摘要：黃芪（Astragalus membranaceus）是膜莢黃芪和蒙古黃芪的干燥根，根部受病原菌侵染會(huì)導(dǎo)致根腐病發(fā)生，根腐病會(huì)嚴(yán)重影響黃芪的藥用價(jià)值及其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。黃酮和皂苷類(lèi)物質(zhì)屬于黃芪的次級(jí)代謝物，也是黃芪的主要藥用成分。為了明確黃芪根腐病致病菌類(lèi)型以及黃芪黃酮和皂苷對(duì)病原菌的抑制作用，為防治該致病菌引起的根腐病以及研究黃芪次級(jí)代謝物參與黃芪抗病奠定基礎(chǔ)，從山西省渾源縣取回黃芪病株進(jìn)行病原菌的分離鑒定，并研究黃芪根部總黃酮和總皂苷對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制作用；通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、ITS 序列分析和致病性鑒定，明確黃芪根腐病病原菌為腐皮鐮刀菌HYFS-1。結(jié)果表明，30% 的無(wú)水乙醇對(duì)腐皮鐮刀菌菌落生長(zhǎng)無(wú)影響，可作為總黃酮和總皂苷的稀釋液；當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL 時(shí)，對(duì)菌落生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，平均抑制率為16.42%；當(dāng)總皂苷質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，對(duì)菌落生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，平均抑制率高達(dá)85.42%。

關(guān)鍵詞：黃芪根腐??；腐皮鐮刀菌；總黃酮；總皂苷；抑制作用

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.67 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002?2481（2023）06?0690?06

黃芪是豆科多年生草本藥用植物，黃芪根腐病的發(fā)生會(huì)嚴(yán)重影響其藥用價(jià)值。目前報(bào)道的黃芪根腐病病原菌主要有立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）、芬芳鐮刀菌（Fusarium redolens）、鏈格孢菌（Alternariasp）、逗號(hào)鐮刀菌（Fusarium virguliforme）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）等，而各個(gè)地區(qū)的主要病原菌也隨著地區(qū)不同而有差異[1-8]。雖然分離到的黃芪根腐病病原菌有很多，但由于植物病原菌的長(zhǎng)期互作，會(huì)導(dǎo)致病原菌的致病能力發(fā)生變異，所以需要不斷地進(jìn)行致病菌的分離與鑒定。

據(jù)報(bào)道，黃酮類(lèi)和皂苷類(lèi)化合物對(duì)于細(xì)菌有很好的抑制作用，黃芪中的皂甙已被證明能抑制致病菌金黃色葡萄球菌和枯草桿菌等的生長(zhǎng)[9]，苦蕎麩皮黃酮提取物能抑制致病菌大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等的生長(zhǎng)[10]。此外，皂苷類(lèi)化合物對(duì)于真菌也有一定的抑制作用，人參莖葉總皂苷對(duì)人參根腐病病原菌腐皮鐮刀菌的生長(zhǎng)有很好的抑制作用[11]。而有關(guān)黃芪有效成分如黃酮類(lèi)和皂苷類(lèi)化合物對(duì)于黃芪根腐病致病菌生長(zhǎng)的抑制未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究擬從黃芪病株中分離根腐病病原菌，通過(guò)形態(tài)觀察和分子鑒定明確病原菌類(lèi)型，通過(guò)接種鑒定明確病原菌對(duì)黃芪的致病作用；提取黃芪根部總黃酮和總皂苷，通過(guò)平板培養(yǎng)來(lái)明確其對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制作用，旨在明確黃芪有效成分在抑制病原菌中的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

病原菌分離所用的黃芪病株在2021 年取自于山西大同渾源縣；致病性鑒定所用材料為蒙古黃芪；根部總皂苷和總黃酮的提取用的是2～3 年生的黃芪植株。

1.2 病原菌的分離與純化

病原菌的分離與純化采用的是組織分離法[3]，其中0.1% HgCl2 被0.1% NaClO 替代，其余方法不變。挑取菌絲末端進(jìn)行純化培養(yǎng)。分離純化所使用的培養(yǎng)基是北京索萊寶科技有限公司的PDA 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為27 ℃的黑暗環(huán)境。

1.3 病原菌的形態(tài)觀察

在純化過(guò)的真菌平板邊緣取6 mm 的菌餅放置到新的PDA 培養(yǎng)基上置于27 ℃ 的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，用于觀察菌落特征和分生孢子，分生孢子使用熒光顯微鏡（Leica DM6B）觀察。參照《真菌鑒定手冊(cè)》[12]對(duì)真菌進(jìn)行鑒定。

1.4 病原菌的分子鑒定

取培養(yǎng)5 d 的菌絲，利用生工生物Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒進(jìn)行DNA 提取，以DNA 為模板，以真菌鑒定引物ITS 4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS 5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表1），反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)后72 ℃終延伸10 min。用1% 的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。利用生工生物SK8131 膠回收試劑盒進(jìn)行PCR 產(chǎn)物回收，送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，利用MEGA 7.0 軟件鄰接法（Neighbor-Joining）（bootstrap 設(shè)為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 病原菌致病性鑒定

參考NIU 等[13]大豆根腐病下胚軸鑒定方法對(duì)黃芪4～5 葉期進(jìn)行子葉節(jié)下1 cm 根部接種病原菌6 mm 菌餅，25 ℃、100% 濕度下保濕2 d 后放到25 ℃16 h 光照/8 h 黑暗下生長(zhǎng)，每天觀察植株發(fā)病情況。

1.6 總黃酮和總皂苷的提取

分別用干燥的3 年生黃芪根部進(jìn)行總黃酮的提取和2 年生黃芪根部進(jìn)行總皂苷的提取，提取方法使用的是閃式提取法[14]?？傸S酮含量采用紫外分光光度法測(cè)定，以蘆丁為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；總皂苷含量利用香草醛-濃硫酸比色法測(cè)定，以黃芪甲苷為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 病原菌抑制試驗(yàn)

總黃酮抑制試驗(yàn)：提取出總黃酮后，用30% 的無(wú)水乙醇對(duì)其進(jìn)行稀釋?zhuān)♂屬|(zhì)量濃度分別0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mg/mL。分別在PDA 培養(yǎng)基上涂布1 mL 不同總黃酮溶液于超凈臺(tái)里吹干后在培養(yǎng)基中央接種6 mm 病原菌菌餅，每處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，置于27 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，每天測(cè)定其病菌生長(zhǎng)直徑，以涂1 mL 30% 無(wú)水乙醇為對(duì)照。

總皂苷抑制試驗(yàn)：提取出總皂苷后，用30% 的無(wú)水乙醇對(duì)其進(jìn)行稀釋?zhuān)♂屬|(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL。在PDA 培養(yǎng)基上涂布1 mL 不同濃度的總皂苷溶液在超凈臺(tái)里吹干后在培養(yǎng)基中央接種6 mm 的病原菌菌餅，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，置于27 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，每天測(cè)量其病菌生長(zhǎng)直徑，以涂1 mL 30% 的無(wú)水乙醇為對(duì)照。

菌落平均直徑（mm）=測(cè)量菌落平均值－菌餅直徑（6 mm） （1） 菌落生長(zhǎng)抑制率=1－處理菌落平均直徑/對(duì)照菌落平均直徑×100% （2） 平均抑制率=同一濃度每天抑制率之和/天數(shù)（3）1.8 數(shù)據(jù)分析利用SPSS 23軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較檢驗(yàn)，設(shè)置Plt;0.05為顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定及致病性鑒定

2.1.1 病原菌的分離及致病性鑒定 對(duì)黃芪病株進(jìn)行病原菌分離純化共獲得5 個(gè)真菌分離物，分別將5 株真菌分離物PDA 菌餅通過(guò)下胚軸接種法（圖1-A）于4～5 葉期蒙古黃芪進(jìn)行致病性鑒定，以接種空白PDA 菌餅為對(duì)照。結(jié)果表明，只有其中1 種真菌分離物接種黃芪2 d 后葉片開(kāi)始萎蔫直到植株枯萎（圖1-B），而空白對(duì)照（圖1-C）和其余4 株真菌分離物接種黃芪長(zhǎng)勢(shì)正常。在枯萎植株接種部位取樣約0.5 cm 進(jìn)行致病菌再分離，發(fā)現(xiàn)菌落的正面形態(tài)（圖1-D）和致病菌（圖2-A）形態(tài)一致，符合柯赫氏法則，說(shuō)明該真菌分離物為致病菌。

2.1.2 致病菌的形態(tài)學(xué)鑒定 致病菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 的菌落生長(zhǎng)直徑為17～20 mm，培養(yǎng)5 d 的菌落生長(zhǎng)直徑為41～53 mm，初期菌落背面和菌絲為白色，菌絲稀疏整體成絨毛狀（圖2-A），后期菌落背面為粉色且出現(xiàn)同心輪紋（圖2-B）。

大型分生孢子背部腹部?jī)蓚?cè)平行，兩端鈍圓向內(nèi)稍彎曲，內(nèi)部多見(jiàn)3 個(gè)隔膜（圖2-C）。小型分生孢子為卵型、腎型和橢圓型，多為無(wú)隔（圖2-D）。參考《真菌鑒定手冊(cè)》初步推斷該致病菌為腐皮鐮刀菌Fusarium solani。

2.1.3 致病菌的分子鑒定 以致病菌基因組DNA 為模板，利用鑒定真菌的核糖體通用引物ITS 4 和ITS 5 對(duì)致病菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖3 所示。

圖３ 結(jié)果顯示，該片段大小為568 bp，測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與腐皮鐮刀菌親緣關(guān)系較近（圖4）。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定確定該致病菌為腐皮鐮刀菌Fusarium solani，將其暫時(shí)命名為HYFS-1。

2.2 HYFS-1 生長(zhǎng)抑制作用研究

2.2.1 30% 無(wú)水乙醇對(duì)HYFS-1 生長(zhǎng)的影響 選取30% 無(wú)水乙醇稀釋總黃酮和總皂苷溶液，空白對(duì)照均為涂抹1 mL 的30% 無(wú)水乙醇。為證明30% 無(wú)水乙醇對(duì)HYFS-1 的影響，在研究黃酮抑制HYFS-1 的過(guò)程中加入1 個(gè)未做任何添加的PDA平板接菌對(duì)照（直接接菌），結(jié)果如表2 所示。

表2 結(jié)果顯示，直接接菌的菌落生長(zhǎng)與加30%無(wú)水乙醇相比沒(méi)有差異。說(shuō)明30% 無(wú)水乙醇可作為稀釋液，且在PDA 平板上添加1 mL 的30% 無(wú)水乙醇可作為對(duì)照。

2.2.2 不同濃度總黃酮對(duì)HYFS-1 生長(zhǎng)的影響 分別在涂布總黃酮質(zhì)量濃度為0、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mg/mL 的PDA 培養(yǎng)基中接種直徑為6 mm 的HYFS-1 菌餅，從第2 天開(kāi)始測(cè)量菌落直徑并對(duì)每天不同濃度下菌落直徑進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL 時(shí)菌落直徑顯著低于對(duì)照，開(kāi)始有抑制作用（Plt;0.05），且與質(zhì)量濃度gt;0.3 mg/mL 的處理沒(méi)有顯著差異（Pgt;0.05）（表2、圖5）。說(shuō)明總黃酮質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL是抑制腐皮鐮刀菌生長(zhǎng)的最低濃度，且該濃度下平均抑制率為16.42%。

2.2.3 不同濃度下總皂苷對(duì)HYFS-1 生長(zhǎng)的影響 分別在涂布質(zhì)量濃度為0、0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL 的PDA 培養(yǎng)基中接種直徑為6 mm 的HYFS-1 菌餅，從第2 天開(kāi)始測(cè)量菌落直徑并對(duì)每天不同濃度下菌落直徑進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示（表3、圖6），質(zhì)量濃度為0.25、0.5 mg/mL 時(shí)菌落直徑顯著低于對(duì)照（Plt;0.05）。當(dāng)總皂苷質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，對(duì)菌落生長(zhǎng)的平均抑制率較大，達(dá)到85.42%，說(shuō)明總皂苷濃度高時(shí)抑制作用較強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

黃芪根腐病是土傳病害，主要危害黃芪根部和莖基部[15]，一旦根部腐爛受損，就失去了藥用價(jià)值。

為深入解該病害，從山西渾源縣帶回病株進(jìn)行病原菌的分離，分離的病原菌腐皮鐮刀菌HYFS-1 菌落背面為白色至粉色，與山西渾源縣已報(bào)道的腐皮鐮刀菌菌落背面顏色為白色至土黃色[3]不一致，推測(cè)本研究分離的腐皮鐮刀菌為新的致病菌株，可能是由于腐皮鐮刀菌長(zhǎng)期與植物互作發(fā)生了變異，也可能是由于分離腐皮鐮刀菌的病株取自渾源縣不同的根腐病區(qū)。

植物在遭受病原菌等生物和非生物脅迫時(shí)，酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿和萜類(lèi)化合物等次級(jí)代謝物的生物合成能在植物抗逆中起重要作用[16-18]。黃芪干燥根中含有黃酮皂苷類(lèi)等有效成分，屬于天然的防御屏障，本研究在體外分別測(cè)定了黃芪根部總黃酮和總皂苷的抑菌率，結(jié)果表明總黃酮平均抑制率為16.42%，總皂苷平均抑制率高達(dá)85.42%，說(shuō)明與總黃酮相比，總皂苷在抑制腐皮鐮刀菌生長(zhǎng)中起主要作用。有研究學(xué)者利用人參莖葉總皂苷對(duì)人參根腐病致病菌腐皮鐮刀菌進(jìn)行抑制研究，結(jié)果表明，人參莖葉總皂苷質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，抑制率高達(dá)67.79%[11]?？傸S酮和總皂苷抑菌能力可能與它們自身抗病機(jī)理有關(guān)，黃酮類(lèi)物質(zhì)主要作為抗氧化劑在脅迫中保護(hù)植物免受脅迫過(guò)程中的氧化性損傷[19-20]，而皂苷類(lèi)物質(zhì)主要通過(guò)破壞真菌膜結(jié)構(gòu)進(jìn)而起到抗病作用[21]，能直接作用于病原菌。

人參莖葉總皂苷高濃度下能影響人參致病菌腐皮鐮刀菌細(xì)胞膜的透性[11]。有關(guān)本研究中總皂苷抑制腐皮鐮刀菌生長(zhǎng)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，總皂苷質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時(shí)開(kāi)始對(duì)腐皮鐮刀菌菌落生長(zhǎng)有明顯抑制作用、為0.5 mg/mL 時(shí)抑制作用更顯著，初步推測(cè)黃芪植株的抗性可能與植株中總皂苷的濃度相關(guān)。據(jù)報(bào)道，大豆和菜豆中可溶性色素的含量可以作為抗大豆菌核病的一種指標(biāo)[22-23]，且可溶性色素含量的測(cè)定已被用作基因定位研究中的表型指標(biāo)[24-25]?？傇碥漳芊褡鳛榭裹S芪根腐病的指標(biāo)有待進(jìn)一步研究。