摘要：AT-hook核定位（AT-hook motif nuclear localized，AHL）蛋白作為一種小型DNA結(jié)合蛋白，廣泛存在于植物中，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫和激素信號(hào)應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要的作用。為全面了解胡楊（Populus euphratica）AHL基因家族的結(jié)構(gòu)及功能，利用生物信息學(xué)方法及qRT-PCR對(duì)胡楊A(yù)HL家族成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位以及逆境脅迫下的表達(dá)特征進(jìn)行分析。理化性質(zhì)分析表明，胡楊A(yù)HL家族共有19個(gè)成員，除PeAHL16外，其余PeAHL蛋白均為堿性的不穩(wěn)定親水蛋白?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，PeAHL成員全部為內(nèi)含子缺失型基因。系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示，胡楊A(yù)HL家族成員可根據(jù)基因類(lèi)型分為8個(gè)亞群。保守基序分析顯示，聚類(lèi)在同一分支中的PeAHL基因其motif組成及排列順序基本相同。在順式作用元件分析中，響應(yīng)干旱脅迫的元件其種類(lèi)和數(shù)量最多。實(shí)時(shí)熒光定量分析表明，PeAHLs的表達(dá)受低溫、高溫、NaCl以及PEG的顯著誘導(dǎo)，與對(duì)照相比，PeAHLs在PEG處理下表達(dá)量最高。本研究結(jié)果為胡楊A(yù)HL基因家族的深入研究提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步解析胡楊A(yù)HL基因參與非生物逆境脅迫的分子機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞：AHL基因家族；胡楊；生物信息學(xué)；qRT-PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：Q344+.13文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）03-0741-10

Bioinformatics Analysis of the AHL Gene Family in Populus euphratica and its

Expression Characteristics under Stress

LIU Hang-hang， CHONG Pei-fang*

（College of Forestry，Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu Province 730070，China）

Abstract：AT-hook motif nuclear localized （AHL） protein，a small DNA-binding protein，is widely found in plant and plays an important part in plant growth and development，responses to adversity stress and hormone signaling. In order to comprehensively understand the structure and function of the AHL gene family of Populus euphratica，the physicochemical properties，gene structure，subcellular localization and expression characteristics under stress of the AHL family members of P. euphratica were analyzed by bioinformatics methods and qRT-PCR. It was showed by the physicochemical property analysis that there were 19 members of the AHL family，and all PeAHL proteins are basic and unstable hydrophilic proteins except for PeAHL16. It was showed by the gene structure analysis that all PeAHL members were intron deletion type genes. It was showed by the phylogenetic tree analysis that the members of the PeAHL family could be split into 8 subgroups based on gene types. It was showed by the conservative motif analysis that PeAHL genes clustered in the same branch had essentially the same motif composition and arrangement order. In the analysis of cis-acting elements，the most diverse and abundant elements within the PeAHL genes were found out in response to drought stress. It was showed by the quantitative real-time fluorescence analysis that the expression of PeAHLs was significantly induced by low temperature，high temperature，NaCl as well as PEG，and the expression of PeAHLs was highest under PEG treatment compared with the control-check. The results of this study provide a theoretical basis for the in-depth study of the AHL gene family of P. euphratica and offer a reference to a further analysis on the molecular mechanism of the involvement of PeAHL genes in response to abiotic stresses.

Key words：AHL gene family;Populus euphratica;Bioinformatics;qRT-PCR

AHL蛋白是一種小型的DNA結(jié)合蛋白，又稱(chēng)AT-hook核定位蛋白（AT-hook nuclear localized proteins，AHL），首次在動(dòng)物的高遷移率族蛋白（High mobility group proteins，HMG）中發(fā)現(xiàn)［1-2］。AHL蛋白主要包含兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)單元，AT-hook基序和植物與原核生物保守結(jié)構(gòu)域（PPC/DUF296，plants and prokaryotes conserved）［3］。AT-hook基序能夠與富含AT的B型DNA的小凹槽結(jié)合，可以用于構(gòu)建含有TF肽片段的功能DNA結(jié)合物，且所得到的二價(jià)嵌合體在親和力、穩(wěn)定性和選擇性方面均顯示出優(yōu)良的DNA識(shí)別特性［4-5］，已經(jīng)在原核生物和真核生物的不同基因家族中被鑒定［6］。PPC結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度約為120個(gè)氨基酸，主要負(fù)責(zé)AHL蛋白的核定位［7］。在A(yíng)T-hook基序中含有高度保守序列精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸（RGRP）［8］，并根據(jù)其下游氨基酸序列的不同，可劃分為AT-hook基序I型和II型［9］，分別含有保守序列甘氨酸-絲氨酸-賴(lài)氨酸-天冬酰胺-賴(lài)氨酸（GSKNK）和精氨酸-賴(lài)氨酸-酪氨酸（RKY）。在功能上AT-hook基序I型已被證明與DNA結(jié)合模塊具有高親和力，而AT-hook基序II型則對(duì)DNA具有低親和力［6］。同樣在PPC結(jié)構(gòu)域中也具有I型和II型，其分別含有保守序列亮氨酸-精氨酸-絲氨酸-組氨酸（LRSH）和苯丙氨酸-蘇氨酸-苯丙氨酸-組氨酸（FTPH）［10］。胡楊（Populus euphratica）AHL基因家族可根據(jù)AT-hook基序和PPC結(jié)構(gòu)域的組成和數(shù)量分成三種類(lèi)型（I型，II型，III型）。I型AHL基因由AT-hook基序I型（GSKNK）和PPC結(jié)構(gòu)域I型（LRSH）構(gòu)成；II型AHL基因由AT-hook基序I型（GSKNK）、AT-hook基序II型（RKY）和PPC結(jié)構(gòu)域II型（FTPH）構(gòu)成；III型AHL基因由AT-hook基序II型（RKY）和PPC結(jié)構(gòu)域II型（FTPH）構(gòu)成［11］。

AHL蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子家族的重要一員，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫、調(diào)節(jié)植物激素等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。例如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中AtAHL01基因定位于染色體表面，通過(guò)AT-hook基序結(jié)合到基質(zhì)結(jié)合區(qū)（Matrix attachment regions，MAR）上，形成新型的植物MAR結(jié)合蛋白，它通過(guò)一個(gè)AT-hook基序和PPC結(jié)構(gòu)域參與了染色質(zhì)纖維在細(xì)胞核中的定位［7］。赤霉素（Gibberellins，GAs）是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素之一，AtAHL25基因可以有效調(diào)控?cái)M南芥中赤霉素AtGA3ox1基因的表達(dá)從而影響GA3氧化酶的活性［12］。在其他植物中，如長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）AHLs也已被證明參與調(diào)節(jié)AP2轉(zhuǎn)錄因子的茉莉酸反應(yīng)［13］。還有研究表明AtAHL20基因參與了植物先天免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)［14］。

胡楊屬楊柳科（Salicaceae）楊屬，為高大的喬木，成年樹(shù)木可高達(dá)15 m ～20 m，并且在荒漠地區(qū)可形成小片的森林［15-16］。在中國(guó)主要分布于新疆、甘肅、寧夏、青海、山西等海拔800 m～2 400 m的荒漠、戈壁和河流沿岸地區(qū)［17］。胡楊不僅喜光、耐熱、耐干旱，適應(yīng)力強(qiáng)，而且具有抗鹽堿、抗風(fēng)沙等優(yōu)點(diǎn)，在維護(hù)生態(tài)平衡、農(nóng)畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，素有“大漠英雄樹(shù)”的美稱(chēng)［18-19］。但是隨著時(shí)間的推移和全球環(huán)境不斷的變化，胡楊林面積因干旱少雨和人類(lèi)活動(dòng)等原因銳減［20］。

隨著科學(xué)技術(shù)和研究水平的不斷提高，近年來(lái)在擬南芥［21］、水稻（Oryza sativa）［8］、大豆（Glycine max L. Merr）［22］、棉花（Gossypium）［23］和玉米（Zea mays L.）［24］等多種植物中均發(fā)現(xiàn)AT-hook蛋白。這說(shuō)明AHL基因家族在陸地植物中高度保守，也暗示了AHL基因家族的生物學(xué)重要性。2013年胡楊基因組測(cè)序的完成為研究胡楊的抗逆分子機(jī)制和改善胡楊的抗逆能力提供數(shù)據(jù)支撐［25］。本實(shí)驗(yàn)以胡楊A(yù)HL基因家族為研究目標(biāo)，通過(guò)基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、亞細(xì)胞定位以及qRT-PCR等方法在基因組水平上對(duì)胡楊A(yù)HL基因家族的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)和基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，探究胡楊A(yù)HL基因家族在生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫等方面所發(fā)揮的作用，為今后胡楊的抗逆研究提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選用來(lái)自甘肅省酒泉市金塔縣的1年生胡楊實(shí)生幼苗，移栽并緩苗于人工氣候室的光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)溫度為24℃；培養(yǎng)濕度為70%～80%。待緩苗結(jié)束后，試驗(yàn)材料經(jīng)低溫（4℃）、高溫（42℃）、鹽（300 mmol·L-1 NaCl）和干旱（25% PEG6000）處理于0 h，2 h，6 h和12 h時(shí)進(jìn)行葉片取樣，用液氮速凍后置于—80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)取樣點(diǎn)進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1胡楊A(yù)HL家族成員的鑒定首先從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/）中檢索AHL基因的序列信息，然后將擬南芥AHL基因的蛋白序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）［26］中進(jìn)行Blast比對(duì)，找出40個(gè)胡楊A(yù)HL候選蛋白，再根據(jù)AHL基因家族所具有的特定結(jié)構(gòu)域，通過(guò)Pfam和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫(kù)最終鑒定得出19個(gè)胡楊A(yù)HL蛋白，并且保存19個(gè)基因的基因登錄號(hào)、氨基酸數(shù)目、編碼序列（Coding sequence，CDS）長(zhǎng)度和基因全長(zhǎng)等信息。再利用ExPasy網(wǎng)站中ProtParam tool工具（https：//web.expasy.org/protparam/）［27］分析得到PeAHL蛋白的分子量、等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)總平均親水性等理化性質(zhì)。

1.2.2胡楊A(yù)HL基因家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析使用GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）［28］在線(xiàn)軟件分析篩選胡楊A(yù)HL基因家族的基因結(jié)構(gòu)。利用MEME軟件（https：//meme-suite.org/meme/）［29］在線(xiàn)分析AHL家族成員的保守基序。將擬南芥的蛋白序列輸入Phytozome v12.1數(shù)據(jù)庫(kù)中，同源搜索得到毛果楊的AHL基因序列信息，結(jié)合胡楊與擬南芥AHL基因序列使用MEGA 7.0以及Evolview在線(xiàn)軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用最大似然法（Maximum likelihood method），Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.2.3胡楊A(yù)HL基因家族亞細(xì)胞定位和順式作用元件分析利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線(xiàn)分析胡楊A(yù)HL基因家族的亞細(xì)胞定位；在胡楊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)提取PeAHL基因家族成員的啟動(dòng)子序列（起始密碼子上游2 000 bp的核苷酸序列），利用PlantCARE網(wǎng)站和TBtools軟件進(jìn)行順式作用元件可視化分析。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）分析依據(jù)胡楊A(yù)HL家族成員所含的順式作用元件類(lèi)型，篩選含低溫、高溫、NaCl和PEG等逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件數(shù)量最多的基因，使用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1）并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以UBQ，Actin，EF1α和HIS基因分別作為低溫、高溫、NaCl和干旱的內(nèi)參基因進(jìn)行處理分析。樣品RNA提取采用植物總RNA提取試劑盒（RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen），cDNA合成采用Prime Script RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa），并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)操作。qRT-PCR程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 5 s；60℃ 60 s；50℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，并使用SPSS 26軟件對(duì)其進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1胡楊A(yù)HL基因家族理化性質(zhì)分析

通過(guò)Pfam和SMART分析軟件對(duì)40個(gè)候選基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行對(duì)比，最終保留同時(shí)含有AT-hook基序（RGRP）和PPC/DUF結(jié)構(gòu)域的序列作為胡楊A(yù)HL基因家族的成員，命名為PeAHL01-PeAHL19（表2）。利用ProtParam tool工具對(duì)這19個(gè)基因的蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析得出：CDS長(zhǎng)度在786～1 164 bp之間，氨基酸長(zhǎng)度介于261～387 aa。PeAHL01的分子質(zhì)量最小，為26.1 kD；PeAHL05的分子量最大，為38.9 kD；理論等電點(diǎn)介于7.07～10.01之間。大多數(shù)胡楊A(yù)HL蛋白不穩(wěn)定指數(shù)大于40；蛋白質(zhì)總平均親水性為—0.513～—0.175。

2.2胡楊A(yù)HL基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

為研究胡楊A(yù)HL家族成員的基因結(jié)構(gòu)特性，使用GSDS在線(xiàn)網(wǎng)站對(duì)其進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析（圖1）。結(jié)果顯示，19個(gè)PeAHL基因均無(wú)內(nèi)含子，并且在PeAHL家族成員中PeAHL01的外顯子長(zhǎng)度最短，PeAHL11最長(zhǎng)。非編碼區(qū)最長(zhǎng)是PeAHL14，最短為PeAHL08。

2.3胡楊A(yù)HL基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

使用MEME在線(xiàn)軟件對(duì)胡楊A(yù)HL家族成員進(jìn)行保守序列分析。結(jié)果顯示，胡楊A(yù)HL基因家族含有11個(gè)保守基序（圖2 A），長(zhǎng)度為7～50 aa，19個(gè)PeAHL基因均含有數(shù)量不等的AT-hook保守基序和PPC結(jié)構(gòu)域。在胡楊A(yù)HL基因家族中除PeAHL01基因只含有2個(gè)保守基序外，其余成員均含有7個(gè)以上的基序。其中motif 3和motif 6是胡楊A(yù)HL基因家族的AT-hook保守基序，且motif 6為AT-hook基序I型，motif 3為AT-hook基序II型。motif 4則為PPC結(jié)構(gòu)域。

從序列比對(duì)中可以看到（圖2 B），除PeAHL01基因含有PPC結(jié)構(gòu)域I型（LRSH）外，其他基因均為PPC結(jié)構(gòu)域II型（FTPH）。胡楊A(yù)HL基因家族中只有PeAHL01基因?yàn)镮型AHL基因；PeAHL04，PeAHL05，PeAHL06，PeAHL08，PeAHL09，PeAHL10，PeAHL11，PeAHL12，PeAHL13，PeAHL14，PeAHL16共11個(gè)基因?yàn)镮I型AHL基因；其他PeAHL02，PeAHL03，PeAHL07，PeAHL15，PeAHL17，PeAHL18，PeAHL19共7個(gè)基因?yàn)镮II型AHL基因。

2.4胡楊A(yù)HL基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為了探究19個(gè)胡楊A(yù)HL基因家族的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA 7.0軟件，采用最大似然法，結(jié)合檢索得到的18個(gè)毛果楊A(yù)HL基因和29個(gè)擬南芥AHL基因的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)果顯示，胡楊A(yù)HL家族成員按照AHL基因的類(lèi)型可分為Clade-I，Clade-II和Clade-III三大分支以及8個(gè)亞族；Clade-II包含A2，A3，A4和A5亞族，A6，A7，A8亞族屬于Clade-III，Clade-I只包含A1亞族。結(jié)果顯示胡楊、毛果楊和擬南芥的AHL家族成員沒(méi)有形成單獨(dú)聚類(lèi)的進(jìn)化分支，表明3個(gè)物種的AHL基因家族間存在一定程度的同源性，同時(shí)AHL基因家族在進(jìn)化上出現(xiàn)了很大的分化。

2.5胡楊A(yù)HL基因家族亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖4），19個(gè)胡楊A(yù)HL基因家族成員在細(xì)胞核中全部表達(dá)；且分別有11個(gè)基因和12個(gè)基因在葉綠體和細(xì)胞膜中有較高程度的表達(dá)，而在細(xì)胞質(zhì)、線(xiàn)粒體和液泡中基因表達(dá)的數(shù)量分別為9個(gè)、8個(gè)和7個(gè)。

2.6胡楊A(yù)HL基因家族順式作用元件分析

使用Plant CARE在線(xiàn)分析軟件對(duì)19個(gè)胡楊A(yù)HL基因上游2 kb堿基序列進(jìn)行順式作用元件分析（圖5）。結(jié)果顯示，除PeAHL08，PeAHL13，PeAHL18這三個(gè)基因外，其余16個(gè)PeAHL基因共發(fā)現(xiàn)了35種共126個(gè)作用元件。這些元件主要分為非生物脅迫響應(yīng)、植物激素響應(yīng)和發(fā)育響應(yīng)3大類(lèi)。非生物脅迫響應(yīng)元件具有11種57個(gè)順式元件，其中ARE（Anaerobic，厭氧誘導(dǎo)調(diào)節(jié)元件）、MYB（Myeloblastosis，干旱脅迫應(yīng)答元件）和MYC（Myelocytomatosis，干旱和ABA應(yīng)答順式作用元件）分別占非生物脅迫響應(yīng)元件總個(gè)數(shù)的30%，23%和14%。植物激素響應(yīng)元件具有8種共20個(gè)順式元件，其中TCA-elment（生長(zhǎng)素應(yīng)答元件）、P-box（赤霉素應(yīng)答元件）和ERE（乙烯應(yīng)答元件）分別占植物激素響應(yīng)元件總個(gè)數(shù)的25%，20%和15%。發(fā)育響應(yīng)元件具有16種共49個(gè)順式元件，其中有43個(gè)屬于光響應(yīng)元件。上述分析表明，胡楊應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)AHL基因可能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，特別是在干旱脅迫方面。

2.7PeAHLs在逆境脅迫下的表達(dá)模式

依據(jù)順式作用元件分析，篩選含逆境響應(yīng)相關(guān)的元件數(shù)量最多的PeAHL03，PeAHL04，PeAHL10，PeAHL12，PeAHL14和PeAHL15成員進(jìn)行qRT-PCR分析（圖6）。所選的6個(gè)基因經(jīng)不同時(shí)間的低溫、高溫、NaCl和PEG處理后，表達(dá)量與對(duì)照（0 h）相比均表現(xiàn)為上調(diào)，說(shuō)明胡楊A(yù)HL基因家族受低溫、高溫、NaCl和PEG誘導(dǎo)。PeAHL14和PeAHL15低溫處理下與對(duì)照及其它基因相比，表達(dá)量顯著上調(diào)，分別在6 h和12 h時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明PeAHL14和PeAHL15在胡楊響應(yīng)低溫脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。除PeAHL15以外，其余5個(gè)基因PeAHL03，PeAHL04，PeAHL10，PeAHL12和PeAHL14在PEG處理下與對(duì)照相比表達(dá)量均顯著上調(diào)，說(shuō)明胡楊A(yù)HL家族成員可能受PEG顯著誘導(dǎo)。結(jié)果表明，AHL基因家族在胡楊響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其對(duì)干旱脅迫響應(yīng)尤為顯著。

3討論

近年來(lái)，對(duì)于A(yíng)T-hook的研究主要集中在擬南芥［21］、水稻［8］、番茄［10］等多種作物上，對(duì)林木植物胡楊A(yù)HL基因家族方面的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)同源搜索的方法，在胡楊全基因組水平上共得到了19個(gè)胡楊A(yù)HL基因家族成員，在理化性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，胡楊A(yù)HL蛋白序列之間的差異較小。并且除PeAHL16外，其余PeAHL蛋白均為堿性的不穩(wěn)定親水蛋白。

在保守基序分析中，19個(gè)胡楊A(yù)HL基因均含有不等數(shù)量的AT-hook保守基序和PPC結(jié)構(gòu)域，且多數(shù)基因含有2個(gè)AT-hook保守基序，表明PeAHL基因具有高度保守性。并且在11個(gè)保守基序中，motif1，motif2，motif3，motif4，motif5和motif6為胡楊A(yù)HL家族成員的重要保守基序，除特殊的PeAHL01基因以外，大多數(shù)motif出現(xiàn)在其余18個(gè)基因中。而且聚類(lèi)在同一分支中的基因其motif組成及排列順序基本相同?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，胡楊A(yù)HL基因家族全部屬于內(nèi)含子缺失型基因。內(nèi)含子缺失型基因在非生物脅迫下能夠有效減少轉(zhuǎn)錄后的加工過(guò)程，可快速轉(zhuǎn)錄和翻譯［30］，推測(cè)這可能與胡楊超強(qiáng)的抗逆境脅迫能力有關(guān)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，Clade-I中I型AHL基因在整個(gè)基因家族進(jìn)化中形成了單獨(dú)的一個(gè)分支，結(jié)合基因結(jié)構(gòu)分析表明I型AHL基因確實(shí)為原始無(wú)內(nèi)含子基因。這與玉米［24］和棉花［23］的AHL基因家族所報(bào)道的研究結(jié)果相一致，II型和III型AHL基因被認(rèn)為是由I型AHL基因進(jìn)化而來(lái)，并且I型AHL基因是最原始的AHL基因。盡管大約在800～1 400萬(wàn)年前胡楊和毛果楊開(kāi)始出現(xiàn)分化［31］，但胡楊與毛果楊A(yù)HL的基因數(shù)目基本相同，在進(jìn)化樹(shù)中胡楊A(yù)HL基因數(shù)目與毛果楊基本上一一對(duì)應(yīng)，特別是I型AHL基因兩者數(shù)量相同，進(jìn)一步驗(yàn)證了AHL基因在進(jìn)化過(guò)程中的高度保守性。經(jīng)亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，胡楊A(yù)HL基因家族19個(gè)成員全部定位于細(xì)胞核中，這與前人研究AT-hook蛋白大多定位于細(xì)胞核的結(jié)論一致［32］，表明PeAHL為核定位蛋白。

在生物體中，基因啟動(dòng)子區(qū)域位于基因的上游，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，稱(chēng)為順式作用元件，在應(yīng)激反應(yīng)下的基因表達(dá)生物學(xué)調(diào)控中起著重要作用［33］。本研究通過(guò)順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，所有序列共分為3大類(lèi)型，非生物脅迫響應(yīng)元件占總數(shù)量的45%，植物激素響應(yīng)元件和發(fā)育響應(yīng)元件各占39%和16%。其中響應(yīng)干旱脅迫的元件的種類(lèi)和數(shù)量最多，其次為光響應(yīng)元件，表明胡楊A(yù)HL基因家族在抵抗逆境脅迫方面發(fā)揮著重要的作用。這與相關(guān)研究結(jié)果一致，在棉花AHLs啟動(dòng)子上游2 100 bp區(qū)域中，鑒定得出了光響應(yīng)、MYB和赤霉素響應(yīng)等順式作用元件，約43.5%的被選基因含有與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)［23］，并且在葡萄AHL基因家族中，其所鑒定的順式作用元件也主要包括光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和應(yīng)激響應(yīng)元件［34］。qRT-PCR結(jié)果分析顯示，胡楊A(yù)HL家族成員在不同逆境脅迫下的表達(dá)量與對(duì)照相比均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明AHL基因家族在胡楊生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。這與李小蘭的研究結(jié)果相一致［34］，葡萄在PEG、氯化鈉和低溫脅迫下，大多數(shù)AHL基因的表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加。同樣木薯中的AHL31基因也會(huì)受到低溫、脫落酸（ABA）和赤霉素（GA3）的顯著誘導(dǎo)［35］。除PeAHL15以外，其余5個(gè)基因在干旱脅迫下的表達(dá)量與對(duì)照及其它處理相比上調(diào)顯著，故推測(cè)AHL基因家族主要參與胡楊對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。這與王敏的研究結(jié)果相一致［22］，在干旱脅迫條件下，大豆葉片中AHL基因的表達(dá)顯著增加，表明AHL基因參與了大豆對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。同時(shí)，AHL基因在其他植物中也表現(xiàn)出相同的研究結(jié)果，擬南芥的AHL10已被證明通過(guò)控制根的伸長(zhǎng)來(lái)參與對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)［36］。在干旱脅迫下，OsAHL1可以大大提高水稻植株的抗旱性，其過(guò)表達(dá)OsAHL1也可增強(qiáng)水稻植株在幼苗和穗狀發(fā)育階段的多重脅迫耐受性［37］。通過(guò)對(duì)玉米的不同組織和發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，干旱反應(yīng)就是AHL基因共同調(diào)控的主要過(guò)程之一，并且AHL蛋白在調(diào)節(jié)其他應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要的作用［24］。綜合上述結(jié)論也進(jìn)一步印證了順式作用元件的分析結(jié)果。

4結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)胡楊A(yù)HL家族成員的分布、結(jié)構(gòu)及功能展開(kāi)了討論分析，共鑒定得出19個(gè)PeAHL基因，全部為內(nèi)含子缺失型基因，且絕大多數(shù)PeAHL蛋白為堿性的不穩(wěn)定親水蛋白。根據(jù)保守基序?qū)⑺谢蚍譃?種類(lèi)型，具有相對(duì)保守的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并鑒定出多個(gè)與激素和非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，篩選的PeAHLs在低溫、高溫、NaCl以及PEG處理后均出現(xiàn)不同程度上調(diào)表達(dá)，且在PEG處理下表達(dá)量最高，推測(cè)胡楊A(yù)HL基因在響應(yīng)干旱脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，為進(jìn)一步研究和篩選優(yōu)良抗逆胡楊A(yù)HL基因提供理論依據(jù)和參考。

參考文獻(xiàn)

［1］ARAVIND L，LANDSMAN D. AT-hook motifs identified in a wide variety of DNA-binding proteins［J］. Nucleic Acids Research，1998，26（19）：4413-4421

［2］LI K，YANG J，CHEN J，et al. High mobility group AT-hook 2 and c-MYC as potential prognostic factors in pancreatic ductal adenocarcinoma［J］. Oncology Letters，2020，19（2）：1584-1592

［3］SˇIRL M，SˇNAJDROV T，GUTIRREZ-ALANS D，et al. At-Hook motif nuclear localised protein 18 as a novel modulator of root system architecture［J］. International Journal Of Molecular Sciences，2020，21（5）：1886

［4］RODRGUEZ J，MOSQUERA J，COUCEIRO J R，et al. The AT-Hook motif as a versatile minor groove anchor for promoting DNA binding of transcription factor fragments［J］. Chemical Science，2015，6（8）：4767-4771

［5］FILARSKY M，ZILLNER K，ARAYA I，et al. The extended AT-hook is a novel RNA binding motif［J］. RNA Biology，2015，12（8）：864-876

［6］HUTH J R，BEWLEY C A，NISSEN M S，et al. The solution structure of an HMG-I（Y）-DNA complex defines a new architectural minor groove binding motif［J］. Nature Structural amp; Molecular Biology，1997，4（8）：657-665

［7］FUJIMOTO S，MATSUNAGA S，YONEMURA M，et al. Identification of a novel plant MAR DNA binding protein localized on chromosomal surfaces［J］. Plant Molecular Biology，2004，56（2）：225-239

［8］張貴慰，曾玨，郭維，等. 水稻AT-hook基因家族生物信息學(xué)分析［J］. 植物學(xué)報(bào)，2014，49（1）：49-62

［9］王元元，劉姣，郭育強(qiáng)，等. AT-hook蛋白的最新研究進(jìn)展［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2020，39（2）：713-717

［10］丁麗雪，李濤，李植良，等. 番茄AT-hook基因家族的鑒定及脅迫條件下的表達(dá)分析［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2016，17（2）：303-315

［11］ZHAO J，F(xiàn)AVERO D S，QIU J，et al. Insights into the evolution and diversification of the AT-hook Motif Nuclear Localized gene family in land plants［J］. BMC Plant Biology，2014，14：266

［12］MATSUSHITA A，F(xiàn)URUMOTO T，ISHIDA S，et al. AGF1，an AT-hook protein，is necessary for the negative feedback of AtGA3ox1 encoding GA 3-oxidase［J］. Plant Physiology，2007，143（3）：1152-1162

［13］VOM ENDT D，SOARES E SILVA M，KIJNE J W，et al. Identification of a bipartite jasmonate-responsive promoter element in the Catharanthus roseus ORCA3 transcription factor gene that interacts specifically with AT-Hook DNA-binding proteins［J］. Plant Physiology，2007，144（3）：1680-1689

［14］LU H，ZOU Y，F(xiàn)ENG N. Overexpression of AHL 20 negatively regulates defenses in Arabidopsis［J］. J Journal of Integrative Plant Biology，2010，52（9）：801-808

［15］吳平，趙健，王文麗，等. 額濟(jì)納綠洲胡楊生物生態(tài)學(xué)特性的調(diào)查［J］. 內(nèi)蒙古草業(yè)，2005，17（03）：4-6，13

［16］潘瑩萍，陳亞鵬，王懷軍，等. 胡楊（Populus euphratica）葉片結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系［J］. 中國(guó)沙漠，2018，38（4）：765-771

［17］徐茜，陳亞寧. 胡楊莖木質(zhì)部解剖結(jié)構(gòu)與水力特性對(duì)干旱脅迫處理的響應(yīng)［J］. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，20（8）：1059-1065

［18］LING H B，ZHANG P，XU H L，ZHAO X F. How to regenerate and protect desert riparian Populus euphratica forest in arid areas［J］. Scientific Reports，2015，5：15418

［19］湯奇成，張捷斌. 西北干旱地區(qū)水資源與生態(tài)環(huán)境保護(hù)［J］. 地理科學(xué)進(jìn)展，2001，20（3）：226-232

［20］王海珍，徐雅麗，張翠麗，等. 干旱脅迫對(duì)胡楊和灰胡楊幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及抗氧化酶活性的影響［J］. 干旱區(qū)資源與環(huán)境，2015，29（12）：125-130

［21］XIAO C W，CHEN F L，YU X H，et al. Over-expression of an AT-hook gene，AHL22，delays flowering and inhibits the elongation of the hypocotyl in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Molecular Biology，2009，71（1-2）：39-50

［22］WANG M，CHEN B，ZHOU W，et al. Genome-wide identification and expression analysis of the AT-hook Motif Nuclear Localized gene family in soybean［J］. BMC Genomics，2021，22（1）：361

［23］ZHAO L，LYU Y，CHEN W，et al. Genome-wide identification and analyses of the AHL gene family in cotton （Gossypium）［J］. BMC Genomics，2020，21（1）：69

［24］BISHOP E H，KUMAR R，LUO F，et al. Genome-wide identification，expression profiling，and network analysis of AT-hook gene family in maize［J］. Genomics，2020，112（2）：1233-1244

［25］MA T，WANG J Y，ZHOU G K，et al. Genomic insights into salt adaptation in a desert poplar［J］. Nature Communications，2013，4：2797

［26］杜雨，劉筠，胡曉桐，等. 黑果枸杞GRF轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定與生物信息學(xué)分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（6）：1403-1412

［27］易丹，王博，段慧榮，等. 白刺14-3-3基因家族的鑒定及表達(dá)分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2021，29（3）：443-456

［28］周濤，彭輝，喻望晨，等.千穗谷TCP基因家族生物信息學(xué)分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（4）：867-87

［29］馮冠楠，安聰，丁鋆嘉，等. 狗尾草GASA基因家族鑒定及其在不同逆境下表達(dá)模式分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（6）：1379-1387

［30］JEFFARES D C，PENKETT C J，BHLER J. Rapidly regulated genes are intron poor［J］. Trends In Genetics，2008，24（8）：375-378

［31］賈會(huì)霞，李建波，孫佩，等. 胡楊CBF基因家族的鑒定及表達(dá)特性分析［J］. 分子植物育種，2017，15（2）：492-500

［32］ZHAO J F，F(xiàn)AVERO D S，PENG H，et al Arabidopsis thaliana AHL family modulates hypocotyl growth redundantly by interacting with each other via the PPC/DUF296 domain，Proc［J］. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America，2013，110（48）：E4688-4697

［33］WITTKOPP P J，KALAY G. Cis-regulatory elements：molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence［J］. Nature Reciews Genetics，2011，13（1）：59-69

［34］LI X L，HE H H，WANG H，et al. Identification and expression analysis of the AHL gene family in grape （Vitis vinifera）［J］. Plant Gene，2021，26：100285

［35］郭育強(qiáng). 木薯中與MeCWINV6基因啟動(dòng)子互作的轉(zhuǎn)錄因子篩選及生物信息學(xué)分析［D］. 海口：海南大學(xué)，2017：38-39

［36］WONG M M，BHASKARA G B，WEN T N，et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation［J］. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America，2019，116（6）：2354-2363

［37］ZHOU L G，LIU Z C，LIU Y H，et al. A novel gene OsAHL1 improves both drought avoidance and drought tolerance in rice［J］. Scientific Reports，2016，6：30264

（責(zé)任編輯閔芝智）