摘要 目的：觀察鹽酸納洛酮通過(guò)調(diào)控Toll樣受體4（TRL4）/核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）通路對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。方法：培養(yǎng)BV2細(xì)胞，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK）-8測(cè)定不同濃度（0、0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L）鹽酸納洛酮對(duì)BV2細(xì)胞活性的影響。將BV2細(xì)胞分為對(duì)照組、缺氧缺糖誘導(dǎo)組、鹽酸納洛酮低濃度組（0.01 μmol/L）、鹽酸納洛酮高濃度組（5.00 μmol/L）、鹽酸納洛酮高濃度＋TLR4激活劑組（5.00 μmol/L鹽酸納洛酮＋1 mg/L脂多糖）。采用乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒檢測(cè)鹽酸納洛酮對(duì)BV2細(xì)胞的毒性；CCK-8法檢測(cè)鹽酸納洛酮對(duì)BV2細(xì)胞增殖率的影響；倒置顯微鏡觀察BV2細(xì)胞形態(tài)；檢測(cè)BV2細(xì)胞培養(yǎng)上清液一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β水平；逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)BV2細(xì)胞TNF-α mRNA、IL-6 mRNA、IL-1β mRNA水平；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)BV2細(xì)胞TRL4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：濃度為0.01～5.00 μmol/L的鹽酸納洛酮對(duì)BV2細(xì)胞活性無(wú)明顯影響。與對(duì)照組比較，缺氧缺糖誘導(dǎo)組BV2細(xì)胞增殖率及LDH、NO、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA、TRL4、細(xì)胞核NF-κB p65均升高（P＜0.05），細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65水平降低（P＜0.05）；與缺氧缺糖誘導(dǎo)組比較，鹽酸納洛酮低濃度組、鹽酸納洛酮高濃度組BV2細(xì)胞增殖率及LDH、NO、IL-1β、TNF-α、IL-6、 IL-1βmRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA、TRL4、細(xì)胞核NF-κB p65降低（P＜0.05），細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65水平升高（P＜0.05）；與鹽酸納洛酮高濃度組比較，鹽酸納洛酮高濃度＋TLR4激活劑組BV2細(xì)胞增殖率及LDH、NO、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA、TRL4、細(xì)胞核NF-κB p65升高（P＜0.05），細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65水平降低（P＜0.05）。結(jié)論：鹽酸納洛酮可能通過(guò)抑制TRL4/NF-κB通路，降低缺氧缺糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 缺氧缺糖；鹽酸納洛酮；Toll樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子κB通路；BV2細(xì)胞；炎癥反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.16.009

Effect of Naloxone Hydrochloride on the Inflammatory Response of BV2 Cells Induced by Hypoxia and Glucose-deficiency by Regulating TRL4/NF-κB Pathway

LIU Hujun， JIA Fei， ZHANG Chunrui

Yan′an University Affiliated Hospital， Yan′an 716000， Shaanxi， China

Corresponding Author ZHANG Chunrui， E-mail： zhangchunrui99@163.com

Abstract Objective：To investigate the effect of naloxone hydrochloride on the Inflammatory response of BV2 cells induced by hypoxia and glucose-deficiency by regulating Toll-like receptor 4（TRL4）/nuclear transcription factor κB（NF-κB） pathway.Methods：The effects of naloxone hydrochloride at different concentrations（0，0.01，0.10，1.00，5.00，10.00，20.00，40.00 μmol/L） on BV2 cell activity were determined by Cell Counting Kit（CCK）-8 method.BV2 cells were divided into the control group，hypoxia and glucose-deficiency induced group，naloxone hydrochloride low-dose group（0.01 μmol/L），naloxone hydrochloride high-dose group（5.00 μmol/L），and naloxone hydrochloride high-dose＋TLR4 activator group（5.00 μmol/L naloxone hydrochloride＋1 mg/L lipopolysaccharide）.Lactate dehydrogenase（LDH） kit was used to detect the toxicity of naloxone hydrochloride on BV2 cells.Cell counting kit（CCK8） assay was used to detect the effect of naloxone hydrochloride on the proliferation rate of BV2 cells.Inverted microscope was used to observe the morphology of BV2 cells.The levels of nitric oxide（NO），tumor necrosis factor α（TNF-α），interleukin（IL）-6，and IL-1β in the supernatant of BV2 cell culture were detected.The levels of TNF-α mRNA，IL-6 mRNA，and IL-1β mRNA in BV2 cells were detected by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）.The expressions of TRL4/NF-κB pathway-related proteins in BV2 cells were detected by protein immunoblotting（Western Blot）.Results：Naloxone hydrochloride at the concentrations from 0.01 to 5.00 μmol/L showed no significant effect on the activity of BV2 cells.Compared with the control group，the proliferation rate of BV2 cells，LDH，NO，IL-1β，TNF-α，IL-6，IL-1β mRNA，TNF-α mRNA，IL-6 mRNA，TRL4，and cytosolic NF-κB p65 were increased in the hypoxia and glucose-deficiency induced group，and level of cytoplasmic NF-κB p65 was decreased（P＜0.05）.Compared with the hypoxia and glucose-deficiency induced group，the proliferation rate of BV2 cells，LDH，NO，IL-1β，TNF-α，IL-6，IL-1β mRNA，TNF-α mRNA，IL-6 mRNA，TRL4，and cytosolic NF-κB p65 were decreased in the naloxone hydrochloride low-dose group and the naloxone hydrochloride high-dose group，and level of cytoplasmic NF-κB p65 was increased（P＜0.05）.Compared with the naloxone hydrochloride high-dose group，the proliferation rate of BV2 cells，LDH，NO，IL-1β，TNF-α，IL-6，IL-1β mRNA，TNF-α mRNA，IL-6 mRNA，TRL4，and cytosolic NF-κB p65 were increased in the naloxone hydrochloride high-dose＋TLR4 activator group，and level of cytoplasmic NF-κB p65 was decreased（P＜0.05）.Conclusion：Naloxone hydrochloride alleviated inflammatory response of BV2 cells induced by hypoxia and glucose-deficiency by inhibiting the TRL4/NF-κB pathway.

Keywords hypoxia and glucose-deficiency; naloxone hydrochloride; Toll-like receptor 4/nuclear transcription factor κB pathway; BV2 cells; inflammatory response; experimental study

小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)元的關(guān)鍵組成，其激活是腦創(chuàng)傷、腦卒中、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的病理基礎(chǔ)。機(jī)體受到損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)，釋放多種神經(jīng)毒性因子，引起神經(jīng)炎性，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷［1-3］。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥是神經(jīng)退行性疾病的防治方向之一，本研究以小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2為實(shí)驗(yàn)載體進(jìn)行抗炎藥物的分析。鹽酸納洛酮是臨床常用的阿片類受體拮抗劑，與阿片類受體親和力強(qiáng)，可穿過(guò)血腦屏障，阻止嗎啡物質(zhì)與受體結(jié)合，發(fā)揮對(duì)β-內(nèi)啡肽的抑制，降低腦組織損傷，發(fā)揮調(diào)節(jié)腦代謝水平的功效。鹽酸納洛酮可在腦出血疾病中發(fā)揮作用［4］。劉明利［5］研究顯示，鹽酸納洛酮可抑制慢性阻塞性肺疾病合并呼吸衰竭病人炎性因子水平。吳娜［6］研究顯示，鹽酸納洛酮可抑制大鼠腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)，但關(guān)于鹽酸納洛酮在小膠質(zhì)細(xì)胞中的應(yīng)用較少。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TRL4）/核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）是常見的炎癥通路，抑制此通路可減輕阿爾茨海默病大鼠炎癥反應(yīng)［7］。本研究通過(guò)TRL4/NF-κB通路觀察鹽酸納洛酮對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)BV2細(xì)胞炎性的影響，為鹽酸納洛酮在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞（CL-0493）、MEM完全培養(yǎng)基（CM-0493）購(gòu)自普諾賽；鹽酸納洛酮［規(guī)格：每支2 mL（2 mg），批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20053316］購(gòu)自成都苑東生物制藥股份有限公司；脂多糖（S11060）購(gòu)自上海源葉；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK）-8試劑盒（C0039）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（C0016）、總RNA抽提試劑盒（R0016）、cDNA第一鏈合成試劑盒（D7178L）、細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒（P0027）均購(gòu)自上海碧云天；腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（ml002095-J）、白細(xì)胞介素（IL）-6試劑盒（ml002293-J）、IL-1β試劑盒（ml063132-J）均購(gòu)自上海酶聯(lián)；TRL4（ab13556）、NF-κB p65（ab239882）、GAPDH（ab181602）抗體、山羊抗兔二抗（ab6721）購(gòu)自美國(guó)Abcam。HF90 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力康，Elx800酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)bio-TEX公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BV2細(xì)胞培養(yǎng)

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在MEM完全培養(yǎng)基中（包含10%胎牛血清，100 U/mL青鏈霉素）培養(yǎng)，并置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，隔天傳代，傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 CCK-8法測(cè)定鹽酸納洛酮對(duì)BV2細(xì)胞活性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞消化，將細(xì)胞濃度調(diào)整至每孔5×103個(gè)（96孔板），加入不同濃度（0、0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L）的鹽酸納洛酮，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃條件下避光培養(yǎng)2 h，棄上清，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度OD值（450 nm處）。細(xì)胞活性＝各濃度孔OD值/濃度為0時(shí)的OD值×100%。

1.2.3 細(xì)胞分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞，消化后，以每孔1×104個(gè)的數(shù)量接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為對(duì)照組、缺氧缺糖誘導(dǎo)組、鹽酸納洛酮低濃度組、鹽酸納洛酮高濃度組、鹽酸納洛酮高濃度＋TLR4激活劑組。除對(duì)照組正常培養(yǎng)外（含糖培養(yǎng)基），其余各組均每孔加入100 μL Earles平衡鹽溶液，置于密封缺氧裝置中，通入95%N2＋5%CO2氣體去除裝置內(nèi)空氣，調(diào)小氣流量，處理1 h。取出96孔板，棄去無(wú)糖培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。鹽酸納洛酮低濃度組、鹽酸納洛酮高濃度組分別加入0.01 μmol/L、5.00 μmol/L鹽酸納洛酮。鹽酸納洛酮高濃度＋TLR4激活劑組加入5.00 μmol/L鹽酸納洛酮與1 mg/L脂多糖［8］。

1.2.4 LDH法檢測(cè)各組BV2細(xì)胞毒性

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)LDH試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)BV2細(xì)胞毒性，在490 nm處測(cè)定每孔OD值。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)各組BV2細(xì)胞增殖率

取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞于96孔板接種（每孔1×104個(gè)），每孔設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑，孵育4 h后，測(cè)定450 nm處的吸光度。細(xì)胞增殖率＝OD值試驗(yàn)孔/OD值對(duì)照孔 ×100%。

1.2.6 倒置顯微鏡觀察各組BV2細(xì)胞形態(tài)

將BV2細(xì)胞懸液以每孔6×105個(gè)接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后，按照1.2.3中的方法進(jìn)行分組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)各組BV2細(xì)胞培養(yǎng)上清液一氧化氮（NO）、TNF-α、IL-6、IL-1β水平

收集各組BV2細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用Griess法檢測(cè)定NO水平［9］，根據(jù)TNF-α、IL-6、IL-1β試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.2.8 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）法檢測(cè)各組BV2細(xì)胞TNF-α mRNA、IL-6 mRNA、IL-1β mRNA水平

提取各組BV2細(xì)胞總RNA（RNA提取試劑盒）后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（cDNA第一鏈合成試劑盒），應(yīng)用qRT-PCR法對(duì)TNF-α、IL-6、IL-1β、GAPDH（內(nèi)參對(duì)照）擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s、62 ℃ 35 s，循環(huán)45次。引物序列見表1。

1.2.9 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)BV2細(xì)胞中TRL4、NF-κB蛋白表達(dá)

細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解后，10 000 r/min離心10 min，取上清（測(cè)定TRL4水平），細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核蛋白試劑盒提取的胞質(zhì)蛋白和核蛋白，測(cè)定NF-κB p65細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核水平，凝膠電泳分離蛋白、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫孵育2 h，加入TLR4、NF-κB p65、Lamin B（細(xì)胞核NF-κB p65內(nèi)參）、GAPDH（TRL4、細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65內(nèi)參）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗，室溫孵育1 h。3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，定量分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，組間有差異進(jìn)一步采用SNK-q法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鹽酸納洛酮對(duì)BV2細(xì)胞活性的影響

0.01～5.00 μmol/L的鹽酸納洛酮濃度對(duì)BV2細(xì)胞活性無(wú)明顯影響。鹽酸納洛酮濃度＞5.00 μmol/L時(shí)（10、20、40 μmol/L），細(xì)胞活性顯著下降，因此鹽酸納洛酮濃度范圍為0.01～5.00 μmol/L，后續(xù)研究選取0.01 μmol/L作為低濃度處理BV2細(xì)胞，5.00 μmol/L作為高濃度處理BV2細(xì)胞。詳見表2。

2.2 鹽酸納洛酮對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)BV2細(xì)胞增殖率的影響

與對(duì)照組比較，缺氧缺糖誘導(dǎo)組BV2細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05）；與缺氧缺糖誘導(dǎo)組比較，鹽酸納洛酮低濃度組、鹽酸納洛酮高濃度組BV2細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）；與鹽酸納洛酮高濃度組比較，鹽酸納洛酮高濃度＋TLR4激活劑組BV2細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.3 鹽酸納洛酮對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)BV2細(xì)胞LDH的影響

與對(duì)照組比較，缺氧缺糖誘導(dǎo)組BV2細(xì)胞LDH含量升高（P＜0.05）；與缺氧缺糖誘導(dǎo)組比較，鹽酸納洛酮低濃度組、鹽酸納洛酮高濃度組BV2細(xì)胞LDH含量降低（P＜0.05）；與鹽酸納洛酮高濃度組比較，鹽酸納洛酮高濃度＋TLR4激活劑組BV2細(xì)胞LDH含量升高（P＜0.05）。詳見表4。

2.4 鹽酸納洛酮對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)BV2細(xì)胞形態(tài)的影響對(duì)照組BV2細(xì)胞多數(shù)呈圓形或橢圓形；缺氧缺糖誘導(dǎo)組BV2細(xì)胞體積增大，呈紡錘體變化；鹽酸納洛酮低濃度組、鹽酸納洛酮高濃度組呈紡錘體變化，細(xì)胞數(shù)目減少；鹽酸納洛酮高濃度＋TLR4激活劑組較鹽酸納洛酮高濃度組呈紡錘體變化，細(xì)胞數(shù)目增多。詳見圖1。

2.5 鹽酸納洛酮對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)BV2細(xì)胞NO、IL-1β、TNF-α、IL-6含量及其mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，缺氧缺糖誘導(dǎo)組BV2細(xì)胞NO、IL-1β、TNF-α、IL-6含量及其mRNA均升高（P＜0.05）；與缺氧缺糖誘導(dǎo)組比較，鹽酸納洛酮低濃度組、鹽酸納洛酮高濃度組BV2細(xì)胞NO、IL-1β、TNF-α、IL-6含量及其mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05）；與鹽酸納洛酮高濃度組比較，鹽酸納洛酮高濃度＋TLR4激活劑組BV2細(xì)胞NO、IL-1β、TNF-α、IL-6含量及其mRNA升高（P＜0.05）。詳見表5。

2.6 鹽酸納洛酮對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)BV2細(xì)胞TRL4、NF-κB蛋白的影響

與對(duì)照組比較，缺氧缺糖誘導(dǎo)組BV2細(xì)胞TRL4、細(xì)胞核NF-κB p65水平升高，細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65水平降低（P＜0.05）；與缺氧缺糖誘導(dǎo)組比較，鹽酸納洛酮低濃度組、鹽酸納洛酮高濃度組BV2細(xì)胞TRL4、細(xì)胞核NF-κB p65水平降低，細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65水平升高（P＜0.05）；與鹽酸納洛酮高濃度組比較，鹽酸納洛酮高濃度＋TLR4激活劑組BV2細(xì)胞TRL4、細(xì)胞核NF-κB p65水平升高，細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65水平降低（P＜0.05）。詳見表6、圖2。

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，可抵御外來(lái)?yè)p傷，當(dāng)受到刺激信號(hào)時(shí)被激活，發(fā)揮清除刺激的作用，長(zhǎng)時(shí)間激活釋放炎性因子，加重神經(jīng)炎性，持續(xù)的炎癥反應(yīng)損傷腦組織，加重神經(jīng)疾病［10-11］。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活是神經(jīng)退行性疾病的治療方案之一，BV2細(xì)胞來(lái)源于小鼠神經(jīng)細(xì)胞系，擁有小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)與功能，可穩(wěn)定傳代，是體外研究的良好選擇。本研究BV2細(xì)胞經(jīng)缺氧缺糖誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞多數(shù)呈紡錘體變化，說(shuō)明BV2細(xì)胞被激活，細(xì)胞增殖能力、炎性因子水平及LDH釋放增加，證實(shí)成功構(gòu)建了BV2炎癥模型。

鹽酸納洛酮是一種阿片類受體拮抗劑，具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用。刺激顱腦局部可釋放β-內(nèi)啡肽，β-內(nèi)啡肽是一種內(nèi)源性阿片肽，β-內(nèi)啡肽與阿片受體結(jié)合可影響腦損傷周圍血流速度，促進(jìn)腦組織缺血、缺氧及炎癥反應(yīng)［12-13］。鹽酸納洛酮作為阿片類受體拮抗劑，可阻礙β-內(nèi)啡肽與阿片受體，進(jìn)而發(fā)揮降低腦損傷的作用。Wang等［14］研究顯示，納洛酮通過(guò)抑制NF-κB和神經(jīng)元凋亡途徑減輕大鼠缺血性腦損傷。Li等［15］研究顯示，納洛酮與葛根素聯(lián)合使用治療創(chuàng)傷性腦梗死的療效較好。羅煒等［16］研究顯示，鹽酸納洛酮可緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛。

本研究中，0.01～5.00 μmol/L的鹽酸納洛酮對(duì)BV2細(xì)胞活性均無(wú)顯著影響；炎癥BV2細(xì)胞模型經(jīng)鹽酸納洛酮處理后，細(xì)胞增殖能力及NO、IL-1β、LDH等水平下降，qRT-PCR法證實(shí)了IL-1β mRNA水平降低。NO與IL-1β是神經(jīng)細(xì)胞的主要毒性物質(zhì)，可加重神經(jīng)損傷。抑制內(nèi)源性NO可促進(jìn)神經(jīng)突觸重塑［17］，介導(dǎo)神經(jīng)毒性，參與大鼠脊髓損傷［18］。IL-1β可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化［19］。本研究結(jié)果顯示，鹽酸納洛酮可拮抗炎性BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制炎性BV2細(xì)胞的激活，提示腦缺血缺氧后小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)激活，可能通過(guò)釋放NO與IL-1β，加重腦組織損傷，鹽酸納洛酮可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可能原因?yàn)辂}酸納洛酮作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，降低免疫細(xì)胞的趨化，緩解神經(jīng)炎癥。

TRL4/NF-κB是經(jīng)典炎癥通路，TRL4增加可促進(jìn)NF-κB/NF-κB抑制蛋白α（IκBα）解離，解離得到NF-κB，且由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，NF-κB活化進(jìn)一步調(diào)節(jié)促炎因子TNF-α、IL-6表達(dá)，促炎因子進(jìn)一步激活TLR4引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究中缺氧缺糖誘導(dǎo)后BV2細(xì)胞TRL4、細(xì)胞核NF-κB p65水平升高，提示缺氧缺糖環(huán)境可激活小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥通路，促進(jìn)腦部炎癥損傷，經(jīng)鹽酸納洛酮處理后，TRL4、細(xì)胞核NF-κB p65水平下降，提示鹽酸納洛酮可能通過(guò)抑制TRL4/NF-κB發(fā)揮對(duì)炎性BV2細(xì)胞的抗炎作用。為驗(yàn)證此過(guò)程，本研究進(jìn)行了回復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，TRL4激活劑脂多糖可拮抗鹽酸納洛酮的細(xì)胞保護(hù)作用，且細(xì)胞核NF-κB水平升高，進(jìn)一步提示鹽酸納洛酮可能通過(guò)抑制TRL4/NF-κB降低缺氧缺糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，缺氧缺糖可誘導(dǎo)BV2細(xì)胞激活，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，鹽酸納洛酮對(duì)BV2細(xì)胞激活、炎癥反應(yīng)均有調(diào)節(jié)作用，此過(guò)程可能是通過(guò)抑制TRL4/NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。今后將進(jìn)行鹽酸納洛酮的療效及安全性的進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2022-05-06）

（本文編輯薛妮）

基金項(xiàng)目 延安市科學(xué)技術(shù)局資助項(xiàng)目（No.2018CGZH-15）

作者單位 1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院（陜西延安" 716000）；2.漢中市人民醫(yī)院（陜西漢中" 723000）

通訊作者 張春瑞，E-mail：zhangchunrui99@163.com

引用信息 劉虎軍，賈菲，張春瑞.鹽酸納洛酮調(diào)控TRL4/NF-κB通路對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（16）：2962-2967.