摘要：青海草原毛蟲（Gynaephora qinghaiensis）是危害青藏高原高寒草甸最重要的害蟲之一。本研究通過第二代高通量測序技術(shù)對(duì)青海草原毛蟲4齡幼蟲、雌雄成蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序并進(jìn)行基因功能注釋，同時(shí)篩選獲得其氣味結(jié)合蛋白基因（GqinOBPs）并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過組裝之后總計(jì)得到63 335條unigenes，在全部unigenes中篩選并鑒定出17個(gè)GqinOBPs基因，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些氣味結(jié)合蛋白為熱穩(wěn)定性蛋白，亞細(xì)胞定位主要在胞外，二三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成，多序列比對(duì)顯示GqinOBPs具有昆蟲OBPs的半胱氨酸模式識(shí)別序列；系統(tǒng)分析表明，GqinOBPs基因與同是鱗翅目昆蟲的桃蛀螟、小線角木蠹蛾和沙棘木蠹蛾親緣關(guān)系較近。該研究首次公開并分析青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時(shí)挖掘出其氣味結(jié)合蛋白基因，為進(jìn)一步研究青海草原毛蟲的基因功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青海草原毛蟲；轉(zhuǎn)錄組測序；氣味結(jié)合蛋白；生物信息學(xué)分析；系統(tǒng)發(fā)育樹

中圖分類號(hào)：Q943文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）03-0688-11

Bioinformatics Analysis on the Odorant Binding Protein Genes in

Gynaephora qinghaiensis

NAN Yan-bin， ZHANG Yue， HE Qi-yue， CHEN Shuai， ZHOU Yuan-tao*

（School of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：The Gynaephora qinghaiensis is one of the most harmful pests endangering the alpine meadows on the Qinghai-Tibet Plateau. In this study，transcriptome sequencing of fourth-instar larvae，male and female adults of G.qinghaiensis was performed by second-generation high-throughput sequencing;and the odorant binding protein （GqinOBPs） genes were selected further underwent bioinformatics analysis. The results showed that 17 GqinOBPs genes were screened and identified among a total of 63 335 assembled unigenes. These OBPs were revealed to be thermostable and displays an extracellular localization by bioinformatics analysis. The secondary and tertiary structure consists mainly of α helices and an irregular coil. Multiple sequence alignment supported that GqinOBPs showed conserved constitution pattern of cysteine residues as in most insects. Evolutionarily，GqinOBPs gene is closely relative to the Dichocrocis punctiferalis，Holcocerus insularis Staudinger and Holcocerus hippophaecolus，which are also lepidoptera counterparts. This study first reported the transcriptomic profiling of the G.qinghaiensis，and the identification of the odor-binding protein genes，which would lay out a foundation for further study on functions of the genes in the G.qinghaiensis.

Key words：Gynaephora qinghaiensis;Transcriptome sequencing;Odorant binding protein;Bioinformatics analysis;Phylogenetic tree

昆蟲氣味結(jié)合蛋白（Odorant binding protein，OBP）屬于水溶性小分子蛋白家族，它們?cè)诶ハx的化學(xué)感受器淋巴液中大量分布，被認(rèn)為是昆蟲化學(xué)感受過程中氣味和信息素的載體［1］，通常在昆蟲的觸角、口器等感覺器官中大量存在［2］。OBPs的典型特點(diǎn)是由120～150個(gè)氨基酸組成，N端出現(xiàn)信號(hào)肽，在有脊椎和無脊椎動(dòng)物中都有分布，但脊椎動(dòng)物和昆蟲的OBPs序列來源完全不同［3］。昆蟲的OBPs與脊椎動(dòng)物的OBPs折疊模式完全不同，在脊椎動(dòng)物中，其OBPs由8個(gè)β筒狀結(jié)構(gòu)和羧基末端1個(gè)α螺旋組成；然而在昆蟲中，其OBPs通常由6個(gè)α螺旋組成，排列緊湊且包圍出1個(gè)疏水腔［4-5］。昆蟲的OBPs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是由3個(gè)二硫鍵控制的，二硫鍵的存在使其熱穩(wěn)定性與保守性更好。OBPs傳遞氣味分子的功能是在研究鱗翅目昆蟲觸角的過程中發(fā)現(xiàn)的，此后學(xué)界展開多種昆蟲的體內(nèi)克隆研究，多種昆蟲體內(nèi)均得到了OBPs基因，且其在不同種類間存在極大差異［6］。OBPs的類型是通過OBPs氨基酸序列中半胱氨酸的數(shù)量和間距來確定的［7］，目前OBPs主要分為5個(gè)類型：Classic OBPs，Dimer OBP，Plus-C OBPs，Minus-C OBPs，Atypical OBPs［8］。Classic OBPs中有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，3個(gè)其他氨基酸殘基存在于第二個(gè)和第三個(gè)半胱氨酸殘基之間，8個(gè)其他氨基酸殘基存在于第五個(gè)和第六個(gè)半胱氨酸殘基之間。Dimer OBPs中有兩組6個(gè)保守的半胱氨酸。Plus-C OBPs由6個(gè)保守的半胱氨酸殘基、2個(gè)額外的半胱氨酸殘基和1個(gè)保守的脯氨酸組成。Minus-C OBPs缺失2個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)。Atypical OBPs中有9～10個(gè)半胱氨酸殘基［8］。昆蟲氣味結(jié)合蛋白具有種類多、功能多樣的特點(diǎn)，因此需要探明其類型和數(shù)量，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究氣味結(jié)合蛋白在調(diào)控昆蟲取食中的作用［9-10］。

青海草原毛蟲（Gynaephora qinghaiensis）俗稱紅頭黑毛蟲，草原毒蛾，隸屬于鱗翅目，毒蛾科，草原毛蟲屬［11］。目前草原毛蟲屬在全世界分布有15個(gè)種，主要分布在北半球的高山以及北極的凍土地帶，尤以高海拔超過3 000 m的地區(qū)居多［12］。草原毛蟲屬在中國有8個(gè)種，主要分布于青海省北部的高寒草甸，原因在于青藏高原上的高寒草甸類草地上生長著十分豐富的莎草科、嵩草科及禾本科植物，這些植物為其提供了適宜的生存發(fā)展條件［13-14］。根據(jù)我們的調(diào)查與現(xiàn)有數(shù)據(jù)資料發(fā)現(xiàn)，青海草原毛蟲在青海地區(qū)重點(diǎn)分布在門源、海晏、天俊、澤庫、瑪多、甘德、祁連、雜多和治多等地方，其危害主要集中在影響人畜安全、改變草地生態(tài)結(jié)構(gòu)、加速草地生態(tài)環(huán)境的惡化［15］等方面，是青藏高原畜牧業(yè)健康發(fā)展的重大阻礙［16］。青海草原毛蟲具有毒性，防治難度系數(shù)高［17］，當(dāng)前對(duì)它的研究主要集中在無人機(jī)和直升機(jī)施藥［18-19］，食性及其空間格局［20］，全線粒體基因組序列測定與分析［21］，高海拔脅迫的基因表達(dá)和分析［22］等方面，缺乏對(duì)其化學(xué)感受機(jī)制的研究。本研究首次公開并分析青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)，同時(shí)挖掘出氣味結(jié)合蛋白基因，通過生物信息學(xué)分析進(jìn)一步確定這些基因的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、多序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育情況，為進(jìn)一步研究青海草原毛蟲氣味結(jié)合蛋白對(duì)外界化學(xué)氣味分子的識(shí)別及行為反應(yīng)機(jī)理提供前提依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試蟲源

2020年6-7月從青海省海北州（36°59′06.6″ N，100°52′19.1″ E，海拔3 095.1 m）采集青海草原毛蟲的3，4齡幼蟲至實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)至7齡幼蟲，再到雌雄蛹，最后至雌雄成蟲。飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，光周期16L∶8D，相對(duì)濕度60%～80％。選4齡幼蟲及雌雄成蟲各3頭收集到2 mL的EP管中，使用液氮快速冷凍后于—80℃超低溫冰箱中保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1RNA提取與檢測取青海草原毛蟲樣品通過Trizol法提取RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染；采用熒光分光光度計(jì)測定RNA濃度；利用超微量分光光度計(jì)檢測RNA純度；Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測RNA完整性，當(dāng)OD260 nm/OD280 nm的范圍為1.8～2.2，28S/18Sgt;2，OD260 nm/OD230 nmgt;1.8，RNA完整值gt;8.5，表明提取的RNA合格。

1.2.2cDNA文庫構(gòu)建與質(zhì)檢建庫起始RNA為總RNA，首先通過Oligo（dT）磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，隨后在Fragmentation Buffer中用二價(jià)陽離子將得到的mRNA隨機(jī)打斷。以片段化的mRNA為模版，隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymerase I體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)，經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選370～420 bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng·μL-1，隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer對(duì)文庫的insert size進(jìn)行檢測，insert size符合預(yù)期后，qRT-PCR對(duì)文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度高于2 nmol·L-1），以保證文庫質(zhì)量。質(zhì)檢合格后進(jìn)行Illumina HisSeqTM2000測序。北京諾禾致源科技股份有限公司協(xié)助完成文庫構(gòu)建與質(zhì)檢。

1.2.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因注釋對(duì)RNA-seq測序獲得的raw reads進(jìn)行質(zhì)量過濾，過濾的內(nèi)容包括：（1）接頭的reads；（2）無法確定堿基信息比例大于10%的reads；（3）質(zhì)量較低的reads。過濾后獲得測序數(shù)據(jù)clean data。利用Trinity 2.5.1軟件對(duì)clean data進(jìn)行組裝，使用Inchworm，Chrysalis和Butterfly等3個(gè)獨(dú)立軟件模塊組裝成最終的轉(zhuǎn)錄本。利用BLAST 2.5（https：//blast.ncbi.nlm.Nih.gov/Blast）軟件，將unigenes序列與7大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，7大數(shù)據(jù)庫包括NR蛋白數(shù)據(jù)庫、NT核酸數(shù)據(jù)庫、Pfam蛋白家族、KOG/COG直系同源基因簇、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫、KO數(shù)據(jù)庫和GO數(shù)據(jù)庫。

1.3青海草原毛蟲OBPs基因序列生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)通過第二代高通量測序技術(shù)對(duì)青海草原毛蟲4齡幼蟲、雌雄成蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，基于此3個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)總庫，以“OBP”和“odorant binding protein”為關(guān)鍵詞進(jìn)行查找，為確定候選基因?qū)⑺袣馕督Y(jié)合蛋白基因序列在NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn比對(duì)。

利用ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測出ORF完整的核苷酸和氨基酸序列，之后在NCBI中對(duì)預(yù)測出的ORF氨基酸序列進(jìn)行BLASTp驗(yàn)證，設(shè)定e值小于10-5，相似性大于40%。利用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）軟件對(duì)氣味結(jié)合蛋白氨基酸序列組成、相對(duì)分子量、等電點(diǎn)、正負(fù)電荷殘基數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)和總平均疏水性進(jìn)行計(jì)算［23］。采用Signalp4.1Server（http：//cbs.dtu.dk/services/Signalp/）預(yù)測其信號(hào)肽。

采用WOLF PSORT （https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測分析［24］。采用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa%20_sopma.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測；SWISS MODEL（https：//www. swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測［25］。

采用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)［26］。采用MEGA7.0軟件的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。構(gòu)建物種有：桃蛀螟（Dichocrocis punctiferalis），二化螟（Chilo suppressalis），小線角木蠹蛾（Holcocerus insularis Staudinger），沙棘木蠹蛾（Holcocerus hippophaecolus），岡比亞按蚊（Anopheles gambiae），紅火蟻（Solenopsis invicta Buren）。設(shè)置參數(shù)為：重復(fù)頻次1 000，空缺數(shù)據(jù)95%部分刪除，其他參數(shù)默認(rèn)［27］。

2結(jié)果與分析

2.1青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組序列組裝

青海草原毛蟲雌雄成蟲、4齡幼蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測序篩選后總堿基數(shù)分別為7.04 Gb，7.29 Gb，5.95 Gb；Q20（質(zhì)量值≥20堿基所占百分比）分別為98.20%，98.10%，98.23%，均高于98%；Q30（質(zhì)量值≥30堿基所占百分比）分別為94.66%，94.40%，94.73%，均高于94%；GC含量分別為40.88%，39.92%，42.12%（表1）。該項(xiàng)數(shù)據(jù)表明，測序得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，具有極高的可信度，可用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

組裝后的測序序列共有135 434條轉(zhuǎn)錄本，其N50（拼接轉(zhuǎn)錄本按照長度從長到短排序，累加轉(zhuǎn)錄本的長度，到不小于總長50%的拼接轉(zhuǎn)錄本的長度）的長度為2 068 bp，平均長度為1 273 bp。轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過組裝后得到63 335條全部unigenes，其中長度超過1 000 bp的有19 926條，占全部unigenes的31.46%，從中可以看出其組裝完整性較高（表2），在后續(xù)生物學(xué)分析中可以運(yùn)用。

2.2Unigene的功能注釋

在NR，NT，Pfam，KOG/COG，Swiss-Prot，KO和GO 7大數(shù)據(jù)庫中將青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組分別進(jìn)行注釋，結(jié)果表明在所有數(shù)據(jù)庫中均注釋成功的unigenes有3 792（5.98%）個(gè)，至少在一個(gè)數(shù)據(jù)庫中注釋成功的unigenes有35 571（56.16%）個(gè)。通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)未獲得注釋的unigenes有27 764個(gè)，占全部unigenes 43.84%。在7大數(shù)據(jù)庫中，獲得注釋基因最多的是NR數(shù)據(jù)庫（26 738個(gè)，42.21%），最少的為KOG數(shù)據(jù)庫（9 521個(gè)，15.03%），其后依次為PFAM注釋（18 593個(gè)，29.35%）、GO注釋（18 588個(gè)，29.34%）、NT注釋（16 956個(gè)，26.77%）、Swiss-Prot注釋（16 036個(gè)，25.31%）、KO注釋（10 903個(gè)，17.21%）（表3）。通過比對(duì)NCBI NR數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，青海草原毛蟲的基因序列與棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、粉紋夜蛾（Trichoplusiani）、斜紋夜盜蟲（Spodoptera litura）、綠棉鈴蟲（Heliothis virescens）、柑橘鳳蝶（Papilio xuthus）等昆蟲基因序列相似性較高，相似度分別為13.0%，12.7%，12.5%，10.3%和5.5%。

2.3青海草原毛蟲OBPs的生物信息學(xué)分析

從青海草原毛蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出17個(gè)OBPs（表4），經(jīng)ORFfinder與BLASTp驗(yàn)證后，其核苷酸長度大小介于363～570 bp之間，將青海草原GqinOBPs與其他昆蟲OBP序列相似性進(jìn)行比較，其中GqinOBP5基因與斜紋夜蛾基因序列（Gen Bank登錄號(hào)為XP_022826781.1）相似度最高，達(dá)到95.65%。其次，GqinOBP4基因與甜菜夜蛾Spodoptera exigua基因序列（Gen Bank登錄號(hào)為AGH70105.1）的相似度達(dá)到了88.72%。GqinOBPs基因與其他昆蟲物種相似性高于60%的有11個(gè)，占總數(shù)的64.7%，表明GqinOBPs與其他昆蟲序列相似性相比較一致性較高。采用軟件TransDecoder預(yù)測出該17個(gè)青海草原毛蟲氣味結(jié)合蛋白的編碼區(qū)序列是完整的。采用在線網(wǎng)站SignaIP4.1預(yù)測其信號(hào)肽，結(jié)果表明GqinOBP8，GqinOBP16，GqinOBP17三個(gè)基因沒有信號(hào)肽。

2.4青海草原毛蟲OBPs理化性質(zhì)分析

利用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）軟件對(duì)青海草原毛蟲氣味結(jié)合蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測（表5），青海草原毛蟲17個(gè)OBPs氨基酸殘基數(shù)在121～190 aa之間，相對(duì)分子量13.84～60.41 kD，理論等電點(diǎn)大多數(shù)位于6附近，表明這些蛋白屬于偏酸性蛋白，但是GqinOBP1，GqinOBP4，GqinOBP7-9，GqinOBP11蛋白理論等電點(diǎn)位于8附近，表明這些蛋白屬于偏堿性蛋白。GqinOBP1-17蛋白帶負(fù)電荷殘基總數(shù)明顯比帶正電荷殘基總數(shù)多，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40的有9個(gè)，表明這9個(gè)蛋白為不穩(wěn)定蛋白（蛋白穩(wěn)定參數(shù)gt;40為不穩(wěn)定蛋白）。脂肪系數(shù)反映蛋白的熱穩(wěn)定性，青海草原毛蟲17個(gè)OBPs均為熱穩(wěn)定性蛋白。青海草原毛蟲17個(gè)OBPs平均疏水性為—0.20，說明該蛋白為兩性蛋白質(zhì)（正值為疏水性，負(fù)值為親水性，—0.5～0.5之間為兩性蛋白質(zhì)）。

2.5青海草原毛蟲OBPs的亞細(xì)胞定位預(yù)測分析

采用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF Psort （https：//wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)青海草原毛蟲OBPs進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測（表6），表中數(shù)字表示W(wǎng)oLF Psort亞細(xì)胞定位預(yù)測系統(tǒng)中與目標(biāo)蛋白序列最相似且亞細(xì)胞定位已經(jīng)確定的蛋白數(shù)目。數(shù)目越大表示目標(biāo)蛋白可能參與的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)間的物質(zhì)交流越多。結(jié)果表明17個(gè)GqinOBPs（GqinOBP1-17）定位在胞外。另外該17個(gè)GqinOBPs在線粒體、細(xì)胞膜、溶酶體和細(xì)胞質(zhì)中有少量分布，僅GqinOBP16在細(xì)胞核中有少量分布。

2.6青海草原毛蟲OBPs的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa%20_sopma.html）在線網(wǎng)站預(yù)測GqinOBPs二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖1），青海草原毛蟲的OBPs二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（Alpha helix） 和無規(guī)卷曲（Random coil） 組成，殘基間氫鍵的相互作用調(diào)解著蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。青海草原毛蟲OBPs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，α螺旋的氨基酸殘基占整體氨基酸比例最大，其次為無規(guī)則卷曲的氨基酸殘基，β折疊和延伸鏈的氨基酸殘基較少，由此判斷青海草原毛蟲OBPs的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲形成并維持穩(wěn)定。

2.7青海草原毛蟲OBPs的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用SWISS MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）網(wǎng)站同源建模得到青海草原毛蟲OBPs蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），GqinOBPs三級(jí)結(jié)構(gòu)極為保守，除GqinOBP12的三級(jí)結(jié)構(gòu)有5個(gè)α螺旋外，其余16個(gè)青海草原毛蟲OBPs蛋白（GqinOBP1-GqinOBP11，GqinOBP13-GqinOBP17）有6個(gè)α螺旋，同時(shí)GqinOBPs擁有保守的半胱氨酸來形成二硫鍵，穩(wěn)定氣味結(jié)合蛋白的整體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部空間區(qū)域較為寬闊，主要是疏水性氨基酸，這些螺旋和連接它們的回折構(gòu)成了其三維結(jié)構(gòu)且形成疏水結(jié)合腔，這類回折也稱無規(guī)則卷曲，廣泛分布于蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，在生物學(xué)功能的實(shí)現(xiàn)中具有十分重要的作用。

2.8青海草原毛蟲OBPs基因的多序列比對(duì)

通過DNAMAN軟件對(duì)GqinOBPs進(jìn)行多序列比對(duì)，通過比對(duì)的17個(gè)GqinOBPs都具有昆蟲OBPs的半胱氨酸模式識(shí)別序列（圖3）。GqinOBP3，GqinOBP5，GqinOBP6，GqinOBP7，GqinOBP8，GqinOBP9，GqinOBP10，GqinOBP13，GqinOBP14，GqinOBP16，這10個(gè)OBPs屬于Classic OBPs家族。其半胱氨酸的模式識(shí)別序列是C1-X25-30-C2-X3-C3-X36-42-C4-X8-14-C5-X8-C6（C為半胱氨酸，X為任意氨基酸），與其他報(bào)道的鱗翅目昆蟲Classic OBPs家族無差異。GqinOBP1，GqinOBP2，GqinOBP4，GqinOBP11，GqinOBP15這5個(gè)OBPs屬于Minus-C OBPs家族，因?yàn)樵谶@些蛋白序列中缺少C2和C5半胱氨酸。GqinOBP17的C2，C3，C6的位置不是半胱氨酸殘基，無法推斷其是否屬于Classic OBPs家族，但從多序列比對(duì)的總體分布可以重新劃分保守的半胱氨酸殘基的分布情況，圖中黃色標(biāo)記可看出其缺少C2和C5半胱氨酸。因此推測GqinOBP17屬于Minus-C OBPs家族。GqinOBP12缺少C2和C5半胱氨酸且在其C6上游還有一個(gè)半胱氨酸，因此可以推測GqinOBP12 也屬于Minus-C OBPs家族。

2.9青海草原毛蟲OBPs基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了明確青海草原毛蟲OBPs與其他近緣種的進(jìn)化關(guān)系，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，包括青海草原毛蟲的17個(gè)OBP氨基酸序列和其他六種昆蟲的175個(gè)OBP氨基酸序列。結(jié)果顯示，青海草原毛蟲17個(gè)OBP在整個(gè)進(jìn)化系統(tǒng)中分布比較分散。其中，GqinOBP6，GqinOBP4，GqinOBP10，GqinOBP1，GqinOBP15，GqinOBP2，GqinOBP11，GqinOBP17聚類到Minus-C OBPs進(jìn)化枝。GqinOBP7，GqinOBP8，GqinOBP9，GqinOBP14，GqinOBP3，GqinOBP13，GqinOBP16，GqinOBP12，GqinOBP5聚類到Classic OBPs進(jìn)化枝。但序列比對(duì)結(jié)果顯示GqinOBP6和GqinOBP10為Classic OBPs亞家族，GqinOBP12為Minus-C OBPs亞家族。與其他鱗翅目昆蟲比對(duì)發(fā)現(xiàn)，桃蛀螟和小線角木蠹蛾各有2個(gè)OBP聚到同一小分支上（GqinOBP2和CpunOBP39，GqinOBP16和CpunGOBP2，Bootstrap=99%）；GqinOBP11和SinsOBP11，GqinOBP5和SinsOBP21、Bootstrap=99%），表明GqinOBPs與桃蛀螟和小線角木蠹蛾的親緣關(guān)系最近。另外，GqinOBP1，GqinOBP4，GqinOBP10和GqinOBP15聚在一個(gè)分支上，與沙棘木蠹蛾的EhipOBP9和EhipOBP24關(guān)系較近。

3討論

伴隨著新一代高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究發(fā)生了重大的改變，RNA-seq在沒有預(yù)先設(shè)計(jì)探針的情況下，可對(duì)特定條件下的各種生物整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行測序，可以完全準(zhǔn)確的探測到基因表達(dá)情況，許多未知的分子調(diào)控機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，許多重要功能基因已被發(fā)掘并加以利用［28］。本研究組裝后的青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組測序序列總共有135 434條轉(zhuǎn)錄本，其N50的長度為2 068 bp，轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過組裝之后總計(jì)得到63 335條unigenes，其N50的長度為1 714 bp，N50 的值越大表示序列拼接的完整性越好［29］，從中可以看出其組裝完整性較高，保證了轉(zhuǎn)錄組分析的準(zhǔn)確性。

本研究首次從青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出17個(gè)氣味結(jié)合蛋白，與其他昆蟲鑒定出的OBPs基因數(shù)目相比較發(fā)現(xiàn)：黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）［30］鑒定得到51個(gè)OBPs，菜粉蝶（Pieris rapae）［1］篩選出24個(gè)OBPs，麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）［24］獲得90個(gè)OBPs，家蠶（Bombyx mori）［31］比對(duì)出 44個(gè)OBPs，桃小食心蟲（Carposina sasakii）［32］獲得26個(gè)OBPs，青海草原毛蟲獲得數(shù)目較少，但相對(duì)于梨網(wǎng)蝽（Stephanitis nashi［20］，12個(gè)OBPs），甘藍(lán)蚜（Brevicoryne brassicae［33］，12個(gè)OBPs），蘿卜蚜（Lipaphis erysimi，12個(gè)OBPs）和桃蚜（Myzus persicae，9個(gè)OBPs），青海草原毛蟲獲得的數(shù)目較多，推測出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是昆蟲氣味結(jié)合蛋白數(shù)據(jù)庫的豐富度不同。對(duì)半胱氨酸序列進(jìn)行模式識(shí)別分析，發(fā)現(xiàn)青海草原毛蟲的OBPs主要分布在Classic OBPs家族，此結(jié)果與多數(shù)昆蟲的OBP基因?qū)儆贑lassic OBPs家族相吻合，如點(diǎn)蜂緣蝽（Riptortus pedestris）觸角中的OBP基因有4個(gè)屬于Classic OBPs家族［24］，草履蚧（Drosicha corpulenta）觸角的OBP基因有10個(gè)屬于Classic OBPs家族［34］。

本研究獲得的GqinOBPs為熱穩(wěn)定性蛋白，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)卷曲組成，殘基間氫鍵的相互作用調(diào)節(jié)著蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這與姚懷兵等［35］的研究雙峰駝DGAT1蛋白屬于非經(jīng)典分泌性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲相一致。GqinOBPs三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，除GqinOBP12的三級(jí)結(jié)構(gòu)有5個(gè)α螺旋外，其余16個(gè)GqinOBPs有6個(gè)α螺旋，這些螺旋和連接它們的回折構(gòu)成了其三維結(jié)構(gòu)且形成疏水結(jié)合腔。氣味結(jié)合蛋白的氨基酸序列折疊形成疏水性的結(jié)合腔是高度保守的。缺少α螺旋的蛋白可能是由于氨基酸殘基的缺失造成。

序列比對(duì)結(jié)果顯示GqinOBP6和GqinOBP10為Classic OBPs亞家族，GqinOBP12為Minus-C OBPs亞家族，但系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示GqinOBP6和GqinOBP10聚在Minus-C OBPs分支，GqinOBP12聚在Classic OBPs分支。吉帥帥等［36］認(rèn)為出現(xiàn)該種情況的原因與Classic OBPs和Minus-C OBPs在進(jìn)化上的同源關(guān)系相關(guān)。因此我們推測該情況出現(xiàn)的原因是GqinOBP6和GqinOBP10與Minus-C OBPs在進(jìn)化上更加同源，GqinOBP12與Classic OBPs在進(jìn)化上更加同源。同時(shí)在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，GqinOBP16和桃蛀螟的CpunGOBP2聚在同一個(gè)小分枝中，且自展支持率為99%，由于CpunGOBP2［37］是性信息素結(jié)合蛋白，與昆蟲交配、產(chǎn)卵有關(guān)，所以我們推測青海草原毛蟲GqinOBP16也在昆蟲交配和產(chǎn)卵中起著重要作用。

4結(jié)論

昆蟲氣味結(jié)合蛋白在其氣味識(shí)別過程中發(fā)揮著巨大的作用，本研究首次公開并分析青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)，同時(shí)挖掘出17個(gè)青海草原毛蟲氣味結(jié)合蛋白基因，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些OBPs為熱穩(wěn)定性蛋白，17個(gè)青海草原毛蟲氣味結(jié)合蛋白的編碼區(qū)序列是完整的，GqinOBP8，GqinOBP16，GqinOBP17三個(gè)基因沒有信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位主要分布在胞外，二三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋與無規(guī)則卷曲組成，多序列比對(duì)顯示17個(gè)GqinOBPs都具有昆蟲OBPs的半胱氨酸模式識(shí)別序列，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，GqinOBPs在整個(gè)進(jìn)化系統(tǒng)中比較分散，但與同是鱗翅目昆蟲的桃蛀螟、小線角木蠹蛾和沙棘木蠹蛾親緣關(guān)系較近。

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（責(zé)任編輯閔芝智）