摘要：磷酸化是重要的蛋白翻譯后修飾，在調(diào)節(jié)植物免疫方面起重要作用，但目前對柱花草與炭疽菌互作的磷酸化知之甚少。本文以太空誘變柱花草抗病株系‘2001-84’和感病株系‘2001-71’為試驗(yàn)材料，通過非標(biāo)記定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，分析了兩種株系接種炭疽菌前后的差異磷酸化蛋白。結(jié)果表明：在‘2001-84’和‘2001-71’中分別有138個(gè)和106個(gè)蛋白的磷酸化豐度特異性響應(yīng)炭疽菌侵染。蛋白功能與代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)兩者具有明顯的差異：‘2001-84’特異性磷酸化蛋白主要定位在質(zhì)膜附近，參與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，并顯著富集在MAPK級聯(lián)信號通路、植物激素信號傳導(dǎo)、病原菌互作途徑等代謝通路；‘2001-71’則更多的定位于細(xì)胞器膜上，參與細(xì)胞器的分解，代謝通路只在剪接體途徑顯著富集。通過對‘2001-84’特異性磷酸化蛋白進(jìn)一步分析，發(fā)掘了跟抗病相關(guān)的蛋白。本文研究可為后續(xù)解析柱花草抗炭疽病的分子機(jī)制和培育柱花草抗病品種提供參考。

關(guān)鍵詞：柱花草；膠胞炭疽菌；磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)；抗病蛋白

中圖分類號：Q946.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-0435（2023）03-0699-11

Differential Phosphoproteomic Analysis of Stylosanthes in

Response to Colletotrichum gloeosporioides

ZHANG Shi-zi， YANG Li-yun， GAO Jing， WANG Fang， JIANG Ling-yan*

（College of Tropical Crops， Hainan University/Key Laboratory of Sustainable Utilization of Tropical Biological

Resources of Hainan Province， Haikou，Hainan Province 570228， China）

Abstract：Phosphorylation is an important post-translational modification of protein，which plays an important role in regulating plant immunity. However，little is known about the phosphorylation in the interaction between Stylosanthes spp. （stylo） and Colletotrichum gloeosporioides. In this study，label-free based phosphoproteomics technology was used to study the phosphoproteome change of disease-susceptible stylo line ‘2001-71’ and resistant line ‘2001-84’ infected with C. gloeosporioides，which were created by space flight mutation. It had been identified out 138 and 106 differentially phosphorylated proteins （DPPs） in ‘2001-84’ and ‘2001-71’ respectively in response to C. gloeosporioides infection specifically. By the analysis of protein function of DPPs and enrichment analysis of metabolic pathway，it was found out a significant difference existed between the resistant and susceptible lines. The specific DPPs in the line ‘2001-84’ were mainly located around the plasma membrane，involving into the intracellular signal transduction，and significantly enriched in the MAPK cascade signaling，plant hormone signaling and pathogen interaction pathway checked out by metabolic pathway analysis. The specific DPPs in the line ‘2001-71’ were mainly localized in organelle membrane，involving in organelle decomposition，and only significantly enriched in the spliceosome pathway. Further analysis on the specific DPPs in the line ‘2001-84’，some proteins relevant to disease resistance had been uncovered. This study could provide a basis for further analysis on the resistance mechanisms in stylo to the anthracnose and breeding resistant cultivars of stylo.

Key words：Stylosanthes;Colletotrichum gloeosporioides;Phosphoproteomics;Resistance protein

柱花草（Stylosanthes spp.）是熱帶地區(qū)廣泛種植的優(yōu)質(zhì)豆科牧草，因其適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高的特性，被廣泛用作牧草飼料喂養(yǎng)牲畜并用于豆科綠肥和林果草生態(tài)工程建設(shè)等［1-2］。柱花草炭疽病是一種危害柱花草葉、莖并具有再侵染特性的流行性病害，可造成葉片發(fā)黃，壞死脫落，莖、葉柄和頂芽枯萎，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降［3］。膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的侵染是引起柱花草炭疽病的主要病因［4］。炭疽菌侵染柱花草時(shí)，首先進(jìn)入活體營養(yǎng)階段，孢子在葉片角質(zhì)層形成黑化附著胞，并滲透侵入表皮細(xì)胞；隨后，產(chǎn)生不規(guī)則的初生菌絲，并進(jìn)一步向鄰近細(xì)胞擴(kuò)散；之后，轉(zhuǎn)變?yōu)樗荔w營養(yǎng)階段，產(chǎn)生大量次級菌絲，在鄰近組織的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)定植，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡［5］。目前，生產(chǎn)上主要通過化學(xué)農(nóng)藥、栽培措施和培育抗病品種等來防治柱花草炭疽病，其中培育抗病品種是最綠色的有效手段［6-7］。挖掘調(diào)控抗病關(guān)鍵因子，揭示其抗病分子機(jī)制，可在分子層面解析柱花草抗病機(jī)理，從而加速抗病品種的培育。

蛋白質(zhì)組成及其活性的變化是植物-微生物相互作用的主要驅(qū)動力［8］。蛋白質(zhì)翻譯后修飾（Post translational modification，PTM） 通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性、靶向或與其他蛋白質(zhì)的相互作用等，在許多細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。磷酸化是蛋白質(zhì)重要的PTM，蛋白質(zhì)磷酸化通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性和定位以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，在眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］，是植物響應(yīng)環(huán)境脅迫信號的重要機(jī)制［11］。通過解析植物受病原體侵染后蛋白磷酸化豐度變化，可以深入研究植物應(yīng)對生物脅迫的機(jī)制?；诟呔荣|(zhì)譜（Mass spectrometry，MS） 平臺的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)已廣泛應(yīng)用于植物蛋白質(zhì)組磷酸化研究［12］，且越來越多的用于研究植物與病原菌互作，以發(fā)掘關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而解析植物抗病調(diào)節(jié)機(jī)制。Yu等通過番茄（Solanum lycopersicum）感染丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）蛋白組學(xué)與磷酸蛋白組學(xué)研究，鑒定到225種蛋白質(zhì)和79種磷酸肽差異積累，表明蛋白質(zhì)豐度與磷酸化豐度的變化處于PTI或ETI期間，并主要參與鈣離子信號傳導(dǎo)、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)、激素的生物信號與傳導(dǎo)［13］。Li等通過比較不同抗性水稻（Oryza sativa L.）品種響應(yīng)稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）的磷酸化蛋白組，為挖掘水稻抗稻瘟菌的抗病蛋白和研究其分子機(jī)制提供了新的視角［14］。目前，尚未見到柱花草響應(yīng)炭疽菌侵染磷酸化蛋白的相關(guān)研究。

病原體侵染會觸發(fā)植物細(xì)胞中復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致易感性或抗性［12］。太空誘變柱花草抗病株系‘2001-84’與感病株系‘2001-71’對抵抗炭疽菌侵染表現(xiàn)出顯著差異。為探究形成這種差異的分子機(jī)制，本文利用非標(biāo)記定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較分析了‘2001-84’與‘2001-71’株系葉片響應(yīng)炭疽菌侵染的磷酸化蛋白表達(dá)差異，得到了抗病株系特異性響應(yīng)炭疽菌的抗病蛋白和相關(guān)磷酸化信號通路等信息，分析了其抗病機(jī)制，可為后續(xù)解析柱花草抗炭疽病的分子機(jī)制提供理論支持。

1材料與方法

1.1材料來源與處理

試驗(yàn)材料：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用空間輻射育種技術(shù)，對‘熱研2號’柱花草種子進(jìn)行了空間誘變處理，經(jīng)過連續(xù)4代大田選育和接種炭疽菌鑒定，篩選出綜合性狀優(yōu)良的17個(gè)空間誘變株系［15］。實(shí)驗(yàn)室前期通過對17份柱花草材料接種炭疽菌，發(fā)現(xiàn)不同株系對炭疽菌抗性具有顯著差異，本文選用其中抗病株系‘2001-84’和感病株系‘2001-71’作為試驗(yàn)材料。

炭疽菌菌株：炭疽菌菌株WC-02，為實(shí)驗(yàn)室前期采集于海南省文昌市柱花草種植區(qū)，經(jīng)分離和形態(tài)學(xué)與序列分析，鑒定其為膠胞炭疽菌［16］。

試驗(yàn)材料培養(yǎng)：取若干柱花草種子，80℃水浴熱激3 min；黑暗條件下催芽3天后，移植到裝有蛭石和營養(yǎng)土體積比為1∶1的育苗盒（7 cm×7 cm×10 cm）中；在平均溫度為28℃的室外大棚內(nèi)培養(yǎng)22～26天。

接種處理：活化炭疽菌菌株WC-02；挑取適量菌塊加入到完全培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3天；配制成（1×10）7 CFU·mL-1的孢子懸浮液，加入0.02%體積分?jǐn)?shù)的Silweet L-77備用；全株噴灑孢子懸浮液，直至葉片表面形成水膜；黑暗處理12 h后，移入光強(qiáng)為800 μmol·m-2·s-1的生長室中，期間維持溫度為28℃，空氣濕度90%以上［2］。收取接種前（0 h）葉片組織為對照組，接種4天為實(shí)驗(yàn)組，每40片葉片混合作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2葉片總蛋白的提取

稱取適量樣品，加入蛋白提取液（250 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1 HEPES-KOH，5% 甘油，50 mmol·L-1 NaPP，1 mmol·L-1 NaMo，25 mmol·L-1 NaF，10 mmol·L-1 EDTA，0.5% PVP）研磨，4℃，10 000 g離心10 min；取上清，加入等量Tris飽和酚使蛋白析出，4℃，10 000 g離心10 min，棄上清；加入等量抽提液（0.1 mol·L-1 Tris，0.02 mol·L-1 KCl，10 mmol·L-1 EDTA，0.4 % β-巰基乙醇）離心（4℃，10 000 g，10 min）抽提兩次；加入5倍體積甲醇溶解的NH4OAC沉淀蛋白，置于-20℃冰箱20 min；用1倍體積甲醇溶解的0.1 mol·L-1 NH4OAC和2倍體積 80% 丙酮洗滌蛋白沉淀。

1.3蛋白質(zhì)酶解

每個(gè)樣品取100 μg蛋白溶液，按蛋白∶酶=40∶1比例加入胰蛋白酶2.5 μg，37℃酶解4 h；酶解的肽段利用Strata X柱進(jìn)行除鹽，真空抽干。

1.4磷酸肽富集

加入上樣緩沖液（60%乙腈，2% 三氟乙胺，飽和谷氨酸，pH值2.0）將樣品蛋白濃度稀釋為0.75 μg·μL-1；在稀釋后的樣品中加入固體TiO2，離心（12 000 g，30 s）棄上清；利用洗滌緩沖液（60% 乙腈，0.5%三氟乙胺，pH值 2.5）洗滌沉淀4次；使用洗脫緩沖液Ⅰ（50%乙腈，300 mmol·L-1氨水，pH值11.0）與洗脫緩沖液Ⅱ（50% 乙腈，500 mmol·L-1氨水，pH值 11.0）將富集到的磷酸肽洗脫。

1.5質(zhì)譜鑒定LC-MS/MS

每個(gè)樣品取等量肽段混合成一管；混合后的樣品用流動相A （5% 乙腈，pH值9.8） 稀釋并進(jìn)樣，采用WATERS nanl/upLC液相系統(tǒng)，通過分離柱（5 mm 4.6×250 mm Gemini C18）對樣品進(jìn)行液相分離。以4 μL·min-1的流速梯度洗脫：5% 流動相B （95% 乙腈，pH值9.8） 10 min，5%至35%流動相B 40 min，35%至95%流動相B 1 min，流動相B持續(xù)3 min，5%流動相B平衡10 min。在214 nm波長下監(jiān)測洗脫峰并每分鐘收集一個(gè)組分，結(jié)合色譜洗脫峰圖合并樣品得到10個(gè)組分，然后冷凍抽干。

1.6蛋白質(zhì)鑒定與定量分析

用MASCOT （server version 2.3） 軟件檢索二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)庫為NCBI豆科和擬南芥（Arabidopsis thaliana）蛋白數(shù)據(jù)庫以及柱花草‘熱研2號’全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。利用iRT肽段對保留時(shí)間完成DIA數(shù)據(jù)校正后，基于SWATH-MS適用的Target-decoy模型，以FDR 1%完成假陽性控制。用MSstats和雙樣本等方差的雙側(cè)Student T檢驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行磷酸化肽段的顯著性檢驗(yàn)。使用R語言的ggplot2包（3.3.0版本）對鑒定到的磷酸化蛋白進(jìn)行主成分分析。

1.7差異磷酸化蛋白的信息注釋與功能分類

基于Uniport蛋白數(shù)據(jù)庫對所有鑒定到的磷酸化蛋白進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）分析，按照細(xì)胞成分（Cellular component）、分子功能（Molecular function）和生物學(xué)過程（Biological process）進(jìn)行功能分類。

1.8差異磷酸化蛋白的功能富集

基于1.5倍差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）和Plt;0.05閾值條件，對差異磷酸化肽段和蛋白進(jìn)行篩選，得到抗/感病株系特異性響應(yīng)的磷酸化蛋白，其中FC≥1.5且Plt;0.05為表達(dá)量上調(diào)，F(xiàn)C≤0.625且Plt;0.05為表達(dá)量下調(diào)；以篩選到的蛋白為背景，利用KEGG網(wǎng)站（https：//www.kegg.jp）對特異性磷酸化蛋白做富集通路分析，篩選出Plt;0.05的通路，按通路層級分類方法進(jìn)行分類。

2結(jié)果與分析

2.1炭疽菌侵染柱花草抗、感病株系葉片表型

柱花草在接種炭疽菌后，從葉尖開始出現(xiàn)不規(guī)則病變，感染部位為淺棕色至深褐色，并不斷向中心擴(kuò)散。如圖1所示，‘2001-71’株系在接種后第4天時(shí)已顯現(xiàn)出明顯的病斑，而‘2001-84’株系僅在葉尖開始出現(xiàn)淺棕色現(xiàn)象。

2.2磷酸化蛋白和磷酸化肽段鑒定

對實(shí)驗(yàn)組和對照組抗、感病株系葉片取樣，進(jìn)行差異磷酸蛋白組學(xué)分析，每個(gè)處理包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共12組樣品，圖2給出了磷酸化位點(diǎn)在3種氨基酸上的分布和在肽段上位點(diǎn)數(shù)量。

試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組共鑒定到磷酸化蛋白1 354個(gè)，磷酸化肽段8 286個(gè)，非冗余磷酸化位點(diǎn)4 376個(gè)。其中：磷酸化發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上的磷酸化修飾位點(diǎn)分別占比69.37%，22.22%和8.41%（圖2A）；單一磷酸化位點(diǎn)、雙磷酸化位點(diǎn)和三磷酸化化位點(diǎn)的肽段分別占比89.86%，9.24%和0.9%（圖2B）。

對所鑒定的磷酸化肽段進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖3所示。對照組抗、感病株系的差異不大，而實(shí)驗(yàn)組抗、感病株系顯著分離至兩個(gè)象限，說明抗、感病株系響應(yīng)炭疽菌侵染的磷酸化肽段存在明顯差異。

2.3差異磷酸化肽段與磷酸化蛋白定量統(tǒng)計(jì)

基于1.5倍差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）和Plt;0.05閾值條件，對實(shí)驗(yàn)組差異磷酸化肽段和蛋白進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖4所示。其中，F(xiàn)C≥1.5且Plt;0.05為表達(dá)量上調(diào)，F(xiàn)C≤0.625且Plt;0.05為表達(dá)量下調(diào)。

圖4A表明：抗病株系‘2001-84’共有407個(gè)磷酸化肽段、277個(gè)磷酸化蛋白表達(dá)量上調(diào)，51個(gè)磷酸化肽段、41個(gè)磷酸化蛋白表達(dá)量下調(diào)；感病株系‘2001-71’共有328個(gè)磷酸化肽段、217個(gè)磷酸化蛋白表達(dá)量上調(diào)，77個(gè)磷酸化肽段、63個(gè)磷酸化蛋白表達(dá)量下調(diào)。圖4B顯示：抗病株系‘2001-84’中有125個(gè)特異上調(diào)磷酸化蛋白、13個(gè)特異下調(diào)磷酸化蛋白；感病株系‘2001-71’有72個(gè)特異上調(diào)磷酸化蛋白、34個(gè)特異下調(diào)磷酸化蛋白；在6個(gè)抗病株系的磷酸化蛋白和2個(gè)感病株系的磷酸化蛋白中，部分肽段響應(yīng)炭疽菌上調(diào)，而部分肽段下調(diào)。

2.4差異磷酸化蛋白功能分類和代謝通路富集分析

按照細(xì)胞成分（Cellular component）、分子功能（Molecular function）和生物學(xué)過程（Biological process）進(jìn)行分類分析，對抗、感病材料響應(yīng)炭疽菌侵染的差異磷酸化蛋白進(jìn)行GO功能注釋，結(jié)果如圖5所示。在抗病株系‘2001-84’中，差異磷酸化蛋白主要位于細(xì)胞外周（Cell periphery）和質(zhì)膜結(jié)構(gòu)（Plasma membrane），以轉(zhuǎn)移酶（Transferase activity）、激酶（Kinase activity）和蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding）等分子功能為主，參與生物體對刺激的反應(yīng)（Response to stimulus）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）等生物學(xué)過程；在感病株系‘2001-71’中，差異磷酸化蛋白多數(shù)位于細(xì)胞器包被膜結(jié)構(gòu)（Organelle envelope），分子功能以蛋白結(jié)合（Protein binding）為主，參與細(xì)胞成分與細(xì)胞器的重組（Cellular component organization or biogenesis）等生物學(xué)過程。蛋白功能分類分析表明，抗、感病株系響應(yīng)炭疽菌發(fā)生差異磷酸化的亞細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程過程均顯著不同。

以鑒定到的蛋白為背景，通過KEGG網(wǎng)站對抗、感病株系中特異響應(yīng)炭疽菌的差異磷酸化蛋白進(jìn)行代謝通路富集分析，結(jié)果如圖6所示?？共≈晗怠?001-84’顯著富集到植物激素信號傳導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、剪接體（Spliceosome）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway-plant）、植物與病原菌互作（Plant-pathogen interaction）、胞吞（Endocytosis）和磷酸肌醇的代謝（Inositol phosphate metabolism）6個(gè)通路；感病株系‘2001-71’顯著富集到剪接體（Spliceosome）、淀粉與蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、磷酸肌醇的代謝（Inositol phosphate metabolism）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporters）、光合作用天線蛋白（Photosynthesis-antenna proteins）、和纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸生物合成（Valine，leucine and isoleucine biosynthesis）6個(gè)通路。其中，在抗病株系‘2001-84’中特異富集的通路包括植物激素信號傳導(dǎo)、MAPK信號通路和植物與病原菌互作，這3個(gè)途徑均在植物應(yīng)對生物脅迫方面具有重要作用。

2.5抗病株系中抗病通路和蛋白分析

從抗病株系‘2001-84’特異響應(yīng)炭疽菌侵染的磷酸化蛋白中篩選出跟抗病相關(guān)的蛋白，結(jié)合GO分析與KEGG通路分析結(jié)果，可將其分為植物激素信號傳導(dǎo)、MAPK信號通路、植物與病原菌互作和其他，如表1所示。

激素信號傳導(dǎo)通路中，共有5個(gè)磷酸化上調(diào)蛋白和2個(gè)磷酸化下調(diào)蛋白，其中3個(gè)上調(diào)蛋白（Q04980，Q84MC7，Q9M7Q4）參與脫落酸（Abscisic acid，ABA）信號通路，1個(gè)上調(diào)蛋白（Q05609）調(diào)控乙烯（Ethylene，ET）合成，2個(gè)下調(diào)蛋白（Q9LK32，Q7XYY2）參與茉莉酸（Jasmonates，JA）信號通路，1個(gè)上調(diào)蛋白（Q9SI37）參與水楊酸（Salicylic acid，SA）介導(dǎo)的信號通路。

MAPK信號通路中，共有7個(gè)磷酸化上調(diào)蛋白，其中4個(gè)蛋白（Q9LFP7，Q9SII6，Q39033，Q65XV8）位于MAPK級聯(lián)的上游，Q8RXG3（Mitogen-activated protein kinase kinase 5）和Q06060（Mitogen-activated protein kinase 6）蛋白與擬南芥MKK4/5-MPK3/6級聯(lián)同源，Q5M750蛋白與擬南芥MPK6的下游底物VQ motif-containing protein 4同源。

植物與病原菌互作通路中，共有6個(gè)磷酸化上調(diào)蛋白和2個(gè)磷酸化下調(diào)蛋白，其中上調(diào)蛋白（F4IXW2，F(xiàn)4K2F0O22607，Q0 JL44，Q8L731，Q9C516，Q9FZ45，O81020）主要調(diào)節(jié)植物基礎(chǔ)免疫；下調(diào)蛋白SHOU4L（Q9FZ45）負(fù)調(diào)控植物纖維素，下調(diào)蛋白非特異性磷脂酶C2（O81020）能夠水解磷脂，在逆境脅迫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

3討論

蛋白質(zhì)磷酸化修飾參與調(diào)控植物與病原菌互作，是眾多PTM類型中最主要的一種類型，也是植物免疫的重要組成部分［17］。本文通過對抗病株系‘2001-84’和感病株系‘2001-71’葉片接種炭疽菌的差異磷酸化蛋白組學(xué)分析，鑒定了抗、感病材料特異響應(yīng)炭疽菌的磷酸化蛋白和通路，為探究柱花草抗炭疽菌的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)；同時(shí)，篩選出了與抗病相關(guān)的磷酸化蛋白，為柱花草抗病育種提供了候選靶標(biāo)。

抗、感病株系響應(yīng)炭疽菌差異磷酸化蛋白的功能分析表明二者在應(yīng)對炭疽菌侵染過程中發(fā)生明顯差異。抗病株系‘2001-84’磷酸化蛋白GO分析結(jié)果顯示，有33個(gè)磷酸化蛋白位于質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，蛋白的功能以轉(zhuǎn)移酶與激酶為主。質(zhì)膜上的免疫受體蛋白對病原菌的識別是激活植物免疫的第一步［18］，因此推測抗病株系中位于質(zhì)膜上的蛋白響應(yīng)炭疽菌侵染發(fā)生磷酸化，磷酸化的質(zhì)膜蛋白將胞外信號傳遞至胞內(nèi)下游蛋白，開啟免疫反應(yīng)來抵抗炭疽菌。感病株系‘2001-71’磷酸化蛋白GO分析結(jié)果顯示，磷酸化蛋白顯著富集在細(xì)胞器膜與葉綠體膜上，主要行使細(xì)胞器的分解等作用。有研究表明，‘熱研2號’接種炭疽菌96 h時(shí)發(fā)生了細(xì)胞崩解，出現(xiàn)組織液外流現(xiàn)象，炭疽菌完成一次侵染循環(huán)［19］；而炭疽菌侵染楊樹（Populus L）葉片后期，會導(dǎo)致楊樹葉片細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器逐漸消解，僅保留葉綠體作為唯一細(xì)胞器［20］。因此，可推測在本文實(shí)驗(yàn)中炭疽菌在感病株系中已完成一次侵染循環(huán)，葉片中細(xì)胞器逐漸崩解。

抗病株系特異性響應(yīng)炭疽菌的磷酸化蛋白被顯著富集到MAPK信號通路上，其中鑒定到的Q8RXG3和Q06060在接種炭疽菌后分別上調(diào)22.06倍和5.62倍，且分別與擬南芥MKK5和MPK6同源。MKK5與MPK6是植物免疫中的關(guān)鍵信號成分［21］，多項(xiàng)研究表明，病原菌侵染植物后，上游不同的MAPKKK激活MKK4/MKK5-MPK3/MPK6級聯(lián)開啟不同的免疫信號途徑。例如，病原菌在侵染擬南芥時(shí)，MKK4/MKK5-MPK3/MPK6級聯(lián)通過調(diào)節(jié)植物防御途徑參與對病原菌的免疫，包括開啟防御基因的表達(dá)、活性氧的產(chǎn)生以及植物激素的積累等［22］。擬南芥定量磷酸蛋白組學(xué)表明，MAPKKK δ-1蛋白通過MKK1/MKK5-MPK3/MPK6級聯(lián)控制抗病蛋白SUMO化和霉菌毒素解毒酶的磷酸化，參與了對細(xì)菌和真菌感染的免疫反應(yīng)［23］，同時(shí)MKK4/MKK5-MPK3/MPK6級聯(lián)還可以通過控制保衛(wèi)細(xì)胞中有機(jī)酸的代謝參與調(diào)節(jié)氣孔免疫［24］。本實(shí)驗(yàn)中，MKK5與MPK6在接種炭疽菌后磷酸化顯著上調(diào)，可推測在柱花草抗病株系中，存在依賴于MKK5-MPK6級聯(lián)開啟的免疫反應(yīng)，以抵抗炭疽菌的侵染。

SA和JA是植物免疫信號網(wǎng)絡(luò)的支柱，通常在應(yīng)對各種真菌感染時(shí)發(fā)揮不同的作用，ABA、ET、生長素、赤霉素和細(xì)胞分裂素以協(xié)同或拮抗作用參與此過程［25］。目前，公認(rèn)SA信號通路在系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR） 中發(fā)揮核心作用，抑制生物營養(yǎng)性和半營養(yǎng)性病原菌（如丁香假單胞菌和炭疽菌）感染；而JA和ET信號通路通常協(xié)同作用抑制壞死性病原菌例如灰霉病菌（Botrytis cinerea）［26］。SA通常是SAR信號傳導(dǎo)中的正調(diào)節(jié)因子，例如高粱（Sorghum bicolor）和胡楊（Populus euphratica）在感染炭疽菌后，誘導(dǎo)SA通路的基因表達(dá)，增強(qiáng)了對炭疽病的抗性［27-28］。而SA與JA/ET在植物防御方面通常表現(xiàn)為拮抗作用，SA通過抑制JA生物合成下游的JA/ET信號傳導(dǎo)，或者在轉(zhuǎn)錄水平拮抗JA/ET信號通路［29］。例如，ALVAREZ-DIAZ對不同抗性的大豆（Glycine max）接種炭疽菌后，在轉(zhuǎn)錄組水平上觀察到抗性大豆中SA途徑基因顯著上調(diào)，而JA途徑基因則受到抑制［30］。ABA在調(diào)控植物免疫方面起到多重作用［26］，在水稻-稻瘟菌互作中，水稻ABA信號傳導(dǎo)被觸發(fā)而顯著抑制SA信號通路［31］；但在擬南芥中，ABA通過影響JA的生物合成和防御系統(tǒng)的激活，調(diào)控抵抗腐霉病菌（Pythium debaryanum）的防御基因表達(dá)［32］。此外，ABA參與氣孔免疫，通過調(diào)控氣孔關(guān)閉限制丁香假單胞菌從擬南芥的氣孔進(jìn)入體內(nèi)，從而提高抗性［33］。本實(shí)驗(yàn)抗病株系中鑒定到了SA，JA，ET和ABA相關(guān)蛋白特異性響應(yīng)炭疽菌。ABA通路的三個(gè)蛋白（Q04980，Q84MC7，Q9M7Q4）響應(yīng)炭疽菌磷酸化上調(diào)，說明抗病株系可能通過提高ABA合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)對炭疽菌的抗性。SA通路中的WRKY 1（Q9SI37）磷酸化豐度上調(diào)2.57倍，而JA通路中的2個(gè)蛋白（Q9LK32，Q7XYY2）磷酸化豐度下調(diào)，推測抗病株系可能通過上調(diào)SA信號通路增加抗病性，由于SA與JA的拮抗作用，JA通路在抗病株系中受到抑制。ET通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子CTR1（Q05609）磷酸化豐度提高1.50倍，推測炭疽菌可能抑制了柱花草中ET通路。這些結(jié)果表明，SA，JA，ABA，ET途徑參與調(diào)控柱花草抗炭疽菌，但具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，各激素含量和通路基因表達(dá)變化有待進(jìn)一步研究。

角質(zhì)層作為抵抗病原菌的第一道物理屏障，多項(xiàng)研究表明其在抵抗病原菌的侵染起到重要作用。角質(zhì)層由角質(zhì)與蠟質(zhì)組成［34］，形成對病原菌的物理抗性，影響植物表面的疏水性和表皮機(jī)械強(qiáng)度，不利于病原菌的停留與侵染［35］，此外誘導(dǎo)產(chǎn)生的角質(zhì)蠟質(zhì)組分可作為信號分子或者誘導(dǎo)子激活下游的抗性反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮其化學(xué)抗性功能［36］。本實(shí)驗(yàn)中鑒定到抗病株系中角質(zhì)蠟合成蛋白蠟酯合酶（WSD1，Q93ZR6）響應(yīng)炭疽菌磷酸化豐度顯著上調(diào)6.92倍，說明抗病株系可能通過加強(qiáng)葉片的機(jī)械防御來延緩炭疽菌的侵入，也可能通過開啟下游的免疫反應(yīng)來抵抗炭疽菌侵染。

4結(jié)論

本文通過對比分析抗/感病柱花草接種炭疽菌前后差異磷酸化蛋白組，分別在抗病株系‘2001-84’和感病株系‘2001-71’中鑒定到138個(gè)和106個(gè)特異性響應(yīng)炭疽菌的磷酸化蛋白質(zhì)，并揭示了MAPK級聯(lián)通路、植物激素信號傳導(dǎo)和葉片角質(zhì)層在防御炭疽菌入侵過程中的重要作用。該成果為后續(xù)深入研究柱花草-炭疽病菌互作分子機(jī)制及柱花草抗病新品種選育奠定了重要的理論研究基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯劉婷婷）