摘要：為探索柱花草（Stylosanthes guianensis）根系分泌物對缺磷脅迫的響應(yīng)，本研究以‘熱研5號’柱花草為材料，通過水培試驗(yàn)，分析了正常供磷（+P）和缺磷（-P）處理對柱花草生長及根系分泌物的影響。結(jié)果表明，相對于+P處理，-P處理顯著降低了柱花草植株干重和全磷含量。隨后，代謝組共檢測到101個(gè)根系分泌代謝物，可被分為有機(jī)酸、氨基酸、類黃酮、糖及醇類等七類，其中-P與+P處理間的差異累積代謝物25個(gè)。屬于有機(jī)酸的咖啡酸、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸和α-酮戊二酸在-P處理下的分泌量顯著增加，且其中α-酮戊二酸對磷酸鋁具有較強(qiáng)的溶解能力。此外，熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，柱花草根系中參與α-酮戊二酸合成的檸檬酸脫氫酶基因SgICDH在-P處理下的表達(dá)量顯著增加。因此，柱花草根系通過上調(diào)SgICDH基因的表達(dá)，促進(jìn)α-酮戊二酸的合成與分泌，從而增強(qiáng)對難溶性磷的活化利用，以適應(yīng)缺磷脅迫。

關(guān)鍵詞：柱花草；缺磷脅迫；根系分泌物；代謝組學(xué)；有機(jī)酸

中圖分類號：Q945.79文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-0435（2023）03-0733-08

Analysis on the Response of Root Exudates to Phosphorus

Deficiency in Stylosanthes guianensis

ZHAO Cang1， WU Yuan-hang1， ZHAO Xing-kun1， SUN Hao1， YANG Li-yun1， LIU Pan-dao2*， LUO Li-juan1*

（1.College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China； 2.Tropical Crops Genetic Resources

Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan Province 571101， China）

Abstract：To explore the response of root exudates to phosphorus （P） deficiency in stylo （Stylosanthes guianensis），in this study，the effects of normal P supply （+P） and P deficiency （-P） on the growth and root exudates of stylo variety Reyan No.5 were analyzed with hydroponic experiments. The results showed that P deficiency stress significantly decreased plant dry weight and toal P content of stylo. Subsequently，a total of 101 root secretory metabolites had been detectd out in the root metabolome. These metabolites belonged to seven categories，such as organic acids，amino acids，flavonoids，saccarides and alcohols. Among them，there were 25 differential accumulation metabolites between -P and +P treatments. The secretions of three organic acids：caffeic acid，1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，and α-ketoglutaric acid were significantly increased under -P treatment;and among them，α-ketoglutaric acid was able to efficiently solubilize aluminum phosphate. By fluorescence quantitative PCR technique，it was revealed that the expression of SgICDH，a citrate dehydrogenase gene involved in α-ketoglutarate synthesis in stylo roots，was significantly increased under -P treatment. In summary，stylo roots promote the synthesis and secretion of α-ketoglutarate through up-regulation of SgICDH gene expression，thereby enhancing the utilization of insoluble P to adapt to low -P stress.

Key words：Stylosanthes guianensis;Phosphorus deficiency;Root exudates;Metabonomics;Organic acids

磷（Phosphorus，P）是植物生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素之一，參與了光合作用、能量代謝和信號傳導(dǎo)等生理生化過程，也是許多生物大分子的重要組成部分［1］。無機(jī)正磷酸鹽（PO3-4;orthophosphate，Pi）是植物根系能夠直接吸收利用的有效磷形式，但土壤中大多數(shù)磷以不能被根系直接吸收的有機(jī)磷或難溶性無機(jī)磷形式存在［2］。在酸性土壤中，Pi容易與鐵、鋁的氧化物和氫氧化物相互作用形成難溶性磷，導(dǎo)致土壤中有效磷濃度難以滿足植物正常生長發(fā)育的需求，限制了作物的正常生長［3］。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，施用磷肥可以有效應(yīng)對土壤缺磷問題，但是磷肥的過量施用加速了土壤退化和造成水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題［4］。因此，研究植物對低磷脅迫的適應(yīng)機(jī)制，并形成相關(guān)理論指導(dǎo)磷高效作物新品種的選育，對農(nóng)作物與牧草生產(chǎn)的“減肥增效”具有重要意義［5］。

植物根系在適應(yīng)低磷脅迫中發(fā)揮著重要作用，相關(guān)機(jī)制主要包括：調(diào)整根系形態(tài)和構(gòu)型、根系分泌物增加、與菌根真菌建立共生系統(tǒng)、提高磷轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)等［6-7］。其中，根系分泌物被認(rèn)為在土壤潛在磷庫的活化利用中發(fā)揮重要作用［8］。根系分泌物是指植物在生長過程中，根系的不同部位向其生長介質(zhì)分泌的一系列物質(zhì)總稱，它們由多種低分子量和高分子量成分組成，包括有機(jī)酸、氨基酸、糖、酚類、萜類、脂肪酸、蛋白質(zhì)、粘液和核酸等［9］。其中，低分子量有機(jī)酸（Low molecular weightorganic acids，LMWOAs）已被證明通過螯合和酸化作用促進(jìn)難溶性磷酸鹽釋放Pi以供植物根系吸收［10］，主要包括檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等羧酸［11-13］。這些羧酸主要通過三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）合成［14］。TCA循環(huán)是生物體內(nèi)所有有氧過程的中心代謝途徑，此途徑依賴多種酶的參與，其中異檸檬酸脫氫酶（NADP-isocitrate dehydrogenase，ICDH）催化該循環(huán)的第一個(gè)氧化脫羧反應(yīng)，生成α-酮戊二酸、NADPH和CO［14］2。目前已經(jīng)在小麥［15］、擬南芥［16］、豌豆［17］等植物中發(fā)現(xiàn)ICDH在適應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

柱花草（Stylosanthes guianensis）是一種優(yōu)良的豆科牧草與綠肥作物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，對酸性土壤中的缺磷、鋁毒害和錳毒害等脅迫具有較好的適應(yīng)性［18］。柱花草根系分泌有機(jī)酸是其耐鋁毒害和錳毒害的重要機(jī)制［19］，但是，根系分泌物是否參與了柱花草對缺磷脅迫的適應(yīng)仍不清楚。因此，本研究利用代謝組學(xué)等技術(shù)，鑒定柱花草參與難溶性磷溶解的根系分泌代謝物，以期為進(jìn)一步探索柱花草適應(yīng)缺磷脅迫機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1植物材料和培養(yǎng)條件

本研究所用的‘熱研5號’圭亞那柱花草（Stylosanthes guianensis ‘Reyan No.5’）種子由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究中心提供。柱花草的營養(yǎng)液水培方法如下：種子去種皮后于80℃熱激3 min，在濕潤的濾紙上萌發(fā)3 d，將幼苗移栽到改良的Magnavaca營養(yǎng)液［20］中預(yù)培養(yǎng)6 d。隨后，選擇長勢良好、均一的幼苗，分別轉(zhuǎn)移至缺磷（-P，0 μmol·L-1 KH2PO4）和正常供磷（+P，300 μmol·L-1 KH2PO4）的Magnavaca營養(yǎng)液中進(jìn)行處理，每隔5 d更換一次營養(yǎng)液。分別在處理后4，8，12 d和16 d后收取地上部和根部樣品（每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)），用于測定干重、全磷含量和代謝組分析等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1植株干重與全磷含量測定樣品收獲后放入烘箱中105℃殺青20 min，70℃恒溫烘干至恒重后用天平稱量干重。樣品粉碎后，稱取0.07 g干樣，600℃灰化10 h，然后參照Murphy等［21］鉬銻抗比色法測定OD700吸光度值，計(jì)算全磷含量。

1.2.2根系分泌物的收集根系分泌物收集參照Sun等［22］的方法，將-P和+P處理16 d植株從水培裝置小心取出，用去離子水沖洗根部數(shù)次，后將植株的整個(gè)根系放入含有收集液（去離子水，用硫酸調(diào)至pH 5.9）的遮光錐形瓶中，收集24 h后，取出植株，稱取根部鮮重，將收集液用20目紗布過濾后定量到等根重，然后將收集液用真空冷凍干燥儀（Marin Christ，德國）凍干，用于后續(xù)的代謝組分析。

1.2.3根系分泌物的廣泛靶向代謝組分析收集的柱花草根系分泌物，參照Ning等［23］的廣泛靶向代謝組分析方法，委托武漢邁特維爾生物科技有限公司進(jìn)行分析。簡要步驟如下，取0.1 g凍干樣品溶解于1 mL70%甲醇水溶液，4℃過夜提取。后將提取液過濾用于超高效液相色譜（UPLC，SHIMADZU Nexera X2，日本島津）串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（MS/MS，Applied Biosystems 4500 Q TRAP，美國Applied Biosystems）分析。UPLC和MS的樣品上機(jī)分析參數(shù)根據(jù)Ning等［23］的方法設(shè)置?；谖錆h邁特維爾生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫MWDB（Metware database）對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行定性鑒定。利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple reaction monitoring，MRM），根據(jù)特征碎片離子的峰面積對代謝物進(jìn)行定量分析。差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）≥ 2或≤ 0.5的代謝物被定義為差異積累代謝物（Differentially accumulated metabolites，DAMs）。

1.2.4有機(jī)酸溶解難溶性磷能力分析參照Pantigoso等［24］的方法，分別稱取0.02 g磷酸鐵（FePO4）和磷酸鋁（AlPO4）（購自Sigma，使用前用ddH2O洗滌，直至上清液用磷測試盒檢測為不含磷后，風(fēng)干使用），加入2 ml的10 mmol·L-1的有機(jī)酸溶液，置于250 rpm的水平搖床上，72 h后，在6 000 rpm下離心5 min，取上清用0.2 μm的過濾器過濾后，參照Murphy和Riley［21］的鉬銻抗顯色法測定磷釋放量，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5SgICDH蛋白進(jìn)化樹分析和響應(yīng)缺磷處理的表達(dá)模式分析本課題組前期的柱花草根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定了1個(gè)SgICDH編碼基因［25］，編碼區(qū)序列信息已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），注冊號：OK356622。此外，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載了擬南芥、大豆、玉米、胡蘿卜等植物共18個(gè)ICDH的蛋白序列，并與SgICDH一起，采用MEGA 11 軟件構(gòu)建蛋白進(jìn)化樹。

參照Luo等［26］方法，通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR（qRT-PCR）分析SgICDH在-P和+P處理的柱花草根系的相對表達(dá)量。簡要步驟如下，利用TR-Izol試劑（Invitrogen Inc，美國）提取柱花草根系樣品RNA，并用Vazyme公司的HiScript II 1 st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。使用Rotor-Gene Q儀器（Qiagen，Hilden，德國）和SYBR qPCR Master Mix定量試劑盒（Vazyme，中國）進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL 2X SYBR qPCR Master mix，1.6 μL引物（10 μmol·L-1），2 μL cDNA模板，6.4 μL ddH2O。反應(yīng)條件為95℃ 30 s，94℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。SgICDH的qRT-PCR引物為‘OK356622-F：GGTTCATCAAAAAGGAGGGGAAAC；OK356622-R：ATCTTCCCGGCCTCCACTACTC’。以SgEF-1a（NCBI注冊號：JX164254）為內(nèi)參基因，其qRT-PCR引物為‘SgEF-1a-F：CACTTCAGGACGTGTACAAGA TC；SgEF-1a-R：CTTGGAGAGCTTCATGGTGCA’。SgICDH的相對表達(dá)量=SgICDH表達(dá)量/SgEF-1a表達(dá)量。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 365軟件（Microsoft，美國）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和可視化作圖，使用SPSS 26軟件（IBM-SPSS，美國）進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1缺磷處理對柱花草生長的影響

如圖1A所示，-P與+P處理的植株表型在4 d和8 d無明顯差異，從處理12 d開始出現(xiàn)差異，主要表現(xiàn)為-P條件下植株矮小、復(fù)葉數(shù)減少、葉片發(fā)育受阻，且隨著處理時(shí)間加長（16 d），表型差異越大。植株干重在處理的前8 d無顯著差異，但-P處理12 d和16 d的植株干重分別比+P處理顯著減少了59.66%和75.38%（圖1 B）。對于全磷含量，4～16 d時(shí)-P處理的全磷含量僅為+P處理的3.01%～26.83%，差異極顯著（Plt;0.001）（圖1 C）。

2.2缺磷處理對柱花草根系分泌物的影響

收集-P與+P處理的柱花草根系分泌物，利用廣泛靶向代謝組進(jìn)行分析。共鑒定到101個(gè)代謝物，其中DAMs為25個(gè)，包括16個(gè)受-P處理上調(diào)的DAMs和9個(gè)受-P處理下調(diào)的DAMs（圖2 A）。被鑒定的代謝物可被分為7類，包括22個(gè)有機(jī)酸、18個(gè)核苷酸及其衍生物、15個(gè)氨基酸、13個(gè)類黃酮、12個(gè)游離脂肪酸、11個(gè)維生素和10個(gè)糖和醇類（圖2 B）。

如圖3所示，屬于氨基酸的4個(gè)DAMs，缺磷處理上調(diào)的有3個(gè)（L-精氨酸、L-天冬氨酸和L-色氨酸），下調(diào)的有1個(gè)（L-組氨酸）；屬于維生素的3個(gè)DAMs，缺磷處理上調(diào)的有2個(gè)（脫氫抗壞血酸和4-吡哆酸），下調(diào)的有1個(gè)（煙酸核糖核苷）；屬于有機(jī)酸的5個(gè)DAMs，缺磷處理上調(diào)的有3個(gè)（咖啡酸、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸和α-酮戊二酸），下調(diào)的有2個(gè)（鄰苯二甲酸和2-異丙基蘋果酸）；屬于糖及醇類的3個(gè)DAMs，缺磷處理上調(diào)的有2個(gè)（D-葡萄糖醛酸和木糖醇），下調(diào)的有1個(gè)（D-阿拉伯糖）；屬于類黃酮的兩個(gè)DAMs（美迪紫檀素和紅車軸草素）受缺磷處理誘導(dǎo)上調(diào)；屬核苷酸及其衍生物的7個(gè)DAMs，缺磷處理上調(diào)的有3個(gè)（蟲草素、2′-脫氧鳥苷和2′-脫氧肌苷），下調(diào)的有4個(gè)（胞苷、胸腺嘧啶、腺苷-5′-單磷酸和黃苷）；屬于游離脂肪酸的1個(gè)DAM（十二烷酸）受缺磷處理誘導(dǎo)上調(diào)。

2.3有機(jī)酸對難溶性磷的溶解能力分析

柱花草根系的3種有機(jī)酸（咖啡酸、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸和α-酮戊二酸）在缺磷處理下的分泌量增加（圖3），我們分析了這3種有機(jī)酸對兩種難溶性無機(jī)磷（磷酸鋁和磷酸鐵）的溶磷能力。如表1所示，α-酮戊二酸對磷酸鋁的磷釋放速率為5.18 μmol·mmol-1·h-1，表明其對磷酸鋁具有較強(qiáng)的溶磷能力，但α-酮戊二酸對磷酸鐵只有微弱的溶解能力。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸對磷酸鋁具有微弱的溶解能力，但對磷酸鐵無溶解能力?？Х人釋τ趦煞N難溶磷均無溶解能力。

2.4柱花草根系中SgICDH基因響應(yīng)缺磷處理的表達(dá)模式分析

鑒于α-酮戊二酸對難溶性無機(jī)磷具有較強(qiáng)的溶解能力，我們分析了參與α-酮戊二酸合成的SgICDH（NCBI注冊號OK356622）在柱花草根系中響應(yīng)缺磷處理的表達(dá)模式。如圖4 A所示，處理4 d后，SgICDH在+P與-P處理的柱花草根系的表達(dá)量無顯著差異；但隨著處理時(shí)間的延長（8～16 d），-P處理根系的SgICDH表達(dá)量顯著增加，SgICDH在-P處理根系的表達(dá)量比+P處理增加了1.0～5.1倍，差異顯著（Plt;0.05）。隨后，將SgICDH和擬南芥、水稻以及大豆等植物的ICDHs構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)SgICDH與大豆中的S33612親緣關(guān)系最近，相似性為85.81%（圖4B）。

3討論

根系分泌物作為植物-土壤-微生物之間物質(zhì)和能量交流媒介，在調(diào)節(jié)環(huán)境脅迫、改善土壤結(jié)構(gòu)和活化土壤養(yǎng)分等方面均有不可替代的作用［27］。目前，從不同植物中已經(jīng)鑒定出豐富的根系分泌物種類，主要屬于有機(jī)酸、糖類、氨基酸、甾醇類、脂肪酸、激素、維生素、黃酮類、核苷酸等［28］。在本研究共鑒定柱花草根系分泌物7類共101個(gè)，分別屬于有機(jī)酸、氨基酸、類黃酮、游離脂肪酸、維生素、核苷酸及其衍生物、糖及醇類。在被鑒定的柱花草根系分泌物中，25個(gè)為受-P處理調(diào)控的DAMs，表明它們可能參與柱花草對低磷脅迫的適應(yīng)。

已有研究表明，在低磷脅迫環(huán)境下，植物根系會增加氨基酸、有機(jī)酸、糖及醇類等物質(zhì)的分泌，這些物質(zhì)通過影響根際有益微生物數(shù)量和多樣性，促進(jìn)難溶性磷與有機(jī)磷的活化，提高土壤的磷有效性［27］。本研究也發(fā)現(xiàn)，缺磷脅迫下柱花草根系3個(gè)氨基酸（L-精氨酸、L-天冬氨酸和L-色氨酸）、2個(gè)糖及醇類（D-葡萄糖醛酸和木糖醇）、3個(gè)有機(jī)酸（咖啡酸、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸和α-酮戊二酸）的分泌量顯著增加。植物根系分泌有機(jī)酸除了可作為根際微生物的碳源外，其另外一個(gè)作用是能直接溶解難溶性磷酸鹽釋放出Pi，以供植物根系吸收［29］。本研究中，對3種柱花草根系受-P處理調(diào)控增加分泌的有機(jī)酸進(jìn)行了難溶性磷溶解能力分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-酮戊二酸對難溶性磷酸鋁具有較強(qiáng)的溶磷能力。此外，本研究還從柱花草中克隆了1個(gè)參與α-酮戊二酸合成的異檸檬酸脫氫酶編碼基因SgICDH，該基因在根系中受-P處理上調(diào)表達(dá)，表明在低磷脅迫下柱花草通過提高SgICDH的表達(dá)來增加α-酮戊二酸的合成。

與有機(jī)酸類似，植物根系分泌的類黃酮也被證明能與鐵和鋁等金屬離子絡(luò)合，從而釋放被鐵和鋁固定的Pi［30］。例如，白羽扇豆和紫花苜蓿在低磷脅迫下會增加根系分泌的類黃酮，從而促進(jìn)難溶性磷的降解［31-32］。除直接的溶解難溶性磷的作用外，類黃酮也被報(bào)道參與了植物與叢枝菌根真菌（AMF）的互作，而AMF已被證明可以與植物形成共生系統(tǒng)，增強(qiáng)植物從土壤中吸收磷的能力［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，柱花草根系在-P處理下會增加美迪紫檀素和紅車軸草素這兩種類黃酮的分泌，其作用可能是多種復(fù)雜的，有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本研究利用廣靶代謝組學(xué)技術(shù)對柱花草根系分泌物進(jìn)行分析，共鑒定7類（101個(gè)）代謝物，其中α-酮戊二酸在-P處理下的分泌量顯著增加，α-酮戊二酸對難溶性磷酸鋁具有較強(qiáng)的溶解能力，參與α-酮戊二酸合成的SgICDH基因在柱花草根系中受-P處理誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)。因此，當(dāng)遭受低磷脅迫時(shí)，柱花草通過增加根系α-酮戊二酸的合成與分泌，增強(qiáng)對土壤難溶性磷的活化利用能力。

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（責(zé)任編輯彭露茜）