摘要：遺傳雜交技術(shù)是開展遺傳研究的基本工具，也是研究基因功能的必要手段之一。雖然對(duì)豆科模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的研究愈來愈多，但其遺傳雜交技術(shù)因難度較高而只被研究蒺藜苜蓿比較悠久的科研團(tuán)體掌握。為了便于更多實(shí)驗(yàn)室能夠掌握該項(xiàng)技術(shù)，本文在已報(bào)道的蒺藜苜蓿雜交方法的基礎(chǔ)上提出了一種新的雜交技術(shù)。研究內(nèi)容包括蒺藜苜蓿的花果發(fā)育周期、花解剖結(jié)構(gòu)、不同發(fā)育時(shí)期花的花藥發(fā)育、遺傳雜交程序、母本花的選擇標(biāo)準(zhǔn)以及雜交鑒定等。本研究所提出的蒺藜苜蓿雜交方法與已有其它雜交方法相比，具有操作難度低、雜交后無需特殊護(hù)理措施、雜交成功率高等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：豆科植物；模式植物；蒺藜苜蓿；遺傳雜交；人工雜交；花結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S551+.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）03-914-09

A Novel Genetic Crossing Method for Medicago truncatula

ZHANG Hao-wei1#， MA Xin-wei1#， Gao Ya-qing1， SHI Wen-min1，

LU Li-juan2， XI Jie-jun1*

（1. College of Grassland Agriculture， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi Province 712100， China; 2. College of

Horticulture， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi Province 712100， China）

Abstract：The technique of genetic crossing is a basic tool for genetic research and one of the necessary means to study gene function. Although there are more and more studies on the legume model plant Medicago truncatula，due to the difficulty of genetic hybridization of this material，its hybridization technique is still limited to the scientific research groups having utilized this plant material for a long time. In order to facilitate more laboratories to master this technology，this study proposed a new hybridization technique based on the reported hybridization methods of M. truncatula. The study included the flower and fruit development cycle，anatomical structure of flower，anther development of flowers at different stages，genetic hybridization procedures，selection criteria of female parent flowers，and identification on the successful hybridization. Compared with other existing methods of M. truncatula hybridization，the method proposed in this study featured some advantages，such as low difficulties on operation，no need for special nursing cares after hybridization，and high rate of successful hybridization.

Key words：Legumes;Model Plant;Medicago truncatula;Genetic crossing;Artificial hybridization;Anatomical structure of flower

豆科植物（Fabaceae或Leguminosae）是僅次于菊科（Asteraceae）和蘭科（Orchidaceae）的第三大類被子植物，有730多個(gè)屬，19 000多個(gè)種［1］，遍布世界，生長于各種氣候條件下的多種生境，如平原、高山、荒漠、森林、草原直至水域。豆科植物在經(jīng)濟(jì)重要性上僅次于禾本科植物，它不僅用作人類食物［如菜豆（Phaseolus vulgaris）和扁豆（Lens esculenta）］，食用植物油［如大豆（Glycine max）和花生（Arachis hypogaea）］，動(dòng)物飼料［如紫花苜蓿（Medicago sativa）和三葉草（Trifolium pratense）］，木材［如皂角（Gleditsia sinensis）］，生物燃料［（如大豆）］和中藥［如甘草（Glycyrrhiza uralensis）和黃芪（Astragalus memeranaceus）］等，而且因其可與根瘤菌進(jìn)行共生固氮作用而在土壤改良、荒漠化治理和生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的維持方面具有重要的功能［2］。為了促進(jìn)豆科植物的基礎(chǔ)研究，尤其是豆科植物特有的共生固氮作用，在本世紀(jì)初基因組學(xué)日趨成熟的大潮下，歐美科研團(tuán)體通過充分討論并確立了當(dāng)今兩個(gè)研究廣泛使用的豆科植物模式植物——蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和百脈根（Lotus japonicus）［3-4］。

草地學(xué)報(bào)第31卷第3期張浩巍等：一種新的蒺藜苜蓿遺傳雜交方法蒺藜苜蓿自2000年左右被選作豆科模式物種之后，基因組［5］、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)［6-7］、遺傳轉(zhuǎn)化方法［8］、高密度遺傳圖譜［9］、EMS突變體庫［10］、FNB突變體庫［11］以及Tnt1突變體庫［12］等各種資源的創(chuàng)建，使以蒺藜苜蓿為材料的遺傳發(fā)育研究得以順利進(jìn)行，從而極大地促進(jìn)了共生固氮［13］、葉片發(fā)育［14］、叢枝菌根共生［15］、次生代謝［16］以及植物病原互作［17］等多個(gè)領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展。迄今為止，中國以蒺藜苜蓿為研究材料所取得的研究成果也日益豐碩［18-22］。鑒于豆科植物的重要性，可預(yù)知以蒺藜苜蓿為研究材料的基礎(chǔ)研究其范圍和深度仍將繼續(xù)快速發(fā)展。

在遺傳發(fā)育研究中，無論是以突變目的基因?yàn)槠瘘c(diǎn)的反向遺傳學(xué)研究［23-24］，還是以突變表型為起點(diǎn)的正向遺傳學(xué)研究［11］，為了探究目的基因的生物學(xué)功能或克隆定位造成某種缺陷表型的遺傳突變基因，通常需要通過回交或雜交等途徑以清除突變體基因組內(nèi)的其他突變或構(gòu)建遺傳雜交群體以進(jìn)行遺傳連鎖分析。由于基因重復(fù)或基因家族常常導(dǎo)致基因功能冗余，為了探究它們的功能，也需要通過雜交的方式構(gòu)建雙重突變體或多重突變體［25］。此外，由于復(fù)雜發(fā)育過程通常涉及多基因的參與，為了探究基因之間的互作以及它們?cè)谠摪l(fā)育過程中功能發(fā)生的先后順序，也需要通過雜交來構(gòu)建聚合突變體以探究它們?cè)谶z傳調(diào)控中的上下位［26］。因此，蒺藜苜蓿的遺傳雜交技術(shù)是開展以蒺藜苜蓿為研究材料進(jìn)行遺傳發(fā)育研究不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)之一。

自1989年Crawford等［27］首次報(bào)道蒺藜苜蓿的雜交原則和方法之后，蒺藜苜蓿的各種雜交方法在蒺藜苜蓿被選作豆科植物模式物種之后而被陸續(xù)報(bào)道［28-31］。在這些方法中，都用膠帶在花梗處將花水平置放在體式顯微鏡或解剖鏡的載物臺(tái)上，然后用解剖刀在龍骨瓣的背脊處從其基部1/3處向上輕輕劃破，或用剪刀將萼片剪掉并將旗瓣去除，或在平放花的朝上的龍骨旗瓣面的中間用解剖刀劃破，隨后沿劃破口將花瓣或剩余花瓣用鑷子外推以露出花中間的雌雄蕊進(jìn)行去雄和雜交。在這些方法的操作步驟中，由于花固定不緊，需要一只手拿鑷子將花固定，另一只手拿手術(shù)刀或鑷子進(jìn)行操作。因此，這些方法對(duì)雙手的協(xié)調(diào)性要求較高。此外，去除旗瓣、萼片或雜交后花無法復(fù)原到雜交之前狀態(tài)的雜交方式在雜交之后還需額外特殊護(hù)理，以免人工雜交造成花朵失水而損傷生殖器官或干燥死亡［28-29，31］。針對(duì)已有蒺藜苜蓿遺傳雜交的缺點(diǎn)，為了提高雜交成功率，降低雜交難度，本研究在已有蒺藜苜蓿雜交技術(shù)的基礎(chǔ)之上，以蒺藜苜蓿R108為材料，開發(fā)出一種更加簡單便捷的蒺藜苜蓿雜交方法。

1材料與方法

1.1植物材料的培養(yǎng)

選擇飽滿健康的蒺藜苜蓿R108的種子和突變體snfd的種子（來自美國諾貝基金會(huì)），用濃硫酸處理6～8 min后［32］用蒸餾水沖洗干凈，吸脹4～6 h，然后置于培養(yǎng)皿中室溫（25℃左右）避光發(fā)芽48 h。待胚根長至1 cm左右，將發(fā)芽種子移至裝有草炭土的8 cm × 8 cm ×12 cm培養(yǎng)盒中生長。植物生長室的光周期為16 h/8 h，晝夜溫度為25℃/20℃，光照強(qiáng)度為400 μmol·m-2·s-1。生長期間根據(jù)需求澆灌擬南芥ANS（Arabidopsis nutrient solution）營養(yǎng)液［33］。

1.2雜交果英鑒定

隨機(jī)取出3個(gè)以固氮突變體snfd為母本的雜交果莢，將種子剝出后按照上述發(fā)芽方法發(fā)芽，然后將發(fā)芽種子移至裝有無菌沙質(zhì)培養(yǎng)基的12格培養(yǎng)盒（8 cm×15 cm×10 cm）［32］。植物生長1周后，接種法國Gif-sur-Yvette植物科學(xué)研究所（Institut des Sciences du Végétal）蒺藜苜蓿專用的ISV溶液懸浮的中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）（OD600 nm=0.05）［32］。根據(jù)需要用ISV溶液澆灌植物。接種1個(gè)月后進(jìn)行顯微鏡鑒定。

1.3主要儀器

奧林巴斯體式顯微鏡OLYMPUS SZX16；尖頭鑷子。

2結(jié)果與分析

2.1蒺藜苜蓿R108的花果發(fā)育周期

蒺藜苜蓿R108生長2個(gè)月左右開始開花。蒺藜苜蓿形成肉眼可見的花芽到肉眼可見的幼嫩果莢需要7～8天（圖1A-H）。在幼嫩果莢形成后，約30天果莢成熟，其顏色由綠色變成棕褐色或灰綠色，變干并自然脫落（圖1I），通常內(nèi)含6～8粒種子。

2.2蒺藜苜蓿R108花的解剖

蒺藜苜蓿R108的花屬于典型的豆科蝶形花，其花冠由最外層1片旗瓣、中間2片翼瓣和內(nèi)部1片龍骨瓣構(gòu)成，其中翼瓣與龍骨瓣在底部貼附而合生（圖2A，圖2B）。將花冠剝離后，可看見其生殖構(gòu)件（圖2E），它由雄蕊群和心皮構(gòu)成。蒺藜苜蓿R108的雄蕊群由9個(gè)合生的花藥和1個(gè)離生的花藥共10個(gè)花藥構(gòu)成，花藥基部聯(lián)合形成桶狀薄片將心皮包裹住，將心皮頂部即花柱和柱頭包裹在中央（圖2F-G）。由于蒺藜苜蓿R108的雄蕊和雌蕊幾乎等長或略長于雌蕊，因此非常便于破裂的花藥對(duì)柱頭進(jìn)行自花授粉。

2.3蒺藜苜蓿R108不同發(fā)育時(shí)期花的花藥發(fā)育

遺傳雜交的成功和效率取決于適宜發(fā)育階段的母本花以及父本花的選擇。由于蒺藜苜蓿是嚴(yán)格的自花授粉植物，因此在做遺傳雜交選擇母本時(shí)，應(yīng)該在保證花藥未破裂（即未自花授粉）的前提下，盡量使柱頭發(fā)育充分，以使柱頭更加成熟進(jìn)而提高授粉成功幾率。對(duì)于父本而言，應(yīng)該在保證花藥破裂的前提下盡量保證花藥的新鮮，以使花粉活力最高進(jìn)而提高授粉成功幾率。為此，本研究探究了不同發(fā)育時(shí)期花的花粉發(fā)育情況，以便選擇合適發(fā)育時(shí)期的父母本雜交花朵。如圖3所示，花A-C和G的發(fā)育程度不斷增加，其柱頭發(fā)育也愈趨成熟，但其花藥（圖3D-F和3J）并未破裂?；℉和I由于對(duì)應(yīng)花藥K和L破裂，已無法用作母本。

2.4蒺藜苜蓿R108的遺傳雜交程序

在遵循母本花柱頭盡量最成熟和父本花粉盡量最新鮮的前提下，本試驗(yàn)對(duì)Veerappan等［30］報(bào)道的劃破龍骨瓣的雜交方法進(jìn)行了改進(jìn)。具體的雜交程序?yàn)椋海?）在母本植株上選擇發(fā)育適宜的花作為雜交受體花（圖4 A）；（2）將所選母本花小心地用膠帶從其之下的1/3～1/2處固定在體式顯微鏡的載物底盤上，并且使旗瓣的開口朝上（圖4B）；（3）用鑷子輕輕插入龍骨瓣并輕緩向上滑動(dòng)，將龍骨瓣劃破，然后再用鑷子將劃破的龍骨瓣推向兩邊，以使花藥外露（圖4C-D）；（4）用鑷子輕輕地將露出的花藥一一夾去，露出柱頭，但注意不要觸碰或損傷柱頭（圖4D-E）；（5）在父本植株上選擇發(fā)育適宜的花作為雜交花粉供體并將其剪下帶至雜交工作臺(tái)（圖4 F）；（6）用鑷子將其花冠剝?nèi)ヂ冻鰩Щㄋ幍男廴锶海▓D4 G）；（7）用鑷子夾住去掉花冠的父本花并將其帶花粉雄蕊群部分與去雄的母本花的柱頭輕輕擦揉，以使父本花粉與母本柱頭充分接觸（圖4 H），然后再用鑷子輕輕地將分開的翼瓣閉合，使母本花再恢復(fù)至初始的狀態(tài)即圖4 A的樣子，并做標(biāo)記。如果雜交成功，在48～72 h內(nèi)，雜交花朵將產(chǎn)生肉眼可見的幼嫩果莢（圖4 I）。

2.5蒺藜苜蓿R108遺傳雜交選擇適宜母本花朵的指標(biāo)

理論上來講，成熟的母本花柱頭和新鮮的父本花粉可提高遺傳雜交的成功率，但在雜交的現(xiàn)實(shí)過程中，常常難以確定最適宜的父母本花朵。為了提高雜交效率，在大量雜交經(jīng)驗(yàn)和不斷觀察的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)蒺藜苜蓿R108的花進(jìn)行了區(qū)劃，將萼片基部之上的花冠長度定義為α，將花萼基部與萼片基部之間的長度定義為β（圖5），并將α/β的比值定義為γ。結(jié)果表明，在花藥未裂開之前，雜交成功率隨著母本花的發(fā)育成熟度增加而增加，當(dāng)γ值為1.25，1.73和2.14時(shí)，其雜交成功率分別為4.8%，16.7%和31.6%（表1）。當(dāng)γ＞2.5時(shí)，花藥均破裂。因此，母本花適宜的γ值應(yīng)該為2左右，即露出的黃色花冠約是綠色桶狀合生花萼部分的2倍。

對(duì)于父本，由于在雜交的過程中操作簡單，可以2.4＜γ＜2.8為標(biāo)準(zhǔn)多摘取一些花，剝?nèi)セü诤罂椿ǚ鄱喙岩约笆欠裥迈r，以便現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行取舍。

2.6蒺藜苜蓿R108遺傳雜交的鑒定

為了檢驗(yàn)雜交是否成功，本試驗(yàn)對(duì)一個(gè)尚未遺傳定位的Tnt1共生固氮突變體snfd × R108的F1進(jìn)行鑒定。在低氮條件下接種正常根瘤菌21天后，如圖6A-B，F(xiàn)1代植株具有野生型父本R108的表型，即葉片呈現(xiàn)健康的綠色，根瘤也呈現(xiàn)健康的血紅色（圖6C-E）；與母本snfd相比，F(xiàn)1代植株恢復(fù)了共生固氮的特性（圖6）。本研究共發(fā)芽了3個(gè)雜交果莢，各自的F1植株分別為6株、1株和1株，其中F1代的野生型植株分別為5株、1株和1株。這些結(jié)果表明，在獲得的F1代果莢中，雜交成功率為100%。

3討論

與已報(bào)道的用膠帶在花梗處將母本花水平置放在體式顯微鏡或解剖鏡的載物臺(tái)上不同，本研究的蒺藜苜蓿雜交方法將所選定的母本花在其基部1/3～1/2處用膠帶固定在雜交顯微鏡的載物臺(tái)中間，使旗瓣開口向上并輕壓以使其略微張開，露出其包含的翼瓣和龍骨瓣。然后從花基部向上2/3處用鑷子刺入龍骨瓣并上挑劃破龍骨瓣，隨后將龍骨瓣向兩側(cè)外撥以露出里面的生殖柱，并進(jìn)行去雄和雜交。該方法與去除旗瓣、萼片或雜交后無法將花復(fù)原到雜交之前狀態(tài)的雜交方式相比［28-29，31］，不必?fù)?dān)心雜交操作造成花朵失水而損傷生殖器官或干燥死亡，從而在雜交完成后無需額外的特殊護(hù)理措施。由于花處于非常穩(wěn)的固定狀態(tài)，本雜交方法與Veerappan等［30］報(bào)道的雜交方法相比，省去了雙手協(xié)同劃破旗瓣和去雄操作的工作步驟，大大地降低了遺傳雜交的操作難度，并可提高遺傳雜交的速率。

選擇合適發(fā)育階段的母本花是人工遺傳雜交成功的必要保證。為了確保受控的遺傳雜交成功，必須保證所選母本花未發(fā)生閉花受精。但是不能為了保證母本花未發(fā)生閉花授粉而選擇過于幼嫩的花朵，因?yàn)檫^于幼嫩花朵中的柱頭尚未發(fā)育完全，其不具備接受外源花粉而授粉的能力或授粉能力較弱，從而使雜交失敗或成功率很低。而過老的母本花則可能已發(fā)生自花授粉而不適合用于人工遺傳雜交。由于已有蒺藜苜蓿雜交方法對(duì)于母本花選擇的標(biāo)準(zhǔn)比較模糊，在實(shí)際操作中難以判斷和實(shí)踐，因此本研究對(duì)母本花的選擇進(jìn)行了仔細(xì)的試驗(yàn)并提出了明確的標(biāo)準(zhǔn)。本研究首次提出γ值以量化母本花的成熟度（圖5），發(fā)現(xiàn)γ值為2左右時(shí)的花雜交成功率最高（表1），最適合用作雜交母本花；而父本花的γ值可在2.4～2.8之間。

在雜交過程中，對(duì)于父本和母本的選擇也值得留意，因?yàn)殡s交父母本的選擇決定了雜交后代鑒定的難易與工作量。已有蒺藜苜蓿雜交方法中報(bào)道的關(guān)于父母本的選擇標(biāo)準(zhǔn)［28-31］，筆者持有不同觀點(diǎn)。為了減少雜交鑒定的工作量，對(duì)于Tnt1突變體，如果是沒有易于檢測(cè)表型的以反向遺傳為主要研究手段的突變體，本研究建議以蒺藜苜蓿R108野生型的植株為母本；而具有易于檢測(cè)表型的突變體則建議以突變體為母本。如果是顯性突變，則依然應(yīng)以蒺藜苜蓿R108野生型為母本。至于具體的選擇，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮推米孕袥Q定。

為了確保后續(xù)試驗(yàn)建立在堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)之上，通常需要對(duì)雜交工作的成功與否進(jìn)行嚴(yán)格的鑒定。對(duì)于沒有表型的以反向遺傳學(xué)為研究手段的且以蒺藜苜蓿R108野生型植株為母本的雜交，可以目的基因的Tnt1具體插入位置設(shè)計(jì)特異性引物或以Tnt1序列特異引物對(duì)F1代植株進(jìn)行PCR，以能否擴(kuò)增出特異性條帶檢測(cè)雜交是否成功。對(duì)于具有表型突變體為母本的雜交，則可以檢測(cè)F1是否喪失母本的突變表型來直接鑒定雜交是否成功（圖6）。

值得一提的是，本研究的方法也適合蒺藜苜蓿A17以及A20等生態(tài)型。

4結(jié)論

本研究報(bào)道了一種新的、便捷的蒺藜苜蓿遺傳雜交方法，與已報(bào)道的方法相比，本方法具有操作難度低、雜交后無需特殊護(hù)理措施、雜交成功率高的特點(diǎn)，可適合蒺藜苜蓿R108，A17以及A20等生態(tài)型。

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（責(zé)任編輯閔芝智）