資料進行Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組PSM前后臨床資料比較

PSM前，合并冠心病組年齡、體質(zhì)指數(shù)、冠心病家族史比例、吸煙史比例高于單純T2DM組（P＜0.05）；經(jīng)過PSM后共56例病人配對成功，兩組間協(xié)變量經(jīng)匹配后均達到平衡，經(jīng)PSM各協(xié)變量的均衡性得到了明顯提高（P＞0.05）。詳見表1、圖1。

2.2 PSM后兩組臨床資料比較

合并冠心病組和單純T2DM組ApoAⅠ、Hcy、LVEF、NOS3 G894T多態(tài)性、NOS3 T786C多態(tài)性比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 PSM后冠心病發(fā)病風(fēng)險的多因素分析

以是否合并冠心病為因變量（是＝1，否＝0），Logistic回歸分析結(jié)果顯示：ApoAⅠ（OR＝620.821）、Hcy（OR＝1.823）、NOS3 G894T多態(tài)性TT型（OR＝5.157）、NOS3 T786C多態(tài)性CC型（OR＝5.342）是糖尿病合并冠心病的危險因素。詳見表3、表4。

3 討 論

以冠狀動脈狹窄甚至閉塞引起的心肌缺血或梗死為特征的冠狀動脈疾病是全球范圍內(nèi)死亡和殘疾的主要原因，也是T2DM的常見并發(fā)癥。目前冠心病的確切原因尚未明確。遺傳因素可能在T2DM合并冠心病發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10-11］。首先，廣泛觀察到冠心病的家族聚集性，冠心病的遺傳等級超過50%［12］。其次，先前的遺傳關(guān)聯(lián)研究已發(fā)現(xiàn)大量的遺傳變異和多態(tài)性與T2DM冠心病風(fēng)險的增加有關(guān)，且篩選常見的因果變異已證實是預(yù)測T2DM患冠心病風(fēng)險的有效方法［13］。遺傳易感性對T2DM合并冠心病發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。

在T2DM合并冠心病對遺傳因素研究中，NOS3基因備受關(guān)注，其位于人類染色體7q35～q36區(qū)，長約22kB，包含外顯子26個和內(nèi)含子25個，編碼含有4 052個核苷的mRNA，在單倍體人類基因組中為單一拷貝。NOS3表達的多少和活性的強弱是NO生成多少的決定因素，NO是已知重要的內(nèi)源性血管舒張因子，可維持正常血管功能，也是引起冠狀動脈狹窄的重要原因，故從NOS3基因動態(tài)性方面評價T2DM并發(fā)冠心病發(fā)病風(fēng)險，可能為T2DM并發(fā)冠心病發(fā)病提供依據(jù)。鑒于研究時限較短，故本研究中對納入的研究對象進行PSM后比較，排除了一般資料對T2DM合并冠心病風(fēng)險的影響，從而分析NOS3基因多態(tài)性與冠心病風(fēng)險發(fā)生之間的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，NOS3 T894G多態(tài)性中TT型（OR＝5.157）及NOS3 T786C多態(tài)性中CC型（OR＝5.342）是糖尿病合并冠心病的危險因素。NOS3 G894T在第8號外顯子上，894位堿基G向T突變，相應(yīng)產(chǎn)物第298位上的谷氨酸被天冬氨酸（Glu298Asp）替換，修飾了NOS3的編碼序列，降低了NOS3活性，可調(diào)節(jié)血管擴張和平滑肌增殖功能受損。NOS3 T786C位于NOS3啟動子區(qū)域，-786C等位基因降低可影響NOS3 mRNA表達，進而增加冠心病發(fā)病風(fēng)險。

目前， NOS3基因DNA串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性和單核苷酸多態(tài)性已達16種以上，分別位于編碼區(qū)的774位、894位、5′端的側(cè)翼區(qū)-1474位、-924位、-786位、-691位和第2、4、8、11、12、13、15、18、22、23內(nèi)含子上。其中位于第8號外顯子上，由于894位核苷酸G突變成T（894G/T，rsl799983），導(dǎo)致298位上相應(yīng)的編碼蛋白產(chǎn)物由谷氨酸被替換成天冬氨酸（Glu298Asp）。一項研究調(diào)查了NOS3 4個單核苷酸多態(tài)性（rs891512、rs1799983、rs2070744和rs869109213）與糖尿病風(fēng)險之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，4個單核苷酸多態(tài)性可能為T2DM的遺傳生物標(biāo)志物，而rs1799983、rs2070744和rs869109213多態(tài)性可能有助于T2DM血管并發(fā)癥發(fā)生［14］。rs1799983即G894T，有研究顯示，青年冠心病發(fā)生發(fā)展可能與NOS3 G894T基因多態(tài)性有關(guān)［15］；薈萃分析研究得到類似結(jié)果，即NOS3 G894T多態(tài)性是T2DM合并冠心病的危險因素，尤其在亞洲人群和早發(fā)性心肌梗死病人中［16］。Luo等［17］研究顯示，rs1799983多態(tài)性的T等位基因與NO水平降低和血脂水平異常顯著相關(guān)，rs1799983多態(tài)性與冠心病之間的聯(lián)系可能部分由低NO水平和變異的T等位基因引起的血脂異常介導(dǎo)。雖然G894T位點不位于酶的功能性序列，298位谷氨酸位于a-螺旋的中心，錯義突變導(dǎo)致NOS3的構(gòu)象在此處由a-螺旋變?yōu)榫o密折疊，因此對NOS3蛋白的功能造成影響，降低NOS3活性，導(dǎo)致血小板聚集性增強，進而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。

位于啟動子區(qū)域-786位存在一個單核苷酸突變（T786C，rs2070744），在高血壓、腎病等疾病中被關(guān)注。NOS3的rs2070744多態(tài)性與蘇丹人群中的原發(fā)性高血壓有關(guān)，病人組與對照組有較高的CC基因型頻率［18］；在腎病中，rs2070744是抗IgAN的保護因子［19］。我國漢族人中，rs2070744 C等位基因與冠心病風(fēng)險增加相關(guān)；在糖尿病病人中，rs2070744 C等位基因與冠心病風(fēng)險增加相關(guān)［20］。一項關(guān)于不穩(wěn)定心絞痛病例對照研究發(fā)現(xiàn)，rs2070744基因型多態(tài)性分布在不穩(wěn)定型心絞痛病人（246例）和健康對照人群（189名）中存在差異，且NOS3 rs2070744 TT基因型病人有較高的腰圍（TT與TC＋CC，P＝0.023；TT與CC，P＝0.005）［21］，與NOS3 T786C突變后，NOS3蛋白在Caveolae的定位改變，引起剪切依賴反應(yīng)減少，NOS3調(diào)節(jié)周期的協(xié)調(diào)性遭受損，影響NO濃度有關(guān)，同時說明NOS3基因多態(tài)性在冠心病發(fā)病過程中的重要性。

綜上所述，T2DM病人NOS3 G894T、NOS3 T786C多態(tài)性與冠心病發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。本研究樣本量有限，今后需擴大樣本量，進一步闡明NOS多態(tài)性與微血管病變之間的關(guān)系。

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（收稿日期：2022-06-29）

（本文編輯薛妮）

基金項目 河北省秦皇島科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（No.202004A133，202301A204）；河北省衛(wèi)健委2020年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究項目（No.20201512）

通訊作者 王銳，E-mail：psbywr@yeah.net

引用信息 王蕊，王翠娟，尹福在，等.2型糖尿病病人NOS3基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病風(fēng)險的傾向性評分匹配分析［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（16）：3012-3017.