摘要：為建立一種同時檢測H7 亞型和N2 亞型禽流感病毒（AIV）的雙重納米PCR（nano-dPCR）方法，從Gen‐Bank 中分別下載H7 亞型AIV 的HA 基因序列和N2 亞型AIV 的NA 基因序列，采用Primer 7.0 和Oligo 6.0 軟件設計了2 對特異性引物，通過對nano-dPCR 反應條件進行優(yōu)化確定最佳反應體系；利用優(yōu)化好的反應體系開展nano-dPCR 方法的特異性和敏感性試驗；采集活禽市場家禽咽喉及泄殖腔拭子樣品進行臨床樣品檢測并進行驗證。結果表明，成功建立了一種同時檢測H7 亞型（723 bp）和N2 亞型（314 bp）AIV 的nano-dPCR 方法，該方法特異性良好，其他亞型禽流感病毒及常見禽類呼吸道病毒均未出現(xiàn)特異性的條帶，H7 亞型AIV 和N2 亞型AIV 的最低核酸檢測量分別達到了5×103、5×103 拷貝/μL，其敏感性是普通雙重PCR 檢測方法的10 倍，其對臨床樣品檢測結果準確率達到100%，可以用于禽流感臨床樣品鑒別診斷和日常防控監(jiān)測。

關鍵詞：禽流感病毒；雙重納米PCR；H7 亞型；N2 亞型

中圖分類號：S852.65+7 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）06?0709?07

流感病毒（Influenza Virus）屬于正黏病毒科流感病毒屬，分為甲型（A）、乙型（B）、丙型（C）和丁型（D）4 種，其中A 型流感病毒基因組由8 個片段組成，從大到小依次為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS[1]。根據(jù)A 型流感病毒表面的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）2 種蛋白可分為多個不同的亞型，目前已知HA 亞型有18 種，NA 亞型有11 種[2-3]。

除了H17N10 和H18N11 亞型在蝙蝠中被發(fā)現(xiàn)以外，所有其他已知的A 型流感病毒亞型都可以感染鳥類[4-5]。H7 亞型禽流感病毒（Avian influenzavirus，AIV）有9 種不同亞型組合，已知的亞型包括H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N6、H7N7、H7N8 和H7N9[6-8]。目前在世界各地的野生鳥類和家禽中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)H7 亞型病毒屬于低致病禽流感病毒（LPAIV）[9]，H7N2 亞型AIV 自1994 年起在美國東北部的活禽市場流行數(shù)十年，2002 年，LU等[10]首次證明LPAI H7N2 可以感染人。2003 年，AKEY 從美國一名住院患者的呼吸道分離到一株H7N2 病毒，2007 年英國活禽市場發(fā)現(xiàn)H7N2 亞型AIV 并出現(xiàn)感染人的病例[11-12]。2002 年，王傳彬等[13]首次在中國無明顯臨床癥狀的雞體內分離到H7N2 亞型LPAIV；隨后活禽市場不斷分離到H7N2 亞型AIV[14]。與人類感染相關最常見的是H7N9 亞型AIV，2013 年首次在中國發(fā)現(xiàn)，目前已造成1568 人感染[15]，并在2017 年初出現(xiàn)了對雞和人都呈現(xiàn)高致病性的H7N9 亞型AIV[16]。H7 亞型AIV 的不斷暴發(fā)和流行提醒人們，H7 亞型AIV 特別是H7N2 亞型AIV 已經(jīng)對養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生安全造成了嚴重威脅，需要加強對其監(jiān)測和防控。

目前，AIV 檢測技術主要包括病毒的分離及培養(yǎng)、血清學試驗和免疫熒光等傳統(tǒng)方法，由于AIV亞型眾多且新的變異株不斷出現(xiàn)，使用上述傳統(tǒng)檢測方法對其進行分型和診斷不僅存在著操作方法復雜，而且檢測周期長及容易受抗體等因素影響使得檢測結果不能準確和及時[17]。分子生物學檢測技術是近年AIV 檢測技術發(fā)展的主流，具有快速準確和特異性好等優(yōu)點[18]。納米PCR 技術是一種在PCR 反應中添加了納米金屬顆粒，能夠使PCR 反應更快地達到目標溫度，同時減少非特異擴增和提高反應的靈敏性[19]。隨著納米PCR 技術的發(fā)展，已經(jīng)有多種納米PCR 技術檢測動物病原體的研究報道[20-22]，而利用雙重納米PCR（nano-dPCR）技術同時檢測和鑒別H7 及N2 亞型AIV 的檢測技術尚未見有報道。本研究旨在建立一種同時檢測H7 亞型和N2 亞型AIV 的nano-dPCR 方法，為H7 和N2 亞型AIV 快速鑒別診斷和防控提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 納米PCR 試劑盒（NPK02）購自上海滬崢生物科技有限公司；DNA Marker、逆轉錄酶M-MLV、dNTP、2×PCR Mix 混合液、PMD18-T 連接載體和RNA 酶抑制劑均購自寶生物（北京）有限公司；RNA/DNA 核酸提取試劑盒、膠回收純化試劑盒、小量質粒提取試劑盒和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購均自北京全式金生物技術有限公司；其他相關試劑購自商業(yè)公司。

1.1.2 毒株來源 毒株H7N2、H14N5、H15N9 和H16N3 亞型AIV 的cDNA 模板由美國賓夕法尼亞州立大學惠贈；H5N1 亞型AIV 的cDNA 模板由美國康涅狄格州立大學惠贈；H1N1、H3N6、H6N6、H9N2、H9N6 亞型AIV、NDV、IBV、ILTV 和ChPV均由廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室保存；其他亞型AIV（H2N3、H4N3、H8N4、H10N3、H11N3、H12N5和H13N6）毒株或cDNA 模板均由香港大學惠贈。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 在GenBank 中分別搜索不同宿主和地區(qū)來源的N2 亞型AIV NA 基因和H7 亞型AIV HA 基因的核苷酸序列并以FASTA格式下載，將整理好的上述序列運用DNAStar 軟件進行比較和分析。根據(jù)分析結果，采用Primer 7.0和Oligo 6.0 軟件分別設計HA 基因和NA 基因針對性的特異引物，然后通過BLAST 對所設引物進行在線驗證。特異性引物序列如表1 所示，上述引物均由捷尼斯生物公司合成。

1.2.2 病毒核酸的提取 嚴格參照核酸提取試劑盒的使用說明書對所用到的AIV、NDV、IBV、ILTV 和CHPV 的DNA/RNA 進行抽提，DNA/RNA 模板用DEPC 水溶解。RNA 模板參照反轉錄酶說明書合成cDNA（反轉錄引物為9 堿基隨機引物），DNA 模板直接保存，所有模板制備完成后均置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 nano-dPCR 反應體系及條件的優(yōu)化 初步確定nano-dPCR 方法的PCR 反應體系總體積為25 μL：2×Nano-PCR buffer 12.5 μL，Taq DNApolymerase（5 U/μL）0.8 μL，所用引物的工作濃度均為25 pmol/μL，將引物分為0.1～1.0 μL 10 個不同梯度分別組成對應的多個不同引物濃度組合，依次分別加入反應體系中進行不同引物組合濃度的優(yōu)化篩選，相同濃度的模板cDNA 各加入1 μL，最后用超純水將反應總體積補足至25 μL；初步反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃30 s，30 個循環(huán)；然后72 ℃延伸5 min 結束反應。根據(jù)同一PCR 條件下（體系、反應時間和模板量相同）相同上樣量PCR 產物電泳條帶的強弱，選擇同一泳道中2 個條帶最亮的引物組合作為最佳引物濃度組合（同時兼顧nano-dPCR 靈敏度和特異性）。進一步對反應體系的退火溫度（46～53 ℃）進行優(yōu)化，最終根據(jù)凝膠結果確定nano-dPCR 方法的最佳反應條件體系。

1.2.4 特異性試驗 按照優(yōu)化好的nano-dPCR 最佳反應條件體系，選擇不同禽流感亞型及常見禽病病原體H1N1、H2N3、H3N6、H4N6、H5N1、H6N6、H7N2、H7N9、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H11N3、H12N5、H13N6、H14N5、H15N9、H16N3、NDV、IBV、ILTV 和ChPV 進行檢測方法的特異性驗證，用ddH2O 做陰性對照。同時對PCR 擴增出的目的片段進行純化回收，快速連接至PMD18-T載體并轉化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中進行基因克隆，PCR 鑒定后挑選陽性單克隆菌液送測序公司進行測序，驗證產物的特異性。

1.2.5 質粒標準品的制備 質粒的制備參照文獻[23]的方法，用特定全長基因引物分別擴增N2 亞型AIV NA 基因及H7 亞型AIV HA 基因，分別將上述基因片段PCR 產物克隆到PMD18-T 載體中，挑選PCR 鑒定陽性的單克隆菌液送測序公司進行測序驗證。將測序驗證正確的分別含有N2 亞型AIV NA 基因和H7 亞型AIV 的HA 基因的2 個重組質粒分別命名為N2-T 和H7-T，用小量質粒抽提試劑盒分別提取擴大培養(yǎng)含有質粒的陽性菌液，獲得的質粒用超微量紫外可見光分光度計分別進行核酸濃度測定。根據(jù)核酸測定結果計算其對應的質粒模板拷貝數(shù)，將N2-T 和H7-T 質粒進行等拷貝數(shù)混合。將混合好的質粒進行10 倍倍比稀釋，最終得到2 種質粒DNA 濃度均為6×109～6×101拷貝/μL 的標準品。

1.2.6 敏感性試驗 運用所建立的H7 和N2 亞型禽流感病毒雙重普通PCR（dPCR）和nano-dPCR檢測方法對上述所制備濃度6×109～6×101拷貝/μL的標準樣品進行特異性擴增，并根據(jù)擴增產物電泳結果確定2 種方法的敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測 對廣西地區(qū)不同活禽市場隨機采集的130 份家禽咽喉及泄殖腔拭子樣品進行處理，運用建立的nano-dPCR 檢測方法對處理后的樣品進行檢測鑒定。為驗證nano-dPCR 檢測方法的準確性，同時將同管剩余樣品接種SPF 雞胚進行病毒分離，并對病毒分離陽性的樣品擴增HA和NA 基因全長。最終將nano-dPCR 陽性產物和雞胚分離病毒鑒定PCR 陽性產物全部送測序公司進行測序，并根據(jù)測結果驗證nano-dPCR 檢測結果的準確性。

2 結果與分析

2.1 H7亞型和N2亞型AIV nano-dPCR 方法的建立

通過nano-dPCR 方法分別對H7 亞型AIV 和N2 亞型AIV 的目的基因進行擴增，電泳檢測結果表明分別獲得723、314 bp 的目的基因片段（圖1），產物片段大小與預期相符。

2.2 H7 亞型和N2 亞型AIV nano-dPCR 檢測方法最佳退火溫度和反應條件的確定

nano-dPCR 經(jīng)退火溫度（46～53 ℃）優(yōu)化，電泳結果如圖2 所示。

從圖2 可以看出，選擇48 ℃ 作為nano-dPCR檢測方法最佳退火溫度。對不同梯度引物組合篩選的最終結果表明，H7 亞型和N2 亞型最佳引物組合（同時保證nano-dPCR 擴增的靈敏度和特異性）為：H7 1.0 μL 和N2 0.8 μL（引物濃度25 pmol/μL，反應體系為25 μL）。最終確定nano-dPCR 方法最佳反應體系包括：2×Nano-PCR buffer 12.5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.8 μL，模板cDNA 2 μL，引物H7-F 和H7-R（25 pmol/μL）分別為1.0 μL、引物N2-F 和N2-R（25 pmol/μL）分別為0.8 μL，最后用ddH2O 補足25 μL。

2.3 特異性試驗

特異性試驗結果表明，所建立nano-dPCR 檢測方法的特異性良好。該方法對H7N2 亞型AIV分別擴增出723、314 bp 這2 條特異性條帶；對H7N9 亞型AIV 即H7Ny（N1-N9，y≠2）亞型AIV僅擴增出723 bp 1 條特異性條帶；對H9N2 亞型AIV 即HxN2（H1-H16，x≠7）亞型AIV 僅擴增出1 條314 bp 的特異性條帶，同時nano-dPCR 對其他常見的禽病病原體以及其他不同亞型AIV 的擴增均未出現(xiàn)目的條帶（圖3）。

2.4 敏感性試驗

H7 亞型和N2 亞型AIV nano-dPCR（A）和dPCR（B）敏感性試驗結果如圖4 所示。

從圖4 可以看出，用ddH2O 對初始濃度分別為6×109、6×109 拷貝/μL 的H7-T 和N2-T 混合質粒標準品進行10 倍倍比稀釋，對稀釋后樣品用超微量紫外可見光分光度計進行測定驗證其濃度，然后用nano-dPCR 和dPCR 同時檢測不同稀釋度的質粒標準品。敏感性試驗結果表明，nano-dPCR 可檢測質粒標準品的最低拷貝數(shù)分別為6×103、6×103 拷貝/μL，而dPCR 方法對相同模板檢測的最低拷貝數(shù)分別為6×104、6×104 拷貝/μL。結果表明，nano-dPCR 檢測方法的敏感性比dPCR 檢測方法高10 倍。

2.5 臨床樣品檢測

應用nano-dPCR 方法對廣西不同活禽市場采集的130 份家禽（包含雞30 份、鴨80 份和鵝20 份）棉拭子樣品檢測，結果顯示，H7 亞型AIV 陽性率為0.77%（1/130），N2 亞型AIV 陽性率為20.77%（27/130），未有H7N2 混合AIV 陽性。nano-dPCR陰性樣品中其他亞型AIV 陽性率為7.69%（10/130，分離鑒定與測序結果）（表2）。所有nano-dPCR陽性產物測序分析結果顯示，723 bp 產物均為H7亞型AIV HA 基因特異性片段，314 bp 產物均為N2 亞型AIV NA 基因特異片段。nano-dPCR 方法與雞胚分離方法結果完全一致，HA 基因和NA 基因全長基因測序結果與nano-dPCR 方法的檢測結果也完全一致。上述結果表明，所建立的nano-dPCR方法可以應用于對H7 亞型和N2 亞型AIV 臨床樣品的監(jiān)測和鑒別診斷。

3 結論與討論

A 型流感病毒自然宿主為野生水禽，還可以感染各種家禽、哺乳動物以及人類，呈季節(jié)性流行，也能引起大流行[24]。研究表明，H5、H7 和H9 亞型AIV 引起的AI 是目前對家禽養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴重的3 種亞型[25-26]。近年來，家禽中HPAI 和LPAI H7病毒的暴發(fā)已導致全球超過7 000 萬家禽的死亡，不僅暴發(fā)的亞型多，而且波及的國家和地區(qū)范圍較廣，包括歐洲的德國、荷蘭、愛爾蘭、意大利等及美洲的美國、加拿大和智利等[27]。中國于2003 年首次分離到H7N2 亞型AIV，此后于2014 年2 月在人感染H7N9 AIV 患者家中的雞群中分離到由H7N9和H9N2 亞型AIV 重組形成的低致病性H7N2 亞型AIV[28]。2017 年初我國出現(xiàn)了感染人的高致病性H7N9 亞型AIV 后，2018 年又在福建省的鴨群中陸續(xù)出現(xiàn)高致病性鴨源H7N2 亞型AIV，對雞鴨的致死率均達到100%[29]，足見H7 亞型AIV 已經(jīng)在全球范圍內流行，造成了嚴重的經(jīng)濟損失，還對人類公共衛(wèi)生安全造成了嚴重的威脅[30]，應加強對H7N2 亞型AIV 的持續(xù)監(jiān)測。

多重PCR 反應受多種因素影響，本研究在引物設計時充分平衡各種影響多重PCR 的因素，同時設計了7 對不同的引物，通過分析引物的特異性及二聚體等，然后將引物進行多個引物組合的篩選優(yōu)化，最終選擇一套最佳的引物對組合進行nanodPCR擴增。同時檢測H7 亞型和N2 亞型AIVnano-dPCR 與普通雙重PCR 的敏感性對比結果表明，nano-dPCR 敏感性比普通雙重PCR 高出10 倍，nano-dPCR 反應時間也比普通dPCR 縮短15 min以上。此外，nano-dPCR 臨床樣品檢測結果也表明其準確率達到100%。付琦媛等[31]建立了鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株雙重納米RT-PCR檢測方法，李連燕[32]建立了犬巴貝斯蟲和犬埃立克體雙重納米PCR 方法，其檢測敏感度均比普通dPCR 高出100 倍。本研究所建立的nano-dPCR 檢測方法的敏感性只有上述方法敏感性的10%，這可能與不同亞型禽流感病毒HA 和NA 基因差異較小，導致設計引物的特異性與擴增效率之間較難平衡等有關。nano-dPCR 與傳統(tǒng)的AIV 檢測鑒定方法相比，具有操作簡便、高效省時和特異性強等優(yōu)勢，能快速檢測和區(qū)分H7 和N2 亞型AIV 的特異性片段，不使用實時熒光定量PCR 儀等昂貴儀器，適宜在基層養(yǎng)殖企業(yè)和單位推廣，為H7 和N2 亞型AIV 快速鑒別診斷和預防奠定技術基礎。

本研究成功建立的同時檢測H7 和N2 亞型AIV 雙重納米PCR 方法，應用所建立的nano-dPCR對活禽市場所采集的臨床樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，家禽中N2 亞型AIV（包括H9N2、H3N2、H6N2 和H4N2等亞型）感染較高，但較少發(fā)現(xiàn)H7 亞型AIV 陽性，表明近年H7 亞型AI 防控取得了很好的效果。另外，本研究中未檢測出H7 亞型AIV 和N2 亞型AIV 的混合感染現(xiàn)象也表明目前廣西地區(qū)未出現(xiàn)H7N2 亞型AIV 的流行情況。